趙少浩 章躍龍 蔣清清 譚 曜 劉燕妮 陳雪君

(寧波海關(guān)技術(shù)中心，寧波 315800)

亞硝酸異丁酯屬于亞硝酸類化合物，亞硝酸酯類化合物的主要作用是使血管擴(kuò)張，引起血壓下降及心動(dòng)加速，而亞硝酸異丁酯作為有機(jī)原料，常被用作溶劑廣泛應(yīng)用于有機(jī)合成工業(yè)。在化妝品的生產(chǎn)制作過(guò)程中，由于原料問(wèn)題極可能將亞硝酸異丁酯和亞硝酸戊酯帶入化妝品，接觸后其可對(duì)眼睛、皮膚等有刺激性，可發(fā)展為皮膚過(guò)敏并有致癌的危險(xiǎn)。我國(guó)《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中規(guī)定,亞硝酸異丁酯和亞硝酸戊酯為化妝品中的禁用組分[1]。當(dāng)前對(duì)于亞硝酸異丁酯的毒理學(xué)研究罕見(jiàn)報(bào)道。近年來(lái)，因遺傳修飾動(dòng)物技術(shù)快速發(fā)展，人類的疾病基因研究正從遺傳病基因識(shí)別向多基因遺傳易感性疾病發(fā)展，但是對(duì)于多基因疾病的研究卻存在困難。由于一部分多基因疾病為遺傳易感性疾病，是否存在主效基因及多效基因未知，遺傳易感性研究通常關(guān)注的是與人類疾病相關(guān)的基因組變異[2]。正因?yàn)槟承┘膊∈怯捎陂L(zhǎng)期基因變異的累積導(dǎo)致的，變異原因可能是環(huán)境因素、自發(fā)突變、雙親遺傳等，所以了解掌握致突變物質(zhì)的信息至關(guān)重要?；跀?shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)報(bào)道，亞硝酸異丁酯的毒理學(xué)數(shù)據(jù)僅有大鼠經(jīng)口LD50：410 mg /kg，小