王康，楊春

0 引言

T1期食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,SCC）曾被認為是“早期”癌癥，大多數(shù)局限于黏膜固有層的T1期食管SCC通過內(nèi)鏡切除術可治愈，因為該階段淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風險非常低，然而，一部分T1期食管SCC患者在就診時就已出現(xiàn)全身性疾病，即使根治性手術也無法治愈，因此將T1期食管SCC統(tǒng)稱為淺表性食管SCC更為合理[1-2]?？紤]T1期食管SCC患者間存在較大的預后差異性，需尋找一種有價值的預后指標，以識別出在內(nèi)鏡下黏膜切除術（endoscopic mucosal resection,EMR）之后需要接受挽救治療的患者[3-4]，顯得很有必要。腫瘤出芽是指分離的單個癌細胞和細胞簇散布在腫瘤浸潤前沿，最初被認為是與結(jié)腸直腸腺癌侵襲性生物學行為密切相關的病理指標[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)在食管SCC中腫瘤出芽也同樣是一個非常有價值的預后指標[7]。然而，通常反映腫瘤侵襲性的病理特征一般更多見于進展期腫瘤患者的手術標本中[5]，腫瘤出芽在T1期的食管SCC中檢出率如何？腫瘤出芽與T1期食管SCC的生長方式及惡性程度之間有著怎樣的關系？基于以上疑問，本研究通過根治性手術切除的T1期食管SCC標本評估了腫瘤出芽的檢出率，以及腫瘤出芽與內(nèi)鏡分型、浸潤深度、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等臨床病理參數(shù)間的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2018年1月—2021年1月間南京市中醫(yī)院經(jīng)內(nèi)鏡活檢及術后病理證實的T1期食管SCC30例。其中男25例、女5例，年齡46～78歲，平均64.2歲。30例SCC中，腫瘤最大直徑0.8～4 cm，平均2.2 cm。高分化5例，中分化12例，低分化13例；腫瘤浸潤黏膜下層24例，腫瘤位于固有層6例；淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移13例且均為N1期，淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移17例；有脈管侵犯7例，無脈管侵犯23例；30例均未見神經(jīng)侵犯，且均未見遠處轉(zhuǎn)移。所有病例均具有詳實的內(nèi)鏡描述、內(nèi)鏡分型、大體及鏡檢病理資料，該研究排除了術前接受過新輔助治療的病例。

1.2 HE病理切片制備及免疫組織化學染色方法

首先按食管癌根治標本病理檢查規(guī)范進行取材，腫瘤組織塊的大小在15 mm×15 mm以內(nèi)，厚度2～5 mm，再將組織塊放入全自動組織脫水機中，經(jīng)過固定、透明、脫水、浸蠟等步驟，最后進行包埋切片，切片厚度3～5 μm，然后經(jīng)鋪片、貼片、烘片，最后進行蘇木素-伊紅染色（HE染色）制作成HE病理組織切片，待診斷醫(yī)師顯微鏡下觀察。

將制作好的石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水后進行免疫組織化學染色，具體采用免疫組織化學EnVision法，通過高壓鍋高溫抗原修復后在全自動免疫組織化學染色儀進行染色，具體步驟以儀器操作說明書為準。免疫組織化學標志物主要是S-100、CD34、D2-40、Ki67和EGFR。其中神經(jīng)束標志物為S-100；脈管內(nèi)皮標志物為CD34、D2-40；反映腫瘤細胞增殖指數(shù)的標志物為Ki67；EGFR與食管癌惡性程度成正相關[8-9]。

1.3 結(jié)果判斷

1.3.1 內(nèi)鏡分型 內(nèi)鏡下淺表食管癌（0型）分為息肉樣、非息肉樣及凹陷型。0～Ⅰ型病變?yōu)橄⑷鈽硬∽儯\表隆起型）；0～Ⅱ型病變?yōu)榉窍⑷鈽硬∽?，細分為?～ⅡA（輕微隆起型）、0～ⅡB（平坦型）、0～ⅡC（輕微凹陷型）；0～Ⅲ型病變?yōu)榘枷菪筒∽僛10]。

