胡嘉惠，林益航，吳詩(shī)寅，魏家正，戴寧，陳靜

浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院（舟山 316022）

鮐魚(yú)（Pneumatophorus japonicus），鱸形目，鯖科，鮐屬，是中國(guó)東海與黃海海域的主要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)[1-2]。鮐魚(yú)體內(nèi)酶系發(fā)達(dá)，蛋白質(zhì)含量較高，因此它的冷藏保鮮期較短，容易在運(yùn)輸和銷(xiāo)售過(guò)程中發(fā)生腐敗變質(zhì)，產(chǎn)生惡臭味和腐敗臭味[3-4]。因此為后續(xù)加工的順利進(jìn)行，運(yùn)用各種保鮮手段延長(zhǎng)鮐魚(yú)的保鮮期至關(guān)重要。鮐魚(yú)的保藏技術(shù)主要以物理保鮮法，即低溫保鮮為主，但低溫條件并不能完全阻止魚(yú)肉的腐敗和有害微生物的繁殖。柵欄技術(shù)能夠通過(guò)多重保鮮方法的疊加，實(shí)現(xiàn)食品的保鮮和貯藏。因此在低溫保鮮的基礎(chǔ)上，適量添加具有抗氧化活性的植物保鮮劑，有利于實(shí)現(xiàn)低溫保鮮、抑菌、抗氧化的協(xié)同作用，維持食品的優(yōu)良品質(zhì)。

竹葉抗氧化物（AOB）是來(lái)自于竹葉中的黃酮類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)和酚酸類(lèi)化合物，能較好抑制多種食品致病菌[5-6]，可作為天然食品抗氧化劑在水產(chǎn)品、肉制品等食品中使用。研究表明，AOB處理后的冷卻羊肉能夠延長(zhǎng)保鮮時(shí)間5～7 d[7]。劉夢(mèng)等[8]研究發(fā)現(xiàn)相較于其他幾種天然抗氧化劑，AOB能有效減少150 ℃熱加工條件下的熟牛肉制品中的脂肪氧化。官愛(ài)艷等[9]研究表明AOB對(duì)鮮海鱸魚(yú)魚(yú)肉有保鮮作用，經(jīng)AOB浸泡處理的海鱸魚(yú)較對(duì)照組保鮮時(shí)間延長(zhǎng)4 d。

將可食性膜包裹在水產(chǎn)品上也能夠延長(zhǎng)水產(chǎn)品的保鮮期。如將魚(yú)鱗膠原蛋白、馬鈴薯淀粉和高良姜精油混合制備的可食性膜能抑制羅非魚(yú)魚(yú)肉的油脂氧化和微生物生長(zhǎng)，延長(zhǎng)魚(yú)肉的保鮮期[10]。趙厚菲[11]制備的基于肉桂醛和溶菌酶的復(fù)合涂膜顯著抑制美國(guó)紅魚(yú)在冷藏過(guò)程中細(xì)菌的生長(zhǎng)，延緩TVB-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)、TBA值、K值等指標(biāo)的增加速度，且將貨架期延長(zhǎng)5～10 d。

試驗(yàn)利用魚(yú)鱗膠原蛋白與竹葉抗氧化物制備具有一定抗張強(qiáng)度及穩(wěn)定性的可食性抑菌膜，以新鮮鮐魚(yú)魚(yú)片為原料，探究竹葉抗氧化物/膠原蛋白復(fù)合可食性抑菌膜對(duì)魚(yú)片的保鮮效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

膠原蛋白粉（武漢佰興生物科技有限公司）；磷酸鹽緩沖溶液（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（上海瑞永生物科技有限公司）；甘油（Ar，西隴科學(xué)股份有限公司）；竹葉抗氧化物（AOB，浙江圣氏生物科技有限公司）；瓊脂固體培養(yǎng)基（南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司）；三氯乙酸（TCA，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；丙二醛標(biāo)準(zhǔn)溶液（北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院）；氯仿（Ar，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

生鮮青占魚(yú)（舟山市國(guó)際水產(chǎn)城）。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌（浙江海洋大學(xué)食品實(shí)驗(yàn)室）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)控超聲波清洗器（KH-500DE，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)（DH-9626A，日本東京理化器械公司）；紫外分光光度計(jì)（UV-2802s，奧豪斯儀器上海有限公司）；半微量凱氏定氮儀（SKD-2000，上海沛歐分析儀器有限公司）；多頭磁力加熱攪拌器（HJ-6，國(guó)華常州儀器制造有限公司）；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；數(shù)顯均漿機(jī)（T18，上海書(shū)培實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（HPX-9082 MBE，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 竹葉提取物/膠原蛋白復(fù)合膜的制備

