楊闖，邢志超，李境藝，李帥，于靖輝，王俊玲

吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院（吉林 132101）

發(fā)芽糙米是一種具有全營(yíng)養(yǎng)概念及特殊營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的功能性主食或配料[1]。發(fā)芽糙米制備工藝研究是實(shí)現(xiàn)發(fā)芽糙米產(chǎn)業(yè)化的首要環(huán)節(jié)[2]。糙米酵素是以糙米為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，加入一定量的蜂蜜、玉米胚油，利用酵母菌發(fā)酵制得的[3]。經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，其中所含有的γ-氨基丁酸（GABA）等生理活性成分含量均顯著提高。

植酸，因其含有6個(gè)磷酸基團(tuán)，又被稱為肌醇六磷酸，是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，具有很強(qiáng)的金屬螯合能力，與金屬反應(yīng)容易產(chǎn)生不易溶解的鹽類[4]。植酸酶，是能將磷酸殘基從植酸上水解下來(lái)的一類酶的總稱[5]，廣泛存在于植物、微生物、動(dòng)物組織中，微生物中的細(xì)菌、酵母菌和霉菌都可以產(chǎn)生植酸酶[6]。植酸酶的使用可替代飼料中所添加的無(wú)機(jī)磷，從而可以緩解中國(guó)磷資源匱乏、磷供應(yīng)不足的局面，其社會(huì)效應(yīng)顯著[7]。

植酸酶和GABA是糙米酵素中的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)元素，因此，試驗(yàn)以發(fā)芽糙米為原料，利用酵母菌發(fā)酵制備糙米酵素，以植酸酶酶活力和γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度為指標(biāo)探究最佳發(fā)酵條件，為進(jìn)一步提高糙米酵素中的營(yíng)養(yǎng)成分及生產(chǎn)糙米酵素相關(guān)食品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯、糙米等（市售）；安琪活性干酵母（市售）；次氯酸鈉、氯化鈣、葡萄糖、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸銨、氯化鈉、γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品、碳酸鈉、四硼酸鈉、苯酚、乙醇、瓊脂、蔗糖、磷酸二氫鉀、植酸鈣、鉬酸銨、釩酸銨、硝酸、乙酸等（均為分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋（三洋電機(jī)株式會(huì)社）；SW-CJ-2FD凈化工作臺(tái)（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；UV-2700紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；AL204-IC電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；DK-V205三用恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；HZQ-F160A高低溫恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；DHG-9240A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；HC-100T多功能粉碎機(jī)（河城工貿(mào)有限公司）；GL-20G-Ⅱ高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 糙米的預(yù)處理

參照侯利娟等[8]的方法處理后，備用。

1.4 菌種的制備

將酵母菌接種到2%蔗糖溶液中，調(diào)節(jié)pH 4.5～5.0，于38 ℃水浴30 min，于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)過(guò)夜。第2天，將其接種至PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜。第3天，培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出菌落后，篩選出長(zhǎng)勢(shì)良好、活力旺盛、表面光滑有光澤的單菌落，接種于PDA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜即為可直接用于接種的酵母菌菌種。

1.5 植酸酶酶活力測(cè)定

無(wú)機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[9-10]：按需求精確稱取已烘至恒重的KH2PO4粉末，充分溶解，用容量瓶定容，制備成濃度50.0 mmol/L的KH2PO4溶液。將配制好的KH2PO4溶液按比例稀釋成25，12.5，6.25，3.125和1.5625 mmol/L不同梯度濃度。分別取0.1 mL不同梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，分別加入0.9 mL 0.25 mol/L的乙酸緩沖液，充分振蕩后，在37 ℃水浴鍋中放置5 min，依次加入2 mL 7.5 mmol/L的植酸鈣溶液，充分振蕩后，放置于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，向各個(gè)反應(yīng)體系中分別加入2 mL提前配制好的釩鉬終止液，充分混勻，在波長(zhǎng)415 nm處測(cè)定吸光度。繪制相應(yīng)的無(wú)機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酶活性單位（U）定義為在37 ℃的條件下，每分鐘從0.005 mol/L的植酸鈣溶液中釋放出1 nmol無(wú)機(jī)磷所需要的酶量為1個(gè)酶活單位。

樣品中植酸酶酶活力的測(cè)定[11]：將所制得的樣品離心，取其上清液，按照表1反應(yīng)順序進(jìn)行反應(yīng)，在波長(zhǎng)415 nm處測(cè)定吸光度。將所測(cè)定的吸光度代入到所制得的方程中，同時(shí)結(jié)合所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中無(wú)機(jī)磷濃度，進(jìn)而計(jì)算出樣品中植酸酶酶活力。