1.3.2 臨床分期 根據(jù)AJCC第八版食管癌分期系統(tǒng)[11]，對患者進行TNM及臨床分期。

1.3.3 腫瘤出芽計數(shù)與分級 日本癌癥協(xié)會結(jié)直腸癌推薦標準指出，要求通過顯微鏡20倍視野下觀察一個0.785 mm2面積下出芽數(shù)量，浸潤最前沿間質(zhì)內(nèi)單個孤立腫瘤細胞或≤5個腫瘤細胞組成的巢團浸潤稱為1灶，1級為0～4灶、2級為5～9灶、3級為≥10灶[12]。Shinto等[13]在20倍放大視野下觀察腫瘤出芽，并計數(shù)腫瘤出芽數(shù)目最多區(qū)域，根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果將腫瘤出芽分為低度（0～9灶）、高度（≥10灶），該研究顯示高度出芽與腫瘤惡性度高、預后差密切相關。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用統(tǒng)計軟件SPSS21.0進行數(shù)據(jù)分析，Microsoft Word用于生成表格。使用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 T1期食管SCC中腫瘤出芽計數(shù)與分級

通過觀察HE切片出芽檢出率為70%（21/30），經(jīng)EGFR標記后腫瘤出芽檢出率為80%（24/30），共檢出腫瘤出芽184灶，EGFR在食管SCC中普遍呈強表達，并著色于胞膜，能清晰勾畫出每個細胞的輪廓，見表1～2、圖1～2。

圖1 T1期食管鱗狀細胞癌組織腫瘤出芽分級Figure 1 Tumorbudding grade in T1 stage equamous cell carcinoma tissues

表1 T1期食管鱗狀細胞癌組織腫瘤出芽分級與出芽計數(shù)Table 1 Tumor budding grade and tumor budding count in T1 stage equamous cell carcinoma tissues

表2 EGFR標記前后T1期食管鱗狀細胞癌組織腫瘤出芽檢出率的差異Table 2 Differences in detection rate of tumor budding before and after EGFR labeling in T1 stage equamous cell carcinoma tissues

腫瘤出芽分級：1級12例（1～4灶）、2級3例（6～7灶）、3級9例（11～21灶），30例食管SCC中，40%（12/30）出現(xiàn)1級出芽，10%（3/30）出現(xiàn)2級出芽，30%（9/30）出現(xiàn)3級出芽，還有20%（6/30）未發(fā)現(xiàn)腫瘤出芽。按Shinto分度分為：低度15例（出芽數(shù)1～7灶）、高度9例（11～21灶）。

2.2 T1期食管SCC內(nèi)鏡分型與腫瘤出芽以及其他臨床病理參數(shù)之間的關系

本組病例內(nèi)鏡分型為：0～Ⅰ3例、0～ⅡA 13例、0～ⅡB 7例、0～ⅡC 3例、0～Ⅲ4例，見圖3。本研究顯示T1期食管SCC無論有無腫瘤出芽都與內(nèi)鏡分型間無相關性（χ2=6.489,P>0.05），見表3。內(nèi)鏡0～Ⅲ型者占13.3%（4/30），且均檢出腫瘤出芽，出芽總數(shù)為44灶，其中3例出芽分級為3級；內(nèi)鏡0～Ⅱ型者占76.7%（23/30），出芽總數(shù)為129灶，其中以0～ⅡA型最多，約占總病例數(shù)的43.3%（13/30）；內(nèi)鏡0～Ⅰ型最少，占總例數(shù)的10%（3/30），其中1例未見腫瘤出芽，其余2例均為腫瘤出芽1級，出芽總數(shù)為7灶。

表3 T1期食管SCC組織腫瘤出芽與內(nèi)鏡分型之間的關系Table 3 Correlation between tumor budding and endoscopic classification in T1 ESCC tissues

圖3 T1期食管鱗狀細胞癌組織內(nèi)鏡分型Figure 3 Endoscopic classification in T1 stage equamous cell carcinoma tissues

T1期食管SCC內(nèi)鏡分型與患者年齡、性別、腫瘤大小、Ki67增殖指數(shù)、分化程度、浸潤深度、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期之間均無相關性（P>0.05）。

2.3 T1期食管SCC中腫瘤出芽與臨床病理參數(shù)之間的關系

本組病例臨床分期為：ⅠB 17例、ⅡB13例。結(jié)果顯示腫瘤出芽在T1b期SCC中的檢出率為91.7%，顯著高于T1a期SCC 33.3%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例腫瘤出芽檢出率為100%，顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者64.7%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），進一步分層分析顯示不同分級腫瘤出芽組間淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率的差異均無統(tǒng)計學意義（χ2=4.196,P=0.123）；臨床ⅡB期的病例腫瘤出芽檢出率為100%，顯著高于臨床ⅠB期者64.7%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。腫瘤出芽檢出率在有脈管侵犯者為100%，高于無脈管侵犯者73.9%，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；腫瘤出芽檢出率在高分化腫瘤中為100%，高于中～低分化者76%，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。腫瘤出芽與患者年齡、性別、腫瘤大小及Ki67增殖指數(shù)均無相關性（均P>0.05）見表4。

