謝關華，陸安霞，歐陽珂，孟慶，童華榮*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(宜賓學院 農林與食品工程學部，四川 宜賓，644000)

香氣是影響茶葉品質的一個重要屬性，主要由茶葉中的揮發(fā)性物質所決定[1-2]。揮發(fā)性物質的形成受多種因素的影響，如品種、生長環(huán)境、加工工藝等[3]。根據(jù)加工方式和品質特征的不同，茶葉可分為綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶、紅茶和黑茶六大類[4]，不同的茶類具有明顯不同的香氣特征。目前，國內外學者對此做了大量的研究，研究重點多集中在香氣化合物的鑒定和不同茶類香氣差異的分析上[5-6]。BALDERMANN等[7]對來自不同國家和地區(qū)的綠茶、烏龍茶和紅茶進行分析，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵程度的增加，揮發(fā)性化合物的含量隨之增加。WANG等[8]的研究表明，不同類型的茶葉其香氣組成和含量差異很大，可利用揮發(fā)性化合物的聚類分析對不同的茶葉進行分類。YE等[9]通過對生熟2種普洱茶的香氣化合物進行分析，指出甲氧酚類化合物和醇類衍生物可作為普洱生茶和熟茶的鑒別標記物。鑒于大多數(shù)研究所采用的樣品來自不同原料，難免會存在例如品種或生長環(huán)境等所帶來的干擾，對結果造成很大的影響。因此，本研究采用同一來源的梅占品種鮮葉加工六大茶類，通過氣相色譜質譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)技術對樣品中的揮發(fā)性化合物進行檢測，通過方差分析、主成分分析(principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)等化學計量學方法對GC-MS數(shù)據(jù)進行降維和篩選，找出區(qū)分不同茶類的標志性化合物，通過計算化合物氣味活性值(odor activity value，OAV)和香氣特征影響值(aroma character impact value，ACI)評價各揮發(fā)性化合物對成茶香氣的貢獻度，以此探究六大茶類香氣形成的差異，可為茶葉的定向加工與品質調控提供依據(jù)，更好地指導生產，充分發(fā)揮各茶類的風味優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶鮮葉：茶樹品種梅占(Camelliasinensisvar.Meizhan)在我國具有較大栽培面積，且具有產量高、制得成茶品質優(yōu)良的特點。但目前該品種主要用于加工烏龍茶，很少用于加工其他茶類，且鮮有關于該品種制得成茶香氣的報道，因此，本研究采用梅占品種一芽二葉鮮葉進行六大茶類的加工，鮮葉于2018年9月采自重慶市巴南區(qū)南潤茶廠。

試劑：C8～C23正構烷烴混合物(99%)，美國Supelco公司；癸酸乙酯(99%)，美國Sigma公司；正己醛(98%)、甲基戊烯酮(95%)、葉醇(98%)、乙基苯(99%)、γ-丁內酯(99%)、苯甲醛(99%)、己酸(98%)、(E,E)-2,4-庚二烯醛(98%)、苯甲醇(98%)、芳樟醇氧化物Ⅰ(97%)、芳樟醇(98%)、苯乙醇(98%)、乙酸芐酯(98%)、水楊酸甲酯(99%)、α-松油醇(98%)、癸醛(98%)、β-環(huán)檸檬醛(95%)、橙花醇(98%)、香葉醇(98%)、吲哚(99%)、(Z)-己酸-3-己烯酯(99%)、己酸己酯(98%)、β-石竹烯(90%)、丁酸苯乙酯(98%)、香葉基丙酮(98%)、十二醇(99%)、二氫獼猴桃內酯(98%)、(E)-橙花叔醇(95%)，日本TCI株式會社；NaCl(分析級)，成都科隆化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