1.2.1.1 制備工藝流程圖

1.2.1.2 復(fù)合膜的詳細(xì)制取步驟

用50 mL、50 ℃的磷酸鹽緩沖溶液溶解12 g膠原蛋白粉。調(diào)節(jié)pH 7.5左右并加入適量甘油，于50 ℃恒溫水浴加熱，加入0.2%轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（按膠原蛋白質(zhì)量計(jì)）充分?jǐn)嚢?，攪拌后均勻加入竹葉提取物，配成的竹葉提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為膠原蛋白質(zhì)量的0，0.1%，0.5%，1.0%，3.0%和5.0%的溶液。處理好后靜置20 min，使其充分反應(yīng)。

用均漿機(jī)均質(zhì)10 min，并用超聲消泡10 min，處理后竹葉提取物/膠原蛋白混合液在聚乙烯模具中定量流延，成膜液冷卻后將其移入電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)中干燥，干燥溫度50 ℃，干燥時(shí)間8 h，干燥完畢后，冷卻即可揭膜。

圖1 竹葉提取物/膠原蛋白復(fù)合膜的制備工藝流程圖

1.2.2 鮐魚(yú)的復(fù)合涂膜保鮮

將鮐魚(yú)去頭、去尾、清除內(nèi)臟后清洗干凈，取魚(yú)刺骨兩側(cè)魚(yú)片，每片質(zhì)量（100±5）g，用去離子水洗凈，晾干。將魚(yú)片浸泡于不同濃度梯度的復(fù)合溶液，0.5 h后取出。于已滅菌的聚乙烯小袋內(nèi)密封，置于4℃冰箱保存。以未涂膜的魚(yú)片作為對(duì)照組，分別測(cè)定0～18 d（每隔3 d測(cè)定1次）中各樣品的鮮度指標(biāo)。

1.2.3 鮐魚(yú)的微生物學(xué)指標(biāo)測(cè)定

1.2.3.1 菌落總數(shù)的測(cè)定（TVC）

依據(jù)GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[12]，測(cè)定貯藏期0～18 d內(nèi)鮐魚(yú)的菌落總數(shù)。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（CFU）計(jì)。

1.2.3.2 抑菌性的測(cè)定

竹葉提取物復(fù)合膜的抑菌性利用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行測(cè)定。將膜用剪刀剪成直徑大小10 mm的小圓片，將其覆蓋在用待測(cè)菌菌懸液涂布均勻的瓊脂培養(yǎng)基的表面上。倒轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，在37 ℃下培養(yǎng)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，持續(xù)培養(yǎng)24 h。觀察竹葉提取物復(fù)合膜表面的菌體生長(zhǎng)狀況，同時(shí)記錄抑菌圈的直徑[13]。

1.2.4 鮐魚(yú)的鮮度指標(biāo)測(cè)定

1.2.4.1 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

按半微量蒸餾法測(cè)定[14]。由鹽酸體積的消耗量計(jì)算TVB-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.4.2 過(guò)氧化值（PV）的測(cè)定

依據(jù)GB 5009.227—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中過(guò)氧化值的測(cè)定》[15]測(cè)定貯藏期內(nèi)鮐魚(yú)魚(yú)肉的過(guò)氧化值（PV）。

1.2.4.3 硫代巴比妥酸值（TBA）的測(cè)定

參照GB/T 35252—2017《動(dòng)植物油脂 2-硫代巴比妥酸值的測(cè)定直接法》[16]測(cè)定產(chǎn)品中硫代巴比妥酸（TBA）的值。

1.2.4.4 感官評(píng)定

由食品與藥學(xué)院的50名受過(guò)專(zhuān)業(yè)訓(xùn)練的工作人員和學(xué)生組成5組評(píng)價(jià)小組，每組10人，分別對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組的鮐魚(yú)進(jìn)行感官分析。試驗(yàn)組是用竹葉提取物（從微生物學(xué)指標(biāo)測(cè)定中選取的最佳抑菌濃度）處理后的鮐魚(yú)片，對(duì)照組是沒(méi)有用竹葉提取物處理的鮐魚(yú)片，在相同條件下置于常溫下24 h所得。評(píng)價(jià)小組成員分別從色澤、氣味、總體可接受度3個(gè)指標(biāo)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，按表1的要求進(jìn)行評(píng)分，總分為100分，結(jié)果求均值。

