張 奕 羅遠利 劉 當 曹 陽 冉海濤 楊 超

惡性腫瘤是世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題，也是我國人民最主要的死亡原因之一［1］。傳統(tǒng)的腫瘤治療方式包括手術、化療和放療［2］。紫杉醇（PTX）是一種微管穩(wěn)定劑，作為一線化療藥物主要用于治療乳腺癌等多種惡性腫瘤。近年來，光動力方法、光熱療法及聲動力療法（SDT）等非侵入性療法得到了臨床廣泛關注。其中SDT可以突破光激活的深度限制，在臨床應用上具有光動力療法無法比擬的優(yōu)勢［3］，是一種可靠的治療方式。本實驗以聚乳酸-羥基乙醇酸（PLGA）為載體，制備包裹全氟戊烷（PFP）、四對氯代苯基卟啉錳（MnTTP）及PTX的納米粒（PFP-MnTTPPTX@PLGA，以下簡稱FMP@P），并評估其體外光聲、超聲、磁共振多模態(tài)成像能力及其與SDT聯(lián)合化療腫瘤的效果。

材料與方法

一、主要實驗材料及儀器

1.實驗細胞：乳腺癌4T1細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）。

2.主要試劑：PLGA（PLGA-COOH聚合比50∶50，濟南岱罡生物科技有限公司）；聚乙烯醇（PVA，美國Sigma公司）；PFP（百靈威科技有限公司）；PTX（上海源葉生物科技有限公司）；MnTTP（上海麥克林生化科技有限公司）；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，上海碧云天生物技術有限公司）；2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA，美國Sigma公司）；CCK-8試劑盒、Annexin V FITC/PI（日本同仁化學研究所）。

3.主要儀器：聲振儀（VCX130，美國Sonic公司）；超聲理療儀（重慶海扶技術有限公司）；納米粒徑電位分析儀（Zetasizer Nano ZS90，英國Malvern儀器公司）；透射電子顯微鏡（Hitachi-7500，日本Hitachi公司）；紫外-可見光分光光度計（UV2600 UV-VIS，日本島津公司）；熒光分光光度計（RF-5301pc）和光聲成像系統(tǒng)（Vevo LAZR）均購自加拿大Visual Sonics公司；核磁共振掃描儀（Magnetom Skyra 3.0 T，德國Siemens公司）；彩色多普勒超聲診斷儀（MyLab 90，意大利百勝公司）；激光掃描共聚焦顯微鏡（日本Nikon公司）。

二、FMP@P納米粒的制備

首先稱取10 mg PTX溶解于200μl雙蒸水，加入200μl PFP，在冰浴下進行第一步乳化（功率100 W，總時長6 min，工作模式為開啟5 s，暫停5 s）得到水相。然后稱取50 mg PLGA、2 mg MnTTP溶于3 ml二氯甲烷得到油相，常溫振蕩使其完全溶解，將水相加入油相中，冰浴條件下使用聲振儀聲振3 min（功率65 W），再加入8 ml 4%PVA溶液聲振2 min（功率33 W），最后加入10 ml 2%異丙醇溶液。避光冰浴條件下低速攪拌3 h使二氯甲烷完全揮發(fā)。最后雙蒸水洗滌并低溫離心（10 000 g，4℃，5 min）2次后獲得FMP@P，于4℃條件下保存。其他納米粒如載PFP、MnTTP的PLGA納米粒（PFP-MnTTP-PLGA，以下簡稱FM@P）、載PFP、PTX的PLGA納米粒（PFP-PTX-PLGA，簡稱FP@P）等在制備過程中僅加入納米粒所含的藥物，制備方法同F(xiàn)MP@P。

