余鴻飛，姜嬌,2，董琦楠，黃蓉，商華，葉冬青,4*，劉延琳,2*

1(西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌，712100)2(中國葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，寧夏 銀川，750021) 3(中糧長城葡萄酒(寧夏)有限公司，寧夏 永寧，750100) 4(廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西 南寧，530007)

針對目標(biāo)產(chǎn)物選育具有突出性狀的釀酒酵母是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)葡萄酒重要的基礎(chǔ)和關(guān)鍵[1]，其中乙醇和甘油分別為釀酒酵母乙醇發(fā)酵的主產(chǎn)物和主要副產(chǎn)物，是葡萄酒釀酒酵母選育最重要的性狀之一[2]，二者的產(chǎn)量常受酵母的生長及發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸的影響[3-4]。近年來對優(yōu)良釀酒酵母篩選的研究較為豐富，目前常用的方法仍為錐形瓶篩選，其設(shè)備要求簡便、操作難度低。然而隨著對優(yōu)良釀酒酵母需求的日益增加，錐形瓶篩選費時費力、成本較高等固有缺陷逐漸成為制約菌株篩選效率的一大瓶頸[5]。因此，亟需通過高通量篩選技術(shù)如微孔板(microtiter plates，MTP)培養(yǎng)、微規(guī)模生物反應(yīng)器，并行發(fā)酵系統(tǒng)等方式縮短菌株篩選時間[6-7]。

基于MTP的高通量篩選高效快速等特點，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞篩選領(lǐng)域。已有的研究表明，MTP與錐形瓶2種模型在細(xì)胞的培養(yǎng)、生長代謝檢測等方面具有高度一致性[8-9]，且基于MTP的全自動細(xì)胞篩選裝置的開發(fā)極大地提升了篩選效率，為傳統(tǒng)的基于錐形瓶發(fā)酵的檢測方法提供了一種互補(bǔ)性的篩選方案[10]。在酵母的相關(guān)研究中，基于MTP的試驗方法也開始引發(fā)研究者的關(guān)注。LICCIOLI等[11]證明釀酒酵母的MTP發(fā)酵與自身誘導(dǎo)的錐形瓶厭氧發(fā)酵在甘油與乙酸酯產(chǎn)量上具有一致性。程艷等[12]使用96孔板培養(yǎng)釀酒酵母菌株，并聯(lián)用HPLC檢測發(fā)酵液，成功篩選出低產(chǎn)尿素的釀酒酵母。與此同時，酵母的MTP篩選也暴露出一定問題，例如MTP發(fā)酵體積較小，實時監(jiān)控發(fā)酵難度更大[13]，且縮小的體系更易受外界環(huán)境影響，對實驗精度的要求更高[14]。已有的研究表明，靜置發(fā)酵過程中，溶氧會影響酵母的代謝路徑，最終會導(dǎo)致產(chǎn)物含量的巨大差異[15]，且MTP有限通氣的情況下釀酒酵母生長較慢，但有助于延緩酵母老化[16]，因此設(shè)計實驗方案時需加以慎重考慮。

基于上述原因，本研究選擇乙醇、甘油、殘?zhí)亲鳛獒劸平湍窶TP篩選條件的衡量指標(biāo)，通過與傳統(tǒng)錐形瓶靜置發(fā)酵進(jìn)行對比，首先探究了乙醇發(fā)酵產(chǎn)物MTP篩選的最佳條件，隨后通過差異性檢驗、聚類分析及多因素方差分析探究了菌株、裝液量及覆膜情況對釀酒酵母相關(guān)性狀篩選的影響。為建立適用于釀酒酵母的快速篩選方法、推動本土微生物資源的開發(fā)與利用、加快產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 菌株

選取不同遺傳背景，發(fā)酵能力有差異的釀酒酵母單倍體N2、N3、N5、N7、N10、L9、L12及L13作為不同發(fā)酵能力的菌株代表，用以測定不同條件MTP篩選與錐形瓶篩選的差異。所選單倍體均源自西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院微生物種質(zhì)資源室。