QP2010Plus氣相色譜質譜聯(lián)用儀，日本島津公司；溶劑輔助風味蒸發(fā)(solvent assisted flavor evaporation，SAFE)裝置，日本桐山制作所；超純水發(fā)生器，美國Millipore公司；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵，上海邦西儀器科技有限公司；氮吹儀，天津恒奧科技發(fā)展有限公司；FB224電子分析天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

按照圖1的工藝流程進行樣品制備。

圖1 對照及六大茶類樣品制備流程圖Fig.1 Flow chart illustrating the different stages in the manufacture of six teas and control sample

1.3.2 SAFE提取茶樣揮發(fā)性成分

精確稱取9.000 g粉碎后的茶樣，置于100 mL具塞錐形瓶，分3次加入二氯甲烷進行萃?。旱?次加入40 mL萃取3 h，第2次加入30 mL萃取13 h，第3次加入30 mL萃取1 h，合并3次的提取液，過濾。將濾液轉移至SAFE裝置進行除雜，具體操作參照文獻[10]。萃取液經旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至2 mL左右，再用氮吹儀繼續(xù)濃縮至0.4 mL，封口后置于-40 ℃冰箱備用。

1.3.3 GC-MS分析

GC條件：色譜柱為DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)石英毛細管柱；進樣口溫度為250 ℃；柱箱升溫程序：初始溫度40 ℃，以5 ℃/min升至130 ℃，然后以10 ℃/min升至150 ℃，再以3 ℃/min升至180 ℃，保持1 min，最后以10 ℃/min升至260 ℃，保持3 min；載氣為氦氣(純度>99.999%)；流速1.0 mL/min；進樣量1.0 μL；進樣模式不分流，溶劑延遲4 min。

MS條件：電子離子源；能量70 eV；離子源溫度250 ℃；接口溫度250 ℃；質量掃描范圍：40～400m/z。

1.3.4 定性定量分析

定性方法：運用NIST8.LIB和NIST8 s.LIB標準譜庫對GC-MS質譜數(shù)據(jù)進行檢索，保留相似度大于80的化合物，參考LIAO等[11]的方法，利用正構烷烴(C8～C23)測量計算保留指數(shù)(retention index，RI)，結合文獻報道及標準品比對，對揮發(fā)性化合物進行定性。

定量方法：外標法定量，取一系列已知濃度梯度的香氣標準品，在相同的條件下檢測，取得標準曲線方程和回歸系數(shù)R2如表1所示。表中列出化合物的含量計算均用其對應標準曲線，未列出化合物含量采用癸酸乙酯的標準曲線進行計算。

表1 揮發(fā)性化合物標準曲線Table 1 Standard curves of volatile compounds detected in tea samples

1.3.5 OAV及ACI的計算

OAV為化合物濃度與文獻報道的水中香氣閾值的比值。ACI根據(jù)公式(1)計算：

(1)

式中：ACI，香氣特征影響值，%；Ci，香氣化合物i的濃度，μg/g；Ti，香氣化合物i的閾值，mg/kg；Oi，香氣化合物i的香氣活度值。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均重復3次，數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，P<0.05 認為存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 六大茶類揮發(fā)性化合物的GC-MS分析

由表2和圖2可知，對照樣品中檢測到揮發(fā)性化合物51種，綠茶中53種，白茶中64種，黃茶中69種，烏龍茶中74種，紅茶中64種，黑茶中58種，所有樣品共計檢測到132種揮發(fā)性化合物，其中醇類38種、酮類15種、醛類14種、酯類31種、酸類5種、碳氫類24種和其他類5種。隨著鮮葉加工成不同種類的成茶，揮發(fā)性化合物的種類和含量都有著不同程度的增加。白茶的揮發(fā)性化合物總量是最高的，其余依次是紅茶、黃茶、烏龍茶、綠茶、黑茶和對照。

