陳勝民，王國(guó)平，林志仁，袁峰

0 引言

高危型HPV持續(xù)感染，是引起宮頸鱗狀細(xì)胞癌的主要原因，有報(bào)道90%的女性一生中可能感染HPV，而10%女性發(fā)生持續(xù)性感染，僅1%的感染者最終轉(zhuǎn)變?yōu)閷m頸癌，這提示宮頸癌患者體內(nèi)可能存在免疫抑制微環(huán)境，無(wú)法全面有效清除HPV[1-2]。有研究報(bào)道PKCι蛋白激酶Cι（protein kinase Cι,PKCι）/Yes相關(guān)蛋白1（yes-associated protein 1,YAP1）參與腫瘤免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)，PKCι通過(guò)下游效應(yīng)因子YAP1促進(jìn)免疫抑制，而YAP1通過(guò)募集骨髓來(lái)源的抑制性細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）和CD8+T細(xì)胞促進(jìn)腫瘤的免疫抑制，導(dǎo)致細(xì)胞毒性T細(xì)胞低浸潤(rùn)，而自然殺傷（natural killer,NK）細(xì)胞浸潤(rùn)減少[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道PKCι/YAP1調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境，但未見(jiàn)PKCι/YAP1與HPV感染在宮頸癌局部免疫微環(huán)境中的作用報(bào)道[4]，因此，本研究檢測(cè)宮頸正常組織（normal cervical tissue,NCT）、低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesions,LSIL）、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial lesions,HSIL）及宮頸鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma,SCC）高危型HPV的感染率，PKCι、YAPl、CD4以及CD8的蛋白表達(dá)，分析各組患者HPV感染率、PKCι、YAP1、CD4以及CD8蛋白表達(dá)之間的差異及其相關(guān)性以及臨床病理特征，探討宮頸癌變的局部免疫微環(huán)境的變化，為研究宮頸癌發(fā)病機(jī)制及診治提供可能的策略。

1 資料與方法

1.1 資料

選擇中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院2013年1月—2015年1月全子宮術(shù)后NCT、LSIL、HSIL及SCC組織學(xué)標(biāo)本各80例，均未經(jīng)抗腫瘤治療，各組間年齡無(wú)明顯差異。所有病例及實(shí)驗(yàn)結(jié)果均經(jīng)高級(jí)病理醫(yī)師閱片確認(rèn)，其中NCT組為婦科腫瘤全子宮切除術(shù)后標(biāo)本。所有試劑（盒）均來(lái)自上海信裕公司，按操作說(shuō)明書進(jìn)行，本研究經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：2018-（倫審）-173，倫理委員會(huì)批準(zhǔn)免知情同意。

1.2 方法

各組患者的高危型HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、69型）感染采用在我院就診時(shí)檢測(cè)的結(jié)果，根據(jù)檢測(cè)報(bào)告結(jié)果計(jì)算各組病患高危型HPV的感染率。IHC二步法檢測(cè)4組組織中PKCι、YAP1、CD4、CD8蛋白表達(dá)水平，兔抗PKCι抗體（批號(hào)：BJ07176986）、兔抗YAP1抗體（批號(hào)：AI08203707）、兔抗CD4抗體（批號(hào)：AI01301602）和兔抗CD8抗體（批號(hào)：BJ05096373）均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。在光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比和著色強(qiáng)度判斷，由兩項(xiàng)計(jì)分相乘所得，0～1分為-，2～4分為+，5～8分為++，9～12分為+++。其中-為陰性組，+/++/+++為陽(yáng)性組。兩項(xiàng)計(jì)分分別為：根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比（即陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比）：<5%為0分；≥5%～25%為1分；≥25%～50%為2分；≥50%～75%為3分；≥75%～100%為4分；根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度：細(xì)胞無(wú)顯色為0分；淺棕黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分[5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0軟件處理，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)，采用n（%）表示，相關(guān)性分析采用Spearman分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組宮頸病變患者高危型HPV感染率及PKCι、YAP1、CD4、CD8陽(yáng)性率比較

320份組織均完成HPV mRNA測(cè)定，結(jié)果表明：在NCT、LSIL、HSIL及SCC組織中高危型HPV感染率逐漸升高，PKCι、YAP1陽(yáng)性率越高，CD4陽(yáng)性率越低，CD8陽(yáng)性率越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1、圖1。

圖1 PKCι(A)、YAP1(B)、CD4(C)及CD8(D)在SCC中的表達(dá)Figure 1 Expression of PKCι(A),YAP1(B),CD4(C) and CD8(D) in SCC tissues

表1 各組高危型HPV感染率以及PKCι、YAP1、CD4、CD8陽(yáng)性率比較 (n(%))Table 1 Comparison of HPV infection rate,PKCι,YAP1,CD4 and CD8 positive rates among groups (n(%))

2.2 宮頸病變嚴(yán)重程度與高危型HPV感染率、PKCι、YAP1、CD4以及CD8表達(dá)相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果表明，宮頸病變級(jí)別與高危型HPV感染（r=0.600,P=0.000）、PKCι（r=0.577,P=0.000）、YAP1（r=0.592,P=0.000）以及CD8陽(yáng)性（r=0.0401,P=0.000）表達(dá)均呈正相關(guān)，與CD4陽(yáng)性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.458,P=0.000）。

2.3 SCC患者HPV感染與PKCι、YAP1、CD4及CD8表達(dá)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果表明，在SCC中HPV感染與PKCι、YAP1以及CD8陽(yáng)性表達(dá)相互之間的均呈正相關(guān)（P<0.05），而CD4陽(yáng)性表達(dá)與HPV感染以及PKCι、YAP1、CD8陽(yáng)性表達(dá)相互之間均呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），見(jiàn)表2。