三、FMP@P基本性能檢測

使用透射電鏡、掃描電鏡觀察納米粒的形態(tài)，納米粒徑電位分析儀檢測納米粒的粒徑及表面電位。以N，N-二甲基甲酰胺（DMF）為溶劑配制不同濃度（1、2、3、4、5μg/ml）的MnTTP-PTX溶液，使用紫外-可見光分光光度計檢測吸光度并繪制標準曲線，通過標準曲線計算其包封率。采用高效液相法測定PTX的包封率及超聲輻照后FMP@P的藥物釋放能力。使用單線態(tài)氧熒光探針（SOSG）檢測低功率聚焦超聲（3.0 W/cm2）輻照時間對MnTTP-PTX-PLGA（以下簡稱MP-PLGA）納米粒（5μg/ml）單態(tài)氧產(chǎn)量的影響。

四、體外超聲、光聲、磁共振成像實驗

1.體外超聲成像：以瓊脂糖凝膠為原料制作帶孔凝膠模型，將FMP@P溶液（2 mg/ml）置于5塊瓊脂凝膠模型中，使用低功率聚焦超聲（3.0 W/cm2）分別輻照1、2、3、4、5 min，然后使用超聲診斷儀的B模式和造影模式觀察并采集圖像（LZ-250探頭，頻率21 MHz；二維超聲增益18.0 dB，超聲造影增益35.0 dB）。

2.體外光聲成像：以瓊脂糖凝膠為原料制作帶孔凝膠模型，配制濃度分別為1、2、3、4、5 mg/ml的FMP@P溶液，各取100μl加入不同的凝膠孔內(nèi)，另取一孔加入100μl雙蒸水作為對照。應用光聲成像系統(tǒng)觀察其成像情況。

3.體外磁共振成像：配制濃度分別為1、2、3、4、5 mg/ml的FMP@P溶液置于EP管中，選用T1_FLAR序列（TR=200，TE=2.5）進行掃描，觀測其成像情況及信號強度。

五、體外活性氧檢測

將體外培養(yǎng)的對數(shù)期乳腺癌4T1細胞，以每孔1×105接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿及12孔板中，將細胞分為7組（以共聚焦顯微鏡觀察為例）：①FMP@P+US組，每 孔加入1 ml FMP@P溶液（2 mg/ml），培養(yǎng)4 h后，PBS洗滌3次，加入DCFH-DA溶劑在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，再用PBS洗滌3次，行低功率聚焦超聲（3.0 W/cm2）輻照1 min后，于共聚焦顯微鏡下觀察活性氧生成情況；②FM@P+US組，每孔加入1 ml FM@P（2 mg/ml），其余步驟同F(xiàn)MP@P+US組；③FP@P+US組，每孔加入1 ml FP@P（2 mg/ml），其 余 步驟同F(xiàn)MP@P+US組；④FP@P組，除不用超聲輻照外，其余步驟同F(xiàn)P@P+US組；⑤FM@P組，除不用超聲輻照外，其余步驟同F(xiàn)M@P+US組；⑥US組，除不加納米粒進行孵育外，其余步驟同F(xiàn)MP@P+US組；⑦對照組（control組），細胞孔板內(nèi)不加任何納米粒，亦不進行超聲輻照，DCFHDA染色后直接進行觀察。在12孔板中重復上述操作，并用胰酶消化細胞后離心，300μl PBS重懸細胞，使用流式細胞儀檢測各組產(chǎn)生活性氧水平。

六、體外聯(lián)合化療實驗

取對數(shù)期乳腺癌4T1細胞，以每孔1×104接種于96孔板內(nèi)，將細胞分為7組：①FMP@P+US組，在96孔板內(nèi)加入100μl FMP@P（2 mg/ml）孵育3 h后用PBS進行洗滌，然后使用低功率聚焦超聲（3.0 W/cm2）輻照1 min，30 min后加入CCK-8試劑（每孔10μl），孵育1 h后使用酶標儀檢測吸光度；②FM@P+US組，每孔加入100μl FM@P，其余步驟同F(xiàn)MP@P+US組；③FP@P+US組，每孔加入100μl FP@P，其余步驟同F(xiàn)MP@P+US組；④FP@P組，除不用超聲輻照外，其余步驟同F(xiàn)P@P+US組；⑤FM@P組，除不用超聲輻照外，其余步驟同F(xiàn)M@P+US組；⑥US組，除不加納米粒進行孵育外，其余步驟同F(xiàn)MP@P+US組；⑦對照組（control組），細胞孔板內(nèi)不加任何納米粒，亦不用超聲輻照，其余步驟同F(xiàn)MP@P+US組。然后以每孔1×105接種于12孔板內(nèi)，將CCK-8試劑替換為Annexin V FITC/PI（0.1%）重復各組上述操作，并用胰酶消化細胞后離心，300μl PBS重懸細胞，使用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