表2 對照和六大茶類樣品中檢出揮發(fā)性化合物的含量 單位：μg/g

續(xù)表2

續(xù)表2

醇類是所有茶類中含量最高的一類化合物，尤以紅茶(83.38%)和白茶(72.96%)中醇類化合物的比例最高，其中苯甲醇的含量在茶葉加工過程中顯著增加，其在綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶、紅茶和黑茶中的含量分別為對照(0.86 μg/g)的3.01、70.46、8.14、6.13、56.79和1.91倍，二氫香芹醇為綠茶的特有成分，里哪醇為紅茶的特有成分，蓽澄茄油烯醇為黑茶的特有成分。苯乙醇和α-松油醇存在于發(fā)酵茶中，在對照和綠茶中均沒有檢測到。14種醛類化合物中，香茅醛僅在對照中檢測到，(E,E)-2,4-庚二烯醛只在烏龍茶中檢測到。C6和C9醇類和醛類是茶葉“清新”氣味的主要來源[3]，這類化合物如正己醛、正己醇、(Z)-6-壬烯-1-醇、(E,Z)-2,6-壬二烯醇等僅在白茶中檢測到。β-紫羅酮存在于所有樣品中，與對照相比，其在六類茶中的積累量均明顯增加，且存在顯著性差異，黃茶中的含量最高(0.97 μg/g)，分別為綠茶、白茶、烏龍茶、紅茶和黑茶的5.39、2.37、4.22、1.03和4.85倍，具有清新花香屬性的香葉基丙酮只在綠茶中檢測到。酯類化合物的種類僅次于醇類，且在白茶(20.52%)中的比例最高，其中水楊酸甲酯(57.39 μg/g)是白茶中含量最高的化合物，且為白茶的特有成分。對照和綠茶中均沒有檢測到酸類化合物，其余茶類中酸類化合物的含量也很低(0.11～2.75 μg/g)。碳氫類化合物中含量最高的物質為α-法呢烯，僅在黃茶(12.16 μg/g)、烏龍茶(17.9 μg/g)和紅茶(10.04 μg/g)中檢測到。其他類化合物中，吲哚存在于黑茶外的5種茶中，2-乙酰基吡咯僅在黃茶中檢測到。

殺青是綠茶加工過程中的關鍵工序，其能促進茶葉中類胡蘿卜素香氣前體和脂肪酸類香氣前體的降解，形成香葉基丙酮、(Z)-茉莉酮、橙花叔醇、庚醛、癸醛等芳香物質，促進綠茶香氣的形成[12-14]。白茶的關鍵加工工序是萎凋，萎凋過程伴隨著失水和緩慢氧化，糖苷類水解產生的苯乙醇、香葉醇、苯甲醇、芳樟醇及其氧化物、正己醛、2-己醇、水楊酸甲酯等主要的呈香物質顯著增加[8,15]。β-紫羅酮是對茶葉香氣起關鍵作用的一種類胡蘿卜素衍生物，不僅可以來源于發(fā)酵階段的酶促氧化，還可以由干燥階段的熱作用催化產生[13,16]。黃茶經歷了殺青、長時間悶黃和2次干燥過程，所有種類的揮發(fā)性化合物都有較高水平的積累量，其中庚醛、β-紫羅酮的含量遠高于其他茶類，而且還積累了一些含氮類揮發(fā)性化合物，如吲哚、2-乙?；量┖捅讲⑧邕颍敲览路磻漠a物[14]。烏龍茶的萎凋和搖青工藝是其香氣品質形成的關鍵，搖青過程持續(xù)的機械損傷增強了相關基因的表達，導致茉莉內酯的大量積累[17]。α-法呢烯和(E)-橙花叔醇都是以類胡蘿卜素為前體的香氣化合物，其含量的大量增加可能是由于日光萎凋過程中的光氧化促進了類胡蘿卜素的水解[18]。紅茶的加工過程涉及到多種揮發(fā)性化合物的形成途徑[19]，在揉捻和發(fā)酵階段，經機械破碎的葉片組織釋放水解酶類到細胞壁或胞腔中，揮發(fā)性化合物的形成通道被激活，產生關鍵揮發(fā)性成分，如：單萜醇(芳樟醇、氧化芳樟醇和香葉醇)、芳香醇(苯甲醇和苯乙醇)、β-紫羅酮和β-環(huán)檸檬醛等，促進紅茶香氣的形成[3,13]。與其他茶類相比，紅茶中的酸類化合物含量較高，這是由于醇類化合物的羥基不穩(wěn)定，易氧化成醛，進一步氧化成酸，這一現(xiàn)象在紅茶的發(fā)酵階段尤為普遍[20]。黑茶中的揮發(fā)性化合物含量是六大茶類中最低的，與對照相比，僅有小部分化合物含量增加，如香葉醇、β-環(huán)檸檬醛、十二醛和丁位癸內酯，其余化合物含量均下降或沒有顯著性變化，原因是在溫度、濕度、水分和氧氣的共同作用下，較長時間的渥堆過程使得一部分揮發(fā)性化合物發(fā)生了降解和氧化，導致其含量發(fā)生了顯著的下降[21]。