圖2 EGFR標記T1期食管鱗狀細胞癌組織腫瘤出芽情況Figure 2 EGFR-labeled tumor budding in T1 stage equamous cell carcinoma tissues

表4 T1期食管SCC組織腫瘤出芽與患者臨床病理參數(shù)之間的關系Table 4 Correlation between tumor budding and clinicopathological parameters of T1 ESCC patients

3 討論

T1期結(jié)直腸、胃癌通常被定義為“早期”癌癥，而T1期食管SCC也曾被認為是早期癌，即腫瘤浸潤深度在黏膜下層以上，伴或不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。但新研究發(fā)現(xiàn)，T1期食管癌并不是一種單純的早期癌，而是一組存在較大生物學異質(zhì)性的淺表性SCC，其中部分可通過內(nèi)鏡手術治愈，然而，部分就診時已處于進展期，需要接受更積極的治療[1-2]。因此，篩選出真正的早期食管癌（T1期不伴任何淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）顯得很重要，但只有根治性手術才能獲取足夠的淋巴結(jié)，因此也存在一定困難。那么探索早期食管SCC預后價值的指標就顯得很有意義，近年來已有少數(shù)學者提出腫瘤出芽在淺表性食管SCC中存在重要的意義，并證實腫瘤出芽與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關[14]，Teramoto等[3]發(fā)現(xiàn)腫瘤出芽率在發(fā)生脈管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中顯著高于侵襲性低者，并認為腫瘤出芽是T1期食管SCC的獨立預后因素，出現(xiàn)出芽者3年累積生存率為48.8%，明顯低于無出芽的病例94.5%。何度等[10]發(fā)現(xiàn)僅有6.5%（3/46）淺表性食管SCC存在腫瘤出芽，他們認為由于病例數(shù)少的原因還不足以得出明確的結(jié)論。Teramoto等[3]發(fā)現(xiàn)T1期食管SCC的高度出芽率為36.7%（29/79）。Fuchinoue等[15]發(fā)現(xiàn)，14%（7/50）淺表食管SCC為高度出芽，18%（9/50）低度出芽，總出芽率32%。Nakagawa[16]發(fā)現(xiàn)，T1期食管SCC100%存在腫瘤出芽，其中52.7%（29/55）存在高度出芽，47.3%（26/55）為低度出芽。本研究發(fā)現(xiàn)T1期食管SCC腫瘤出芽率高達80%（24/30），共檢出腫瘤出芽184灶，50%（15/30）為低度出芽，30%（9/30）為高度出芽，顯著高于國內(nèi)數(shù)據(jù)。研究顯示T1期胃癌中出芽率為56.1%（92/164）[17]，T1期結(jié)直腸癌出芽率為56.3%[18]。結(jié)合文獻及本研究數(shù)據(jù)，我們認為腫瘤出芽在T1期食管SCC中是較為常見的病理現(xiàn)象，且發(fā)生率可能高于T1期結(jié)直腸、胃癌。