表1 鮐魚(yú)感官評(píng)定表

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用3次平行試驗(yàn)結(jié)果的平均值，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，使用Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 鮐魚(yú)的微生物學(xué)指標(biāo)結(jié)果

2.1.1 竹葉抗氧化物對(duì)抑菌膜的抑菌性影響

由圖2可知：對(duì)照組膠原蛋白膜對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌無(wú)抑菌效果，而加入竹葉抗氧化物的膠原蛋白膜對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有抑制作用，且濃度越高，復(fù)合膜的抑菌作用越顯著（p＜0.05）。竹葉抗氧化物濃度增加到0.1%時(shí)，膜的抑菌性能開(kāi)始出現(xiàn)，并呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)，竹葉抗氧化物濃度上升至1.0%時(shí)，膜的抑菌性明顯增加。竹葉抗氧化物濃度3.0%時(shí)，此時(shí)與大腸桿菌相比，復(fù)合膜的抑菌性對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果更加顯著（p＜0.05）[6]。

圖2 添加不同濃度竹葉抗氧化物復(fù)合膜的抑菌性

2.1.2 鮐魚(yú)魚(yú)片菌落總數(shù)變化

菌落總數(shù)變化（TVC）可以較直觀地反映蛋白質(zhì)和氨基酸的分解與代謝情況。因此測(cè)定菌落總數(shù)能夠用于判定水產(chǎn)品腐敗程度。含有不同濃度（0，0.1%，0.5%，1.0%，3.0%和5.0%）AOB的可食性抑菌膜對(duì)冷藏鮐魚(yú)魚(yú)片中的菌落總數(shù)變化見(jiàn)圖3。

圖3 冷藏鮐魚(yú)魚(yú)片的菌落總數(shù)變化情況

魚(yú)肉原始菌落數(shù)為3.15 lg CFU/g，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，各組樣品的TVC均上升。與對(duì)照組相比，竹葉抗氧化物復(fù)合膜包覆的樣品菌落總數(shù)增長(zhǎng)速度較慢，這是由于膠原蛋白溶液包裹于魚(yú)片表面后形成一層薄膜，阻隔魚(yú)片與外界空氣的直接接觸，同時(shí)，竹葉抗氧化物中的黃酮類(lèi)物質(zhì)能通過(guò)抑制細(xì)菌新陳代謝所需的酶類(lèi)活性，達(dá)到抑菌目的[17]。

試驗(yàn)前3 d，各組樣品的TVC增長(zhǎng)速度平穩(wěn)。隨后魚(yú)體逐步進(jìn)入自溶階段，魚(yú)肉組織完整性被破壞后微生物開(kāi)始從表面侵入到組織內(nèi)部，各組樣品的菌落總數(shù)開(kāi)始出現(xiàn)不同幅度的增長(zhǎng)。Al-Daqal等[18]研究表明，水產(chǎn)品的菌落總數(shù)超過(guò)6 lg CFU/g即為不可食用狀態(tài)。試驗(yàn)第6天，空白對(duì)照組的菌落總數(shù)達(dá)6.74 lg CFU/g，試驗(yàn)第9天時(shí)，添加0.1%和0.5%竹葉抗氧化物的魚(yú)肉樣品的菌落總數(shù)大于6 lg CFU/g，超出可食用范圍；添加1%和3%竹葉抗氧化物的魚(yú)肉樣品在第12天超出可食用范圍；添加5%竹葉抗氧化物的魚(yú)肉樣品的可食用狀態(tài)一直保持到第18天，比對(duì)照組多保持9～12 d。

在相同貯藏時(shí)間下，各試驗(yàn)組的菌落總數(shù)顯著低于對(duì)照組（p＜0.05），在相同貯藏環(huán)境下，各試驗(yàn)組的保鮮期較對(duì)照組更長(zhǎng)，表明竹葉抗氧化物具有較強(qiáng)的抑菌作用，且抑菌效果隨著濃度升高而加強(qiáng)，該結(jié)論與張曉麗等[19]的研究結(jié)果相符合。