圖2 對照和六大茶類中各類別揮發(fā)性化合物的含量Fig.2 The contents of different chemical classes of volatile compounds in the control sample and six categories of teas

2.2 六大茶類32種共有揮發(fā)性化合物的聚類熱圖分析

與對照相比，不同的加工方式不僅導致各茶類特有成分的生成，而且共有成分的含量也發(fā)生了很大的變化。六大茶類共有成分32種，文獻報道為81種[14]，二者相同組分有17種，造成這一差異的原因可能有：(1)茶樹品種不同：其鮮葉內香氣前體的種類、含量及相關酶活性的差異導致成茶香氣化合物的差異[22-23]；(2)工藝參數(shù)的差異：雖都采用六大茶類的典型加工工藝進行茶葉的加工，但同類型加工工藝中如時間、溫度等參數(shù)不同仍會對成茶揮發(fā)性化合物造成很大的影響[24]；(3)提取方法的差異：不同的提取方法對揮發(fā)性化合物的提取率不同，且在提取過程中還可能存在揮發(fā)性化合物的損耗，導致最終結果的不同[25]。

對32種共有揮發(fā)性化合物進行聚類熱圖分析，如圖3所示，各茶類揮發(fā)性化合物之間的差異顯著，且32種共有成分被聚為四類。第一類包括2-己醇和羅勒烯，其在不發(fā)酵和部分發(fā)酵茶中的含量較高，顯著高于在全發(fā)酵的紅茶和黑茶中的含量。第二類包括苯乙酮、植酮、2,6-二甲基-1,7-辛二烯-3,6-二醇、癸醛、大根香葉烯D、十二醛、去氫白菖烯、甲基庚烯酮、1-十五醇、茉莉酸甲酯、肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸甲酯和硬脂酸甲酯。這些化合物在對照中的含量很低或沒有，說明主要是在加工過程中產生的，具有清香屬性的甲基庚烯酮在白茶和黃茶中的含量較高，具有花果香氣的癸醛和十二醛在黃茶和紅茶中的含量較高。茉莉酸甲酯作為半發(fā)酵茶中一種重要的脂肪酸衍生物[26]，具有茉莉樣香氣，在烏龍茶中有較高的積累量。第三類化合物包括苯甲醇、苯甲醛、芳樟醇

圖3 對照和六大茶類樣品中32種共有揮發(fā)性化合物的 聚類熱圖分析Fig.3 Hierarchical clustering analysis of the 32 common volatile compounds in the control sample and six categories of teas

及其氧化物、β-石竹烯、香葉醇、(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛和十二醇，單萜醇和芳香醇主要來源于糖苷類水解，其在紅茶和白茶中的含量顯著高于其他茶類，如香葉醇在白茶中的含量最高，分別是綠茶、黃茶、烏龍茶、紅茶和黑茶的6.29、1.56、4.80、1.35和14.13倍。第4類化合物包括(E)-橙花叔醇、植物醇、二氫芳樟醇、β-紫羅酮、丁位癸內酯和角鯊烯，具有甜花香屬性的(E)-橙花叔醇在紅茶和烏龍茶中的含量極為豐富，帶有花香屬性的β-紫羅酮和帶有果香屬性的丁位癸內酯在紅茶和黃茶中的含量顯著高于其他茶類。