與腸、胃癌相似，腫瘤出芽提示T1期食管SCC具有更強的侵襲能力[17-18]。多項研究證實T1期食管SCC的腫瘤出芽率與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、淋巴管及血管侵犯呈顯著正相關[2,15-16]。本研究顯示T1b期SCC出芽率為91.7%，顯著高于T1a期SCC 33.3%（P<0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例出芽率為100%，顯著高于無轉(zhuǎn)移者64.7%（P<0.05）；ⅡB期的病例出芽率為100%，顯著高于ⅠB期者64.7%（P<0.05）。腫瘤出芽與年齡、性別、分化程度、脈管侵犯、腫瘤大小及Ki67均無相關性（P>0.05）。本試驗還研究了內(nèi)鏡分型與腫瘤出芽、年齡、性別、腫瘤大小、Ki67、分化程度、浸潤深度、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期之間的關系，結(jié)果示內(nèi)鏡分型與以上參數(shù)均無相關性（P>0.05）。有人還對淺表性食管SCC出芽與浸潤模式進行了研究，發(fā)現(xiàn)浸潤性生長者比膨脹性及介于兩者之間的中間性者具有更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險[14]。但國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，淺表性食管SCC以膨脹性生長最多見，占50%（23/46），浸潤性者僅占13%（6/46），中間性約37%（17/46），三種浸潤模式間出芽率無明顯差別[10]。Nakagawa等[16]發(fā)現(xiàn)高度出芽的T1期食管癌E-cadherin低表達，5年生存率顯著低于低度出芽者。Niwa等[19]也發(fā)現(xiàn)高度出芽者浸潤更深、更易侵犯淋巴管、病理分期更高，5年生存率（25.9%）顯著低于低出芽組（75.1%）。他們進一步通過基因和蛋白檢測，發(fā)現(xiàn)高度出芽組低表達E-cadherin而高表達Vimentin，呈間質(zhì)表型，而，低度出芽組則高表達E-cadherin而低表達Vimentin，呈上皮表型，說明高出芽組腫瘤細胞發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）。EMT是促使癌細胞像間質(zhì)細胞一樣更具侵襲性的一個病理過程，而腫瘤出芽則可以在形態(tài)上反映EMT的過程[19-20]。實際上，除食管鱗癌外，很多腫瘤（結(jié)直腸癌，舌鱗狀細胞癌，胰腺癌，子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌）都已被證實存在腫瘤出芽與EMT之間的密切聯(lián)系[19]。Niwa的結(jié)果表明食管鱗癌可通過EMT獲得間質(zhì)細胞表型，但腫瘤浸潤前沿的出芽細胞在多大程度上發(fā)生了向間質(zhì)細胞表型的轉(zhuǎn)化，以及出芽與EMT之間的具體機制還有待進一步闡明。

本組病例標記EGFR后出芽率（80%）明顯高于常規(guī)檢出率（70%），可見EGFR在計數(shù)食管SCC腫瘤出芽時穩(wěn)定可靠。本研究還發(fā)現(xiàn)如果有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但腫瘤還局限于黏膜內(nèi)的食管SCC，很可能經(jīng)連續(xù)深切片后才能發(fā)現(xiàn)腫瘤出芽，這類食管SCC在計數(shù)出芽灶時最好先行免疫組化標記，以免遺漏少細胞性出芽灶。本組一名64歲男患者，食管SCC內(nèi)鏡下為黏膜小結(jié)節(jié)樣隆起，內(nèi)鏡分型0-ⅡA型，顯微鏡下觀察到黏膜內(nèi)有6處表淺浸潤灶，大小約0.1～0.4 cm，周邊均為原位癌，總面積大小約4.5 cm×2.5 cm，5枚食管旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移一枚，pTNM分期為pT1aN1M0G1，臨床分期ⅡB，第一次切片未發(fā)現(xiàn)出芽，連續(xù)深切片后在0.4 cm病灶周圍發(fā)現(xiàn)少量小瘤巢，EGFR標記后找到一灶3個細胞組成的芽體。有人建議CK標記計數(shù)腫瘤出芽[21]，但我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)EGFR標記的154例食管SCC組織中，均為細胞膜強陽性表達，周圍炎性細胞、纖維及平滑肌組織均陰性，與文獻報道一致[9]。由于EGFR在食管SCC主要著色于包膜，能清晰地勾畫出每個細胞的輪廓，極大的提高了少細胞出芽灶的辨識度，尤其在炎性反應較重的情況下，值得在工作中推廣應用。

隨著內(nèi)窺鏡技術不斷提高，T1期食管SCC的治療已經(jīng)取得了很大的進步，然而此類腫瘤包含著真正意義上的早期癌及一部分具有更高風險的淺表性癌，怎樣將兩者進行最大限度的篩選并進行合理的治療是我們所面臨的巨大挑戰(zhàn)。本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤出芽在T1期食管SCC中有較高比例的出現(xiàn)，亦是一個非常有價值的預后指標，因此，在T1期食管SCC診療過程中我們可以在一定程度上通過腫瘤出芽率的高低，綜合其他指標得到更精準的評估結(jié)果，這樣會更有利于我們預測僅侵犯黏膜肌層或黏膜下淺層的SCC患者的淋巴結(jié)受累情況，以便更加精準的實施EMR手術，同時對高腫瘤出芽率的患者追加更積極地治療。