1.2 試劑及儀器

MJX智能霉菌培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；Y15全自動葡萄酒檢測儀，西班牙Biosystems公司；生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；Elx800酶標(biāo)儀，美國BioTek公司；微孔板，美國Costar公司；SF-300微透氧封板膜、SF-501封板膜，北京BioTss公司；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司。

酵母基礎(chǔ)培養(yǎng)基(yeast extract protein dextrose，YEPD)[17]：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，固體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂。

MS300培養(yǎng)基：參照BELY等[18]的配方，調(diào)整含糖量為350 g/L，其中葡萄糖與果糖的質(zhì)量比為1∶1。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母種子液制備

取-80 ℃冰箱保藏的甘油管凍存菌株，于YEPD固體培養(yǎng)基上劃線，挑取形態(tài)整齊的單菌落轉(zhuǎn)接于50 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h制備種子液。對制備的種子液進(jìn)行血球板計數(shù)，以5×105cells/mL接種至不同發(fā)酵方案組使用的MS300模擬汁。

1.3.2 發(fā)酵方案

使用150 mL錐形瓶(erlenmeyer flask fermentation，EF)100 mL裝液量、24孔板2 mL及1 mL裝液量、48孔板0.5 mL裝液量及96孔板0.2 mL裝液量，進(jìn)行不同裝液量的MTP發(fā)酵試驗。由于不同溶氧濃度對乙醇發(fā)酵的終產(chǎn)物有重要的影響，實驗使用了2種不同氧氣通透性的MTP封板膜：其中SF-300密封膜為醫(yī)用透氣性微孔軟膜，可實現(xiàn)二氧化碳和氧氣的自由交換，阻止水蒸氣蒸發(fā)，發(fā)酵環(huán)境視為微透氧環(huán)境(microaerobic fermentation，MF)；而SF-501密封膜為非滲透性軟膜，不具有氣體通透性，可完全阻隔發(fā)酵過程中MTP內(nèi)外的物質(zhì)交換，其發(fā)酵環(huán)境視為嚴(yán)格厭氧(anaerobic fermentation，AF)。9組實驗處理均使用MS300模擬汁，于25 ℃條件下靜置發(fā)酵，每組3個生物學(xué)重復(fù)。

1.3.3 理化指標(biāo)檢測

待發(fā)酵液殘?zhí)呛拷跬Ｖ瓜陆禃r視為發(fā)酵停滯，取剩余發(fā)酵液12 000 r/min離心5 min取上清液，于-20 ℃冰箱凍存待檢。理化指標(biāo)檢測前使用蒸餾水將發(fā)酵液稀釋至目標(biāo)產(chǎn)物檢測范圍內(nèi)。使用3，5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)比色法進(jìn)行殘?zhí)菣z測[19]；參考杜青等[20]的方法，使用生物傳感分析儀對樣品進(jìn)行乙醇含量測定；使用Y15全自動葡萄酒分析儀及配套的甘油檢測試劑盒(GPO-POD法)進(jìn)行甘油含量檢測；參考WANG等[21]的方法使用HPLC進(jìn)行有機(jī)酸含量檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016進(jìn)行理化指標(biāo)的數(shù)據(jù)處理，使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行顯著性分析及多因素方差分析(P<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義)，使用R 3.5.0及Graphpad Prism 8.0繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵體系對釀酒酵母產(chǎn)乙醇和甘油性狀影響