2.2 復(fù)合膜對(duì)鮐魚(yú)化學(xué)指標(biāo)的影響

2.2.1 TVB-N的變化

根據(jù)GB 2733—2015《鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》，總揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）≤20 mg/100 g的海水魚(yú)沒(méi)有發(fā)生腐敗現(xiàn)象。若海水魚(yú)TVB-N≤12 mg/100 g，則可歸類(lèi)為新鮮魚(yú)，若海水魚(yú)的TVB-N＞30 mg/100 g則不可食用。TVB-N可反映魚(yú)體的鮮度和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，魚(yú)體腐敗變質(zhì)時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)受到內(nèi)源性酶、內(nèi)部細(xì)菌和環(huán)境細(xì)菌的影響，分解為低級(jí)的胺類(lèi)物質(zhì)等，并且產(chǎn)生不愉快的氣味。7組鮐魚(yú)在為期18 d的貯藏過(guò)程中TVB-N數(shù)值的變化可由圖4反映。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，7組鮐魚(yú)的TVB-N在包裹AOB復(fù)合膠原蛋白薄膜組與未包裹AOB復(fù)合膠原蛋白薄膜組中均不斷增大。對(duì)照組在第3天時(shí)的TVB-N值達(dá)28.19 mg/100 g，說(shuō)明鮐魚(yú)已腐敗變質(zhì)，不可食用。以添加不同濃度的AOB膠原蛋白薄膜作為變量，就TVB-N值的變化而言，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組曲線上升速度顯然更低；比較不同AOB濃度下各試驗(yàn)組的變化情況，膠原蛋白薄膜中AOB濃度越高，鮐魚(yú)的TVB-N值增加速度越緩慢。添加5%的AOB時(shí)，鮐魚(yú)的TVB-N上升速度最緩慢，而且完全腐敗發(fā)生在第15天，此時(shí)TVB-N值為30.79 mg/100 g。由此可見(jiàn)，AOB添加量5%的復(fù)合膠原蛋白膜對(duì)鮐魚(yú)的保鮮起到良好作用。

圖4 冷藏鮐魚(yú)魚(yú)片的TVB-N在使用添加不同濃度竹葉抗氧化物復(fù)合膜下的變化情況

2.2.2 PV和TBA值的變化

2.2.2.1 PV值的變化

在18 d貯藏期內(nèi)，不同AOB添加量的膠原蛋白復(fù)合膜對(duì)鮐魚(yú)的過(guò)氧化值（PV）的測(cè)定數(shù)值如圖5所示。18 d貯藏過(guò)程中，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，包裹AOB復(fù)合膠原蛋白薄膜組與未包裹AOB復(fù)合膠原蛋白薄膜組的鮐魚(yú)的過(guò)氧化值不斷增大，初期變化平緩，后期增速加快，但包膜組的鮐魚(yú)的過(guò)氧化值升高幅度不同：0.1%＞0.5%＞1.0%＞3.0%＞5.0%。對(duì)照組在第18天時(shí)，其過(guò)氧化值為15.12，相比初始值而言增加20倍。同時(shí)，AOB濃度連續(xù)增大，鮐魚(yú)樣本的過(guò)氧化值顯著性差異（p＜0.05）一并增加，顯著性越大則越能說(shuō)明膜的抗氧化效果與AOB添加量相關(guān)，即AOB復(fù)合膠原蛋白薄膜對(duì)鮐魚(yú)的保鮮效果顯著，與甘釗生等[20]研究的復(fù)合魚(yú)鱗膠原蛋白膜的保鮮效果相吻合。