1.6 GABA的測(cè)定

1.6.1 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取GABA標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制成0，0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取1.0 mL不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于冰浴中，加入0.2 mL 1.0 mol/L碳酸鈉溶液，1.0 mL 0.01 mol/L四硼酸鈉緩沖液，終止反應(yīng)。加入1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的苯酚溶液，5.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5%的次氯酸鈉溶液，充分振蕩混勻后放置于沸水浴中反應(yīng)10 min，為防止試管破碎，先用流水冷卻后，放置于冰水浴中冷卻20 min。等待試管中的反應(yīng)體系出現(xiàn)藍(lán)綠色后加入2.0 mL 60%乙醇，充分振蕩混勻后在波長(zhǎng)640 nm處測(cè)定吸光度。繪制相應(yīng)的GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.2 樣品中GABA的測(cè)定

參考Berthelot比色法[12]，并做出一些改進(jìn)，從而對(duì)GABA質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定，將樣品離心，取其上清液，按照表2反應(yīng)順序進(jìn)行反應(yīng)，在波長(zhǎng)640 nm處測(cè)定吸光度。將所測(cè)定的吸光度代入到所制得的方程中，同時(shí)結(jié)合所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中GABA質(zhì)量濃度?？瞻坠苤胁缓珿ABA，操作同樣品管。

表2 GABA含量測(cè)定反應(yīng)流程

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以無(wú)機(jī)磷濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度作為縱坐標(biāo)，繪制相應(yīng)的無(wú)機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1），得到方程y=0.04x-0.0233，其相關(guān)系數(shù)R2=0.9974。

圖1 無(wú)機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

繪制GABA的標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖2），其中橫坐標(biāo)為GABA質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)為吸光度（A），得到方程y=1.6916x+0.0339，其相關(guān)系數(shù)R2=0.9959。

圖2 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 植酸酶單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 培養(yǎng)溫度對(duì)植酸酶的影響

從25 ℃開(kāi)始依次選取4個(gè)不同培養(yǎng)溫度，在糙米培養(yǎng)基中接種3%酵母菌種，在120 r/min條件下發(fā)酵6 h，每個(gè)條件做3次平行，分別測(cè)定其植酸酶酶活力。

分析圖3可得：植酸酶酶活力在25～35 ℃范圍內(nèi)逐漸增加，植酸酶酶活力的峰值點(diǎn)是溫度達(dá)到35 ℃時(shí)，此時(shí)的吸光度為0.216，植酸酶酶活力為19.98 U/mL。溫度高于35 ℃，植酸酶酶活力逐漸下降，適宜的溫度是增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化合成的必要條件，太高或者太低的溫度均會(huì)使酶活受到影響。所以正交試驗(yàn)選取培養(yǎng)溫度30，35和40 ℃這3個(gè)水平。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)植酸酶的影響

李海燕等[13]通過(guò)黑曲霉植酸酶發(fā)酵工藝優(yōu)化研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)植酸酶的最適發(fā)酵溫度為30 ℃，此時(shí)植酸酶酶活最高為19.02 U。若培養(yǎng)溫度與菌體的適宜溫度相差較大，都會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生影響。出現(xiàn)此種情況，主要是因?yàn)榫N不同造成的。

楊燕凌等[14]通過(guò)對(duì)Aspergullus nigerFZ41產(chǎn)植酸酶菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件的研究發(fā)現(xiàn)，從20 ℃開(kāi)始，依次遞增5 ℃的5個(gè)發(fā)酵條件中，植酸酶酶活在30℃時(shí)達(dá)到峰值，在20 ℃時(shí)達(dá)到最低，在25 ℃和35 ℃時(shí)都有所下降，因此得出最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。出現(xiàn)此種情況，推測(cè)原因可能是所使用菌種有所差異。

2.3.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)植酸酶的影響

從6 h開(kāi)始依次選取5個(gè)不同培養(yǎng)時(shí)間，在糙米培養(yǎng)基中接種3%酵母菌種，在30 ℃、120 r/min條件下分別發(fā)酵不同的時(shí)間，每個(gè)條件做3次平行，分別測(cè)定其植酸酶酶活力。

分析圖4可得：培養(yǎng)時(shí)間在6～8 h范圍內(nèi)，植酸酶酶活力隨著培養(yǎng)時(shí)間增加而增加。植酸酶酶活力在培養(yǎng)時(shí)間8 h時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)的吸光度為0.393，植酸酶酶活力為34.73 U/mL。培養(yǎng)時(shí)間大于8 h，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加而下降，分析其原因有可能是培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，培養(yǎng)條件越不適合于菌體生長(zhǎng)。另外產(chǎn)物的合成主要在酵母菌生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，酵母菌可能進(jìn)入衰亡期。因此正交試驗(yàn)中培養(yǎng)時(shí)間選取6，8和10 h這三水平。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)植酸酶的影響