首先以錐形瓶靜置組(EF-100)為參照，探究了不同的MTP篩選體系(MF-2MTP、MF-1MTP、MF-0.5MTP、MF-0.2MTP、AF-2MTP、AF-1MTP、AF-0.5MTP、AF-0.2MTP)對菌株乙醇發(fā)酵的影響。不同發(fā)酵體系對主要物質(zhì)(乙醇、甘油、殘?zhí)?產(chǎn)量具有極顯著的影響(圖1)，絕大部分MTP發(fā)酵條件與錐形瓶靜置篩選結(jié)果具有較大差異，且這一現(xiàn)象在不同菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中均普遍存在。綜合對比各菌株篩選結(jié)果可知，使用嚴(yán)格厭氧覆膜的實驗組(AF)與錐形瓶組(EF)在殘?zhí)?、乙醇、甘油含量上更為接近，且均與使用透氧性覆膜的實驗組(MF)具有較大差異。MF組發(fā)酵產(chǎn)物符合釀酒酵母的有氧發(fā)酵模式，其產(chǎn)物中的殘?zhí)呛鸵掖己扛停视秃扛?，該發(fā)酵方式的主要目的往往是收集酵母菌體。而在實際生產(chǎn)中則主要依靠釀酒酵母的厭氧發(fā)酵模式以產(chǎn)生乙醇，因此在酵母篩選過程中也需貼近實際應(yīng)用環(huán)境進(jìn)行篩選，使用與錐形瓶靜置發(fā)酵更為接近的AF組作為篩選條件更為適宜。若不考慮篩選條件對終產(chǎn)物的影響，采用未經(jīng)優(yōu)化的MTP篩選方案，其結(jié)果可能與傳統(tǒng)的錐形瓶靜置篩選具有很大出入，對后續(xù)研究造成影響。

A-乙醇；B-甘油；C-殘?zhí)菆D1 不同菌株發(fā)酵液中乙醇、甘油和殘?zhí)堑暮縁ig.1 Content of ethanol, glycerol l and sugar in the fermented broth produced/consumed by each strain

2.2 MTP替代錐形瓶篩選釀酒酵母產(chǎn)乙醇和甘油性狀效果的評估

為找出篩選效果與錐形瓶最為接近的MTP篩選條件，本研究首先將各組MTP發(fā)酵條件下不同菌株同一產(chǎn)物的含量視為一組數(shù)據(jù)，對其離散程度進(jìn)行了比較，并對其均值進(jìn)行差異性檢驗。隨后通過比較錐形瓶與最優(yōu)替代條件下不同產(chǎn)物的菌株排序，對該最優(yōu)條件的實際替代效果進(jìn)行評價。

綜合對比EF組與各MTP組篩選結(jié)果可知，EF-100組與AF-2MTP、AF-1MTP、AF-0.5MTP間在乙醇、甘油、乙酸的平均值間不存在顯著差異。其中AF-2MTP(24孔板，完全厭氧覆膜，2 mL裝液量)組的發(fā)酵產(chǎn)物含量及菌株間離散程度與EF-100組最為接近。對二者進(jìn)行不同產(chǎn)物的菌株排序，結(jié)果證明AF-2MTP具有在以產(chǎn)乙醇、甘油能力為目標(biāo)的釀酒酵母篩選中替代錐形瓶篩選的良好潛力(數(shù)據(jù)未列出)。但在本實驗條件下仍無法達(dá)到完美替代錐形瓶靜置篩選殘?zhí)羌耙宜岬男Ч?。同時由于乙酸產(chǎn)量較低，揮發(fā)性強(qiáng)，感官閾值低等特性，需根據(jù)其產(chǎn)物特征進(jìn)一步優(yōu)化篩選條件，提高檢測精度，方可應(yīng)用于以產(chǎn)乙酸能力為目標(biāo)的釀酒酵母篩選。

EF與AF組的乙醇含量顯著高于有氧發(fā)酵的MF組：AF-2MTP組乙醇平均值最高，為11.34%(體積分?jǐn)?shù))，MF-0.5MTP組乙醇平均值最低，為1.94%(體積分?jǐn)?shù))(圖2-A)。甘油產(chǎn)量與乙醇產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)：EF與AF組的甘油產(chǎn)量接近，均顯著低于MF組，且EF組與AF組內(nèi)菌株間差異較小，均小于MF組。MF-0.5MTP組甘油平均值最高，為26.42 g/L，AF-2MTP組甘油平均值最低，為9.43 g/L(圖2-B)。MF組殘?zhí)窍噍^于EF與AF組更低，發(fā)酵更為徹底。EF-100組殘?zhí)瞧骄底罡?，?5.11 g/L，MF-0.2MTP組殘?zhí)瞧骄底畹?，?7.41 g/L(圖2-C)。MF組部分菌株的殘?zhí)桥c其他菌株間均存在較大差異，這可能是有氧發(fā)酵過程中菌株間滲透壓耐受性差異所導(dǎo)致的。EF組乙酸產(chǎn)量低于MF組與大部分AF組，且EF組與AF組間差異較小，MF組間菌株差異較大。MF-0.5MTP組乙酸平均值最高，為7.58 g/L，EF-100組乙酸平均值最低，為0.95 g/L(圖2-D)。整體而言，MF組間發(fā)酵產(chǎn)物含量差異巨大，這可能與含氧量對釀酒酵母生長代謝的影響有關(guān)。根據(jù)譚俊[13]的研究，篩選過程中使用的MTP類型與裝液量會影響篩選體系的氣體交換速率，因此各MF組間含氧量可能存在一定差異，而釀酒酵母菌株在不同含氧量條件下的生長代謝水平差異顯著，并最終導(dǎo)致了MF組間巨大的代謝物差異。