2.3 六大茶類32種共有揮發(fā)性化合物的主成分分析

對六大茶類32種共有成分數(shù)據(jù)進行主成分分析，前3個主成分累計方差貢獻率達89%，可以基本代表所有變量信息。圖4-a為對照和6種茶在PC1和PC2上的得分圖，從圖中可以看出每種茶之間差異明顯，分離度和樣品間的重復性均較好。繪制32種共有成分在PC1 vs PC2、PC2 vs PC3和PC1 vs PC3上的載荷圖(圖4-b～圖4-d)。從圖中可以看出各物質與3個主成分的相關性，較高的載荷量表明其對主成分的影響較大。肉豆蔻酸異丙酯、丁位癸內酯、茉莉酸甲酯、角鯊烯、2,6-二甲基-1,7-辛二烯-3,6-二醇、香葉醇、β-紫羅酮、十二醇、甲基庚烯酮、芳樟醇氧化物Ⅲ在PC1上有較大載荷量，苯甲醇、羅勒烯、苯乙酮、2-己醇、苯甲醛、十二醛、硬酯酸甲酯、芳樟醇氧化物Ⅱ和(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛在PC2上有較大載荷量，植物醇、(E)-橙花叔醇、芳樟醇、芳樟醇氧化物Ⅰ、2-己醇在PC3上有較大載荷量，表示各個樣品在PC1、PC2、PC3上得分的差異主要由以上物質貢獻。

a-樣品在PC1和PC2上的得分圖；b-32種共有成分在PC1和PC2上的載荷圖；c-32種共有成分在PC2和PC3上的載荷圖； d-32種共有成分在PC1和PC3上的載荷圖圖4 對照和六大茶類中32種共有揮發(fā)性化合物的主成分分析圖Fig.4 PCA score and loading plot derived from 32 common volatile compounds of the control sample and six categories of teas注：圖中數(shù)字代表列于表2中的揮發(fā)性化合物編號

2.4 六大茶類32種共有揮發(fā)性化合物的正交偏最小二乘判別分析

利用正交偏最小二乘判別分析對六大茶類的32種共有揮發(fā)性化合物進行識別分析，計算出OPLS-DA變量重要性因子(variable important for the projection，VIP), 共篩選出10種化合物(VIP>1)，分別是羅勒烯(VIP:1.422 62)、硬脂酸甲酯(VIP:1.342 33)、(E)-橙花叔醇(VIP:1.253 54)、β-石竹烯(VIP:1.134 8)、植物醇(VIP:1.095 7)、甲基庚烯酮(VIP:1.080 5)、角鯊烯(VIP:1.067 42)、2-己醇(VIP:1.062 21)、植酮(VIP:1.056 88)、芳樟醇(VIP:1.050 38)和芳樟醇氧化物Ⅰ(VIP:1.000 71)，對茶葉的分類鑒別具有重要貢獻。

2.5 六大茶類活性香氣化合物的OAV和ACI分析

OAV值是化合物含量與其閾值之比，通常認為OAV>1的化合物對香氣有較大貢獻。ACI的提出用來表征香氣特征影響指數(shù)[27]，ACI值越大，說明該化合物對樣品香氣的貢獻程度越高。查閱文獻[11,28-31]計算出各樣品中化合物的 OAV和ACI值，如表3所示，OAV>1 的化合物共計32種。其中芳樟醇及其氧化物在所有樣品中的OAV值和ACI值都很高，說明其對各樣品香氣構成皆有著重要貢獻。此外，呈現(xiàn)花香的十二醛、β-石竹烯、β-紫羅酮等化合物雖然在各個樣品中的含量不高，但由于其閾值較低，所以其OAV值均大于1，也具有較高的香氣貢獻度。除對照和綠茶外，苯乙醇在其他5種茶中的含量均較高，但由于其較高的閾值，故僅在紅茶中苯乙醇的OAV>1。這充分說明了揮發(fā)性化合物含量的高低并不等同于其對香氣的貢獻程度[14]。