七、統(tǒng)計學處理

應用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，組間兩兩比較行t檢驗。相關性分析采用Origin的線性回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、FMP@P的基本表征

FMP@P乳液呈墨綠色，納米粒為均一的球形（圖1A、B）；平均粒徑為（323.1±68.3）nm，平均表面電位為（-14.5±8.3）mV。MnTTP-PTX在437 nm最大吸收波長處（圖1C），濃度與吸光度具有良好的線性關系，其 包封率 為（93.55±0.46）%。熒 光 探針測 得FMP@P隨超聲輻照時間延長其熒光強度增強，單態(tài)氧產(chǎn)量增加。高效液相法測得PTX的包封率為（81.23±6.93）%。藥物釋放實驗結(jié)果顯示FMP@P在超聲輻照后24 h PTX的累計釋放率為31.57%。

圖1 FMP@P的基本表征

二、體外光聲、超聲、磁共振多模態(tài)成像結(jié)果

體外超聲成像顯示，B模式及造影模式均可觀察到FMP@P增強顯像效果，回聲強度隨輻照時間的增加逐漸增強，分別為17.32、36.73、69.52、86.43、131.25 a.u.和6.45、17.35、28.38、52.56、93.78 a.u.。體外光聲成像顯示，光聲信號強度隨FMP@P濃度的增加而增強，分別為0.675、0.837、1.278、1.784、2.097 a.u.，兩者在690 nm波長處存在良好的線性關系。體外磁共振成像顯示，F(xiàn)MP@P具有增強T1-MR成像的能力，且磁共振信號強度與FMP@P濃度間存在良好的線性關系，隨著FMP@P濃度的增加，磁共振信號強度分別為371.91、422.59、452.02、553.50、787.55 a.u.。見圖2。

圖2 FMP@P的體外超聲、光聲、磁共振多模態(tài)成像

三、體外活性氧檢測

FMP@P+US組和FM@P+US組均有大量活性氧產(chǎn)生，且產(chǎn)生的量相當，其余各組無明顯活性氧產(chǎn)生（圖3）。

圖3 各組4T1細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)量的共聚焦顯微鏡圖

四、體外聯(lián)合化療效果

CCK-8檢查提示：US組、FM@P組、FP@P組、FM@P+US組、FP@P+US組、FMP@P+US組細胞存活率 分別為（95.62±11.13）%、（85.08±7.57）%、（65.40±14.67）%、（43.00±12.30）%、（61.04±9.52）%、（17.74±4.91）%；FMP@P+US組存活率最低，與其余各組比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。流式細胞術檢測結(jié)果與CCK-8相符。

討 論

化療是惡性腫瘤傳統(tǒng)治療方法之一，但常伴隨難以避免的毒副作用?；熉?lián)合新型治療方式有望提高腫瘤的治療效率［4］。SDT是一種新型無創(chuàng)的腫瘤治療方法，基于超聲波組織穿透性強，可以有效作用于深部腫瘤，較光動力療法、光熱療法等具有更廣闊的應用前景［5］。研究［3］表明，微/納米顆?？梢杂行岣逽DT效果，PLGA是經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的可生物降解聚合物，能夠形成穩(wěn)定的納米顆粒，在實驗研究中廣泛應用。光聲成像、磁共振成像是高靈敏度的技術，可以提供高對比度、高空間分辨率的圖像［6］；超聲成像是一種可指導SDT的無創(chuàng)實時成像技術［7-11］。本實驗通過制備FMP@P，旨在評估其體外光聲、超聲、磁共振多模態(tài)成像能力及其與SDT聯(lián)合化療腫瘤的效果。