A-乙醇；B-甘油；C-殘?zhí)牵籇-乙酸圖2 不同處理中乙醇、甘油、殘?zhí)呛鸵宜峋当容^Fig.2 Mean values of ethanol, glycerol, sugar and acetic acid in the fermented broth under different treatments注：不同小寫字母表示顯著(P<0.05)

大多數(shù)MTP組離散程度較錐形瓶組更大，體現(xiàn)出MTP篩選發(fā)酵液體積少，易受到外界影響的特點。這與周劍等[22]篩選高產(chǎn)Rakicidin B1的海洋小單孢菌時得出的結(jié)論具有一致性。因此基于MTP的菌株篩選更適合應(yīng)用于初篩階段，并通過優(yōu)化篩選條件，聯(lián)用高通量檢測設(shè)備，增加生物學(xué)重復(fù)數(shù)量等方式優(yōu)化篩選效果[23-24]。

2.3 影響終產(chǎn)物含量的主要因素探究

為探究微孔板篩選過程中的主要影響因素，即覆膜條件，裝液量和菌株特異性對發(fā)酵終產(chǎn)物的影響，使用R對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行聚類分析并繪制熱圖(圖3)。由聚類樹及色條分布情況可知，覆膜是影響聚類的最顯著因素，其次為不同裝液量，且二者較菌株特異性的影響更為明顯。MF組在發(fā)酵結(jié)果上極顯著區(qū)別于EF組和AF組，其發(fā)酵產(chǎn)物含有更低的殘?zhí)?、乙醇和更高的甘油、乙酸，發(fā)酵的狀況接近于有氧發(fā)酵。這表明使用MTP體系進(jìn)行釀酒酵母篩選時，應(yīng)慎重考慮覆膜對發(fā)酵結(jié)果的影響，以免遮蓋菌株特異性而造成結(jié)果差異。裝液量也會對發(fā)酵結(jié)果產(chǎn)生顯著影響，且隨著裝液量的減少系統(tǒng)的不穩(wěn)定性也隨之增大[25]。為了確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，可視具體情況增加生物學(xué)重復(fù)[24]。不難發(fā)現(xiàn)，乙醇和甘油產(chǎn)量間呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)，這與二者同為釀酒酵母碳代謝產(chǎn)物，在通路上存在底物競爭有關(guān)。隨著通氧量的加大，發(fā)酵結(jié)果的甘油產(chǎn)量顯著提高，同時伴隨著乙醇產(chǎn)量的下降，這與目前普遍的研究結(jié)果一致[26]。