圖5 冷藏鮐魚(yú)魚(yú)片的PV在使用添加不同濃度竹葉抗氧化物復(fù)合膜下的變化情況

2.2.2.2 TBA值的變化

鮐魚(yú)由于含有多不飽和脂肪酸，故在貯藏過(guò)程中極易發(fā)生脂肪的氧化現(xiàn)象。18 d貯藏期內(nèi)，不同AOB添加量的膠原蛋白復(fù)合膜對(duì)鮐魚(yú)的TBA的測(cè)定數(shù)值如圖6所示。18 d貯藏過(guò)程中，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，包裹AOB復(fù)合膠原蛋白薄膜組與未包裹AOB復(fù)合膠原蛋白薄膜組的鮐魚(yú)的TBA值不斷增大，表示魚(yú)體的氧化過(guò)程持續(xù)不斷地發(fā)生，且魚(yú)體的氧化程度不斷加重。其中，AOB添加量5%時(shí)的TBA值的增長(zhǎng)最為緩慢，不包膜的對(duì)照組的TBA值增長(zhǎng)最迅速，且7組曲線的TBA值增長(zhǎng)速率曲線各不相同，說(shuō)明AOB復(fù)合膠原蛋白薄膜在延緩脂肪氧化方面起到一定作用，與龐彩霞[21]研究的AOB有清除自由基能力和良好保鮮效果的結(jié)論一致。由圖6可以看出：貯藏0，3，6，9，12，15和18 d時(shí)，添加5%的AOB復(fù)合膠原蛋白薄膜組的TBA值和對(duì)照組有顯著性差異（p＜0.05），且均顯著低于對(duì)照組，但均與AOB添加量3%無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。這主要是由于魚(yú)肉體內(nèi)的酶與環(huán)境中的微生物共同作用下，魚(yú)肉脂肪分解加速，氧化程度加劇，使魚(yú)肉變質(zhì)腐敗。而AOB復(fù)合膠原蛋白薄膜的良好抑菌保鮮效果抑制這種脂肪腐敗作用，以AOB添加量5%時(shí)的薄膜抑制脂肪氧化的效果最好。

圖6 冷藏鮐魚(yú)魚(yú)片的TBA在使用添加不同濃度竹葉抗氧化物膜下的變化情況

2.2.3 鮐魚(yú)的感官評(píng)定結(jié)果

感官評(píng)價(jià)是最直觀判斷鮐魚(yú)品質(zhì)的方法，鮐魚(yú)的感官評(píng)定結(jié)果如圖7所示。試驗(yàn)組在色澤、氣味和總體可接受度中的評(píng)分均高于對(duì)照組。第1周內(nèi)2組評(píng)分變化不大，這是由于初始階段細(xì)菌基數(shù)小、繁殖慢，對(duì)鮐魚(yú)品質(zhì)影響小，而從第9天開(kāi)始，差距逐漸顯現(xiàn)，試驗(yàn)組變化趨勢(shì)趨于平緩，較穩(wěn)定，這是由于竹葉抗氧化物具有抑菌性能，抑制腐敗菌大量繁殖，使細(xì)菌處在一個(gè)較為可控的范圍內(nèi)而對(duì)照組普遍前期變化小，后期變化大，這是由于細(xì)菌大量繁殖，腐敗進(jìn)程加劇，鮐魚(yú)鮮度急劇下降。從總體可以看出，經(jīng)竹葉抗氧化物處理后的鮐魚(yú)品質(zhì)更加穩(wěn)定，鮮度維持時(shí)間更長(zhǎng)，說(shuō)明竹葉抗氧化物膠原蛋白膜具有明顯抑菌作用。

圖7 竹葉抗氧化物復(fù)合膜對(duì)冷藏鮐魚(yú)魚(yú)片感官評(píng)定的影響

3 結(jié)論

在膠原蛋白涂膜中添加竹葉抗氧化物可有效增加涂膜的保鮮性能，以及其對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌效果，竹葉抗氧化物添加量5%時(shí)，其對(duì)膜的改良效果最佳。保鮮復(fù)合涂膜通過(guò)包覆在鮐魚(yú)表面可有效延緩其TVC增長(zhǎng)，延緩蛋白質(zhì)降解和魚(yú)體的脂肪氧化，對(duì)魚(yú)體中的微生物生長(zhǎng)繁殖有抑制作用，延緩魚(yú)體腐敗，延長(zhǎng)產(chǎn)品保藏時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果為水產(chǎn)品的保鮮提供一種有效方式。

在國(guó)內(nèi)外，利用抑菌蛋白膜防止水產(chǎn)品腐敗的案例不多，既是由于抑菌蛋白膜的成本高，相比于防腐劑制作工藝也更復(fù)雜，抑菌效果也不如化學(xué)防腐劑，如何研制出一種對(duì)人體無(wú)害、工藝簡(jiǎn)單、成本低廉且抑菌效果良好的天然防腐劑成為亟待解決的問(wèn)題。通過(guò)對(duì)竹葉抗氧化物抑菌蛋白膜的研究，為抑菌蛋白膜研制提供新思路，有望研制出一種多功能、多領(lǐng)域的抑菌蛋白膜。