表2 SCC患者HPV感染、PKCι、YAP1、CD4及CD8表達(dá)相關(guān)性Table 2 Correlation among HPV infection,PKCι,YAP1,CD4 and CD8 expression in SCC patients

2.4 HPV、PKCι、YAP1、CD4及CD8與早期SCC臨床病理特征的關(guān)系

HPV感染、PKCι、YAP1以及CD8陽(yáng)性表達(dá)在SCC不同的分化程度以及有無(wú)脈管瘤栓之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表3。

表3 HPV感染以及各蛋白表達(dá)與早期SCC臨床病理特征的關(guān)系 (n)Table 3 Relation between HPV infection,proteins expression and clinicopathological features of early SCC (n)

3 討論

宮頸微環(huán)境免疫功能受陰道微生態(tài)系統(tǒng)、陰道黏膜免疫防御系統(tǒng)、局部微環(huán)境免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子調(diào)節(jié)。任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生異常，均有可能改變HPV感染引發(fā)宮頸上皮內(nèi)瘤變以及宮頸癌發(fā)生發(fā)展的自然演變[6]。免疫調(diào)節(jié)在HPV導(dǎo)致宮頸病變的過(guò)程中至關(guān)重要[7]。T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞均參加了機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，其中T淋巴細(xì)胞發(fā)揮主導(dǎo)作用。研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者的CD4+T細(xì)胞百分比和CD4+/CD8+明顯低于正常人群，提示宮頸局部細(xì)胞免疫與HPV的持續(xù)感染有著密切關(guān)系，持續(xù)的HPV感染破壞了宮頸局部細(xì)胞免疫微環(huán)境，CD4+和CD8+細(xì)胞平衡失調(diào)，導(dǎo)致宮頸病變的發(fā)生發(fā)展[8-11]。本研究中，NCT、LSIL、HSIL以及SCC組織中高危型HPV感染率逐漸升高，CD4陽(yáng)性表達(dá)率逐漸降低，CD4+與病變程度呈負(fù)相關(guān)，CD8陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，CD8+與病變程度呈正相關(guān)，而CD4與CD8陽(yáng)性表達(dá)率之間呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明宮頸癌患者HPV感染檢出率最高，且常伴有細(xì)胞免疫功能異常，它們?cè)诩膊〉陌l(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。

PKCι（又稱為PRKCΙ）是一種非典型PKC（aPKC包括ζ、ι/λ），aPKC通過(guò)調(diào)控多條信號(hào)通路在組織器官的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持、腫瘤發(fā)生發(fā)展、免疫應(yīng)答等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明PKCι信號(hào)抑制劑抑制兩種關(guān)鍵的致癌信號(hào)通路，由PKCι和KCζ驅(qū)動(dòng)，以顯著減少腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，抑制非典型PKC信號(hào)是治療腫瘤的一種很有前途的治療策略[12-13]。有研究表明，PKCι過(guò)表達(dá)塑造了腫瘤免疫抑制性微環(huán)境，導(dǎo)致S100、IL6/1b、CSF3、前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2（prostaglandin endoperoxide synthase2,PTGS2）及腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α,TNF-α）等細(xì)胞因子過(guò)表達(dá)，而NK細(xì)胞浸潤(rùn)減少。另有研究顯示，TNF-α具有抗癌和促癌雙向作用，它的抗腫瘤機(jī)制是多方面的，目前發(fā)現(xiàn)主要有誘導(dǎo)凋亡、影響腫瘤血管系統(tǒng)和增強(qiáng)宿主免疫力三個(gè)方面。在卵巢癌細(xì)胞中，TNF-α上調(diào)炎性細(xì)胞因子及趨化因子網(wǎng)絡(luò)，作用于卵巢癌微環(huán)境，影響腫瘤血管發(fā)展、癌細(xì)胞遷移等，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展及惡化[3-4]。有研究顯示PKCι通過(guò)YAP1促進(jìn)免疫抑制，YAP1是腫瘤進(jìn)展中的下游效應(yīng)因子，YAP1通過(guò)募集骨髓來(lái)源的抑制性細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞來(lái)促進(jìn)腫瘤的免疫抑制，導(dǎo)致細(xì)胞毒性T細(xì)胞低浸潤(rùn)，PKCι/YAP1調(diào)節(jié)為高致死性惡性腫瘤提供了一種治療策略[3,14]，見(jiàn)圖2。本研究結(jié)果表明：宮頸病變級(jí)別與高危型HPV感染率、PKCι和YAP1蛋白陽(yáng)性表達(dá)、CD8浸潤(rùn)陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)，與CD4浸潤(rùn)陽(yáng)性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；在SCC中HPV感染與PKCι、YAP1及CD8陽(yáng)性表達(dá)相互之間的均呈正相關(guān)，而CD4陽(yáng)性表達(dá)與HPV感染及PKCι、YAP1、CD8陽(yáng)性表達(dá)相互之間均呈負(fù)相關(guān)。本研究提示宮頸癌發(fā)生發(fā)展可能與HPV、PKCι和YAP1、CD4及CD8蛋白表達(dá)異常有關(guān)，同時(shí)可能存在協(xié)同作用。

圖2 PKCι/YAP1免疫調(diào)節(jié)示意圖Figure 2 Schematic of PKCι/YAP1 immunomodulation

綜上所述，宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與高危型HPV感染密切相關(guān)，同時(shí)伴隨PKCι、YAP1蛋白表達(dá)異常，造成局部免疫微環(huán)境失衡，為研究宮頸癌的發(fā)病機(jī)制以及診治提供可能的策略。