何錫杲[15]研究不同發(fā)酵條件對(duì)植酸酶基因工程菌E-22產(chǎn)植酸酶的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種時(shí)間12～48 h時(shí)，所得植酸酶酶活力雖然有起伏但相差不大，接種時(shí)間36 h左右植酸酶酶活力最高。出現(xiàn)這種情況的原因推測(cè)是其所用菌種與試驗(yàn)不同，不同菌種的最適生長(zhǎng)條件不同，所以造成試驗(yàn)結(jié)果不同。

田運(yùn)佳[7]通過(guò)對(duì)植酸酶生產(chǎn)過(guò)程中主要影響因素的研究發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)時(shí)間16～24 h時(shí)，植酸酶酶活力呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，培養(yǎng)時(shí)間20 h時(shí)發(fā)酵液植酸酶酶活力達(dá)到峰值。

2.3.3 接種量對(duì)植酸酶的影響

在糙米培養(yǎng)基中接種5個(gè)不同接種量，將未接種菌種的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組。在30 ℃、120 r/min條件下發(fā)酵6 h，每個(gè)條件做3次平行，分別測(cè)定其植酸酶酶活力。

分析圖5可得：接種量0～4%范圍內(nèi)，植酸酶酶活力隨著接種量增加而增加。植酸酶酶活力達(dá)到峰值時(shí)的酵母菌接種量為4%，此時(shí)的吸光度為0.247，植酸酶酶活力為22.50 U/mL。隨著接種量繼續(xù)增加，植酸酶酶活力下降，分析其原因可能是隨著接種量增加，酵母菌的菌體密度增大，導(dǎo)致培養(yǎng)基濃度達(dá)不到適用于菌體生長(zhǎng)的最佳濃度，轉(zhuǎn)化效率降低，從而導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量降低。因此在正交試驗(yàn)中接種量選取3%，4%和5%這三水平。

圖5 接種量對(duì)植酸酶的影響

趙海霞等[16]通過(guò)植酸酶基因工程酵母PP-NP～m-8培養(yǎng)條件研究發(fā)現(xiàn)，接種量3%～5%時(shí)，酵母不僅生長(zhǎng)較好且接種量3%時(shí)培養(yǎng)液中酶含量最高，故接種量3%最佳。與試驗(yàn)結(jié)果不同，可能是使用菌種與其不同。

劉雙赫等[17]通過(guò)對(duì)醋糟固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)植酸酶工藝的研究發(fā)現(xiàn)：植酸酶酶活力隨接種量增加而增加，接種量4%時(shí)，酶活達(dá)到最大值，為2.4 U/mL，接種量大于4%后，酶活隨著接種量增加而降低，因此最佳接種量為4%。

2.4 GABA單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 培養(yǎng)溫度對(duì)GABA的影響

從25 ℃開(kāi)始依次選取4個(gè)不同的溫度條件，在糙米培養(yǎng)基中接種3%酵母菌種，在120 r/min條件下發(fā)酵6 h，每個(gè)條件做3次平行，分別測(cè)定其GABA質(zhì)量濃度。

分析圖6可得：培養(yǎng)溫度25～30 ℃時(shí)，GABA質(zhì)量濃度隨著溫度升高而增加。GABA產(chǎn)量最高時(shí)所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)溫度為30 ℃，此時(shí)的吸光度為0.611，GABA含量為0.341 mg/mL。之后隨著溫度升高，GABA含量開(kāi)始逐漸下降，太高或者太低的溫度都會(huì)使GABA含量受到影響。所以正交試驗(yàn)選取培養(yǎng)溫度25，30和35 ℃這3個(gè)水平。

圖6 培養(yǎng)溫度對(duì)GABA的影響

雷恒[18]在高產(chǎn)GABA的紅曲菌種選育及發(fā)酵工藝優(yōu)化研究中發(fā)現(xiàn)，在固態(tài)發(fā)酵條件下，GABA含量最高時(shí)，培養(yǎng)溫度為30 ℃。之后隨著溫度升高，GABA產(chǎn)量降低，溫度越高GABA產(chǎn)量下降越明顯。可能是高溫對(duì)微生物體內(nèi)生物活性物質(zhì)產(chǎn)生影響的緣故。

朱曉立等[19]在乳酸乳球菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA的條件優(yōu)化的研究中發(fā)現(xiàn)，乳酸乳桿菌在26，28，30，32，34和36 ℃培養(yǎng)溫度中，最佳培養(yǎng)溫度為30 ℃，GABA產(chǎn)量可達(dá)8.31 g/L。這表示GDA酶的適宜溫度為30℃，若培養(yǎng)溫度與GAD酶的適宜溫度相差較大，會(huì)導(dǎo)致GAD酶活力下降。