表3 樣品中關鍵化合物的OAV和ACI值Table 3 OAV and ACI of the key compounds responsible for the samples

綠茶中帶有青味、清花香屬性化合物的OAV值較高，如庚醛、癸醛、香葉基丙酮等，說明清花香屬性在綠茶中占主要優(yōu)勢。白茶中OAV值較高的化合物為具有清新氣味和甜花香的化合物，如正己醛、甲基庚烯酮、水楊酸甲酯、香葉醇等，被認為是新鮮白茶中的主要呈香物質[32-33]。黃茶中帶有青香、果香、花香的化合物皆有較高的OAV值，如庚醛、癸醛、十二醛和β-紫羅酮，說明黃茶中各香氣屬性較均衡。(E)-橙花叔醇、吲哚等具花香屬性的化合物在烏龍茶中的OAV值均較高，且ACI值遠大于在其他茶類中的，是烏龍茶中普遍存在的特征香氣化合物[7]。紅茶中具有典型花果香氣的苯甲醇、β-環(huán)檸檬醛、香葉醇、丁位癸內酯和具有紫羅蘭香氣的β-紫羅酮的OAV值均較高，多種香氣化合物協(xié)調作用，塑造紅茶的典型風味。黑茶中OAV和ACI值最高的化合物為呈現(xiàn)果香屬性的十二醛和丁位癸內酯，芳樟醇及其氧化物的ACI值相較其他茶類有明顯降低，癸醛、β-環(huán)檸檬醛等化合物在塑造黑茶的香型方面也起到關鍵作用。各類茶的香氣構成中優(yōu)勢化合物存在較大差異，導致各自具有明顯不同的香氣類型。

3 結論

在本研究中，由GC-MS分析結果可知，同一品種鮮葉加工成的六大茶類，因加工工藝不同，其揮發(fā)性化合物含量及組成存在較大差異。各茶類共有成分32種，綠茶特有成分5種，白茶13種，黃茶7種，烏龍茶10種，紅茶和黑茶各3種，結合OPLS-DA篩選出的羅勒烯、(E)-橙花叔醇、β-石竹烯等10種VIP>1的共有揮發(fā)性化合物，可作為區(qū)分各茶類的標志性化合物。

OAV和ACI分析表明，芳樟醇及其氧化物在對照和所有茶類中的OAV和ACI值均很高，說明其可能是該品種的特征屬性。綠茶和白茶為不發(fā)酵和輕發(fā)酵茶，化合物組成較相似，皆帶有一定清香屬性，但白茶甜香更顯；黃茶因經歷了較長時間的悶黃過程，香氣化合物積累更豐富，帶有青香、花香、果香化合物的OAV值均較高；烏龍茶萎凋和搖青階段導致帶有花香屬性的化合物大量積累，其在成茶中的OAV和ACI值均較高；紅茶發(fā)酵過程積累了大量香氣化合物，以花香和果香化合物占主要優(yōu)勢；黑茶渥堆過程導致大量帶有清新氣味化合物的水解，帶有果香屬性的化合物逐漸凸顯，在成茶中具有最高的ACI值，從而表現(xiàn)出明顯不同的香氣輪廓。

對茶葉整體香氣起主要貢獻作用的化合物大多屬于各類茶的共有成分，即主要香氣組分有很大的重合度，差別主要在于各類茶中占主要優(yōu)勢的關鍵香氣化合物比例不同，導致各自的香氣貢獻度不同，從而造成其香氣表型的差異。