本實驗采用雙乳化法成功制備FMP@P，其納米粒呈大小均一的球形。MnTTP為非水溶性聲敏劑，而制備成FMP@P后克服了其不溶于水的局限，并提高了生物相容性，可更好地遞送藥物。此外，本實驗利用超聲波輻照致使FMP@P納米粒核心的PFP發(fā)生液氣相變，納米粒膨脹直至破裂進而釋放內(nèi)部的藥物。體外藥物釋放實驗發(fā)現(xiàn)，當納米粒接受超聲輻照后，PTX的釋放率明顯增加，表明超聲波能夠激發(fā)FMP@P藥物的釋放。SOSG對單態(tài)氧具有高選擇性，與單態(tài)氧反應后由弱藍色熒光變?yōu)榫G色熒光（此特性為試劑本身具有的特征，綠色熒光僅能從波譜看出530 nm波長對應綠色熒光）；其與MP-PLGA的混合溶液隨著超聲輻照時間的延長，在530 nm波長處的吸收強度增加，表明MP-PLGA具有良好的單態(tài)氧生成能力及在SDT中的抗腫瘤潛力。

在體外超聲成像實驗中，F(xiàn)MP@P溶液隨著超聲輻照時間的增加，其回聲強度逐漸加強。分析其原因，超聲輻照后納米粒核心的PFP發(fā)生了液氣相轉(zhuǎn)變，納米微球變成了微米級的微氣泡，故能夠進行超聲成像，而在進一步膨脹后發(fā)生爆破，釋放藥物。卟啉及其衍生物的大π共軛結(jié)構使得其具有特殊的光、電等性能，具有良好的光吸收性能，能進行光聲成像［12］。在體外光聲成像實驗中，光聲信號強度隨FMP@P濃度增加呈線性增強，說明FMP@NPs具有良好的光聲成像性能。由于穩(wěn)定的螯合作用，金屬卟啉降低了可導致纖維化或神經(jīng)毒性的金屬轉(zhuǎn)移風險。Mn（Ⅱ）攜帶5個未配對電子，Gd（Ⅲ）攜帶7個未配對電子，通常用于T1加權MR造影成像［13］。體外磁共振成像實驗表明，F(xiàn)MP@P溶液的T1信號隨濃度的增加而增強，且呈良好的線性關系，證明了FMP@P作為磁共振造影劑的潛力。

DCFH-DA是一種氧化應激指示劑，本身無熒光，在進入細胞后可以與活性氧反應生成強熒光的2’，7’-二氯熒光素且熒光信號強度與活性氧水平成正比。本實驗結(jié)果顯示，PTX、PFP或超聲均只能導致少量的活性氧產(chǎn)生，而MnTPP經(jīng)超聲輻照后可以產(chǎn)生大量活性氧，表明其可作為聲敏劑進行SDT。為驗證SDT效果，本研究采用CCK-8法檢測7個分組乳腺癌細胞的存活率，結(jié)果顯示US組、FM@P組細胞存活率均在85%以上，表明單純超聲或FM@P對細胞基本無影響；FM@P+US組、FP@P組細胞存活率明顯下降，表明單純SDT或單純化療均有殺傷腫瘤細胞作用；FMP@P+US組細胞存活率最低，與其余各組比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。表明聯(lián)合化療對腫瘤細胞殺傷效果明顯高于單一治療，流式細胞術結(jié)果與CCK-8檢測結(jié)果相符。

綜上所述，本實驗成功制備了載MnTTP及PTX的多功能納米粒FMP@P，可用于體外超聲、光聲、磁共振成像，并具有良好的SDT聯(lián)合化療效果，為后期的體內(nèi)研究奠定的基礎。但本實驗僅探討了FMP@P在體外的相變能力，以及在固定功率下輻照不同時間的相變能力，未探索大功率條件下的相變情況。