由于發(fā)酵液中的有機(jī)酸也會隨乙醇發(fā)酵的進(jìn)行不斷積累，逐漸對釀酒酵母細(xì)胞產(chǎn)生脅迫[27]，影響其正常的生理活動，并最終影響終產(chǎn)物中乙醇和甘油的最大累積量。為更全面的探究覆膜、裝液量對乙醇發(fā)酵終產(chǎn)物的影響，我們還檢測了不同實驗組的主要有機(jī)酸含量，如圖3所示。終產(chǎn)物中檸檬酸，琥珀酸及乙酸含量與覆膜顯著相關(guān)：與EF組相比，AF組發(fā)酵結(jié)果的有機(jī)酸含量與EF組差異較小，除乙酸外其他有機(jī)酸不存在顯著差異；而MF組的檸檬酸，琥珀酸及乙酸含量均有所增加，而蘋果酸產(chǎn)量略有下降。由于檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸均為三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，這樣的結(jié)果差異或許是不同覆膜條件下糖酵解及三羧酸循環(huán)代謝、氧化還原平衡差異的直觀體現(xiàn)。高氧化還原電位下有氧呼吸途徑具有較強(qiáng)的活性，糖酵解及三羧酸循環(huán)途徑活躍，從而產(chǎn)生較多的還原型輔酶。在有氧條件下，累積的還原型輔酶可以通過甘油途徑及多種其他途徑重新氧化，從而造成了甘油及多種有機(jī)酸的產(chǎn)量增加[28]。此外，發(fā)酵液溶氧水平的升高也提升了釀酒酵母的綜合耐受能力，包括對有機(jī)酸毒性的耐受極限[27]，客觀上促進(jìn)了終產(chǎn)物有機(jī)酸含量的增加[29]。這一結(jié)果反映出MTP發(fā)酵的覆膜選擇對實驗結(jié)果的決定性作用，若使用MTP體系取代錐形瓶作為菌株篩選的主要方式，則須針對二者不同的通氧特性進(jìn)行覆膜優(yōu)化，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖3 終產(chǎn)物聚類分析Fig.3 Clustering analysis of the main final products

為探尋菌株、覆膜、裝液量之間可能存在相互作用，本研究還對三者進(jìn)行了多因素方差分析(表1)。結(jié)果表明殘?zhí)?、乙醇、蘋果酸及琥珀酸受菌株差異性的顯著影響；覆膜條件對除蘋果酸外的關(guān)鍵物質(zhì)影響顯著；裝液量對除殘?zhí)?、蘋果酸外的關(guān)鍵物質(zhì)均有顯著影響。此外菌株與覆膜在蘋果酸產(chǎn)量存在顯著交互作用，裝液量與覆膜在乙醇、甘油、檸檬酸、琥珀酸產(chǎn)量存在顯著交互作用，菌株與裝液量間不存在交互作用。該分析結(jié)果與熱圖呈現(xiàn)出一致的趨勢，即覆膜>裝液量>菌株特異性。

表1 菌株、覆膜、裝液量間多因素方差分析Table 1 Analysis of the association between strains, coating membranes, and culture volumes via MANOVA

3 結(jié)論與討論

本研究對8株菌株9種發(fā)酵體系的發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行綜合分析發(fā)現(xiàn)，乙醇發(fā)酵中不同發(fā)酵體系對主要物質(zhì)產(chǎn)量具有極顯著影響。主要影響因素排序為覆膜>裝液量>菌株。覆膜對乙醇發(fā)酵的殘?zhí)?、乙醇、甘油及部分有機(jī)酸產(chǎn)量均具有極顯著影響，裝液量對乙醇及甘油產(chǎn)量及部分有機(jī)酸具有顯著影響，菌株對乙醇及蘋果酸產(chǎn)量影響顯著。同時覆膜及裝液量間存在著一定的相關(guān)關(guān)系。以錐形瓶靜置發(fā)酵結(jié)果為參照和各組MTP發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行了兩兩比較，結(jié)果表明24孔板、完全厭氧覆膜、2 mL裝液量實驗組(AF-2MTP)在各個維度上與錐形瓶靜置實驗組(EF)均不存在顯著差異，且在應(yīng)用于乙醇及甘油產(chǎn)量篩選時效果良好。

優(yōu)化MTP發(fā)酵條件以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的錐形瓶發(fā)酵為高效進(jìn)行菌株篩選提供了新的思路，但其依然存在局限性。本實驗中優(yōu)化的方案可以較好滿足釀酒酵母在乙醇和甘油產(chǎn)量篩選方面的需求，但若要更深入的篩選其他發(fā)酵產(chǎn)物如殘?zhí)?、揮發(fā)酸、香氣物質(zhì)等，仍需進(jìn)行針對性的調(diào)整。