2.4.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)GABA的影響

在糙米培養(yǎng)基中接種3%酵母菌種，在30 ℃、120 r/min條件下發(fā)酵6，8，10，12和14 h，每個(gè)條件做3次平行，分別測(cè)定其GABA質(zhì)量濃度。

分析圖7可得：在一定范圍內(nèi)GABA質(zhì)量濃度隨培養(yǎng)時(shí)間增加而增加。培養(yǎng)時(shí)間8 h時(shí)，GABA質(zhì)量濃度達(dá)到最大值，此時(shí)的吸光度為0.494，植酸酶酶活力為0.272 mg/mL。隨著培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)增加，植酸酶酶活力下降，分析其原因可能是培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，培養(yǎng)條件越不適合于菌體生長(zhǎng)。另外產(chǎn)物的合成主要在酵母菌生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，酵母菌可能進(jìn)入衰亡期。因此正交試驗(yàn)中培養(yǎng)時(shí)間選取6，8和10 h這三水平。

圖7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)GABA的影響

上官文菲等[20]在響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵乳桿菌產(chǎn)GABA的培養(yǎng)條件研究中發(fā)現(xiàn)，乳桿菌菌種SD2112在48，60，72，84和96 h的發(fā)酵時(shí)間中，最佳發(fā)酵時(shí)間為72 h，發(fā)酵時(shí)間＞72 h后，GABA產(chǎn)量趨于平緩，可能是由于發(fā)酵后期菌體進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，需將培養(yǎng)基中的底物緩慢轉(zhuǎn)化。與試驗(yàn)結(jié)果不同，可能是因?yàn)榫N不同的影響。

2.4.3 接種量對(duì)GABA的影響

在糙米培養(yǎng)基中接種5個(gè)不同酵母菌種，將未接種菌種的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組。在30 ℃、120 r/min條件下發(fā)酵6 h，每個(gè)條件做3次平行，分別測(cè)定其GABA含量。

分析圖8可得：在接種量0～2%范圍內(nèi)，GABA質(zhì)量濃度隨著接種量增加而增加。GABA質(zhì)量濃度達(dá)到最大值時(shí)，對(duì)應(yīng)的接種量為2%，此時(shí)的吸光度為0.574，植酸酶酶活力為0.319 mg/mL。隨著接種量繼續(xù)增加，吸光度下降，分析其原因可能是隨著接種量增大，酵母菌大量繁殖，隨著發(fā)酵進(jìn)行，代謝合成受阻，發(fā)酵產(chǎn)物生成量逐漸減少。因此在正交試驗(yàn)中接種量選取1%，2%和3%這三水平。

圖8 接種量對(duì)GABA的影響

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.5.1 植酸酶正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)，其因素與水平如表3所示。

表3 因素水平表

由正交試驗(yàn)結(jié)果分析，RA＞RC＞RB，由此可得對(duì)植酸酶影響大小依次是：培養(yǎng)溫度＞接種量＞培養(yǎng)時(shí)間。最優(yōu)方案為A2B3C1，即在糙米培養(yǎng)基中接種3%酵母菌菌種，在35 ℃下培養(yǎng)10 h，此時(shí)植酸酶的吸光度為0.424，酶活力為37.28 U/mL。

表4 L9(33)正交試驗(yàn)結(jié)果

2.5.2 GABA正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)，其因素水平表如表5所示。

表5 因素水平表

由正交試驗(yàn)結(jié)果分析，RC＞RA＞RB，由此可得對(duì)GABA影響大小依次是：接種量＞培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)時(shí)間。最優(yōu)方案為A2B2C2，即在糙米培養(yǎng)基中接種2%酵母菌菌種，在30 ℃下培養(yǎng)8 h，GABA質(zhì)量濃度最高，為0.315 mg/mL，此時(shí)的吸光度為0.567。

表6 L9(33)正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

通過(guò)浸泡和厭氧處理的方法，促使糙米發(fā)芽，以提高糙米中植酸酶酶活力和GABA質(zhì)量濃度，利用酵母菌發(fā)酵制備糙米酵素。在試驗(yàn)過(guò)程中，重點(diǎn)研究不同培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和接種量對(duì)發(fā)酵中植酸酶酶活力和GABA質(zhì)量濃度的影響。

由正交試驗(yàn)可得：培養(yǎng)溫度35 ℃、培養(yǎng)時(shí)間10 h、接種量3%時(shí)，植酸酶活力最高，可達(dá)37.28 U/mL。培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)時(shí)間8 h、接種量2%時(shí)，GABA質(zhì)量濃度最高，可達(dá)0.315 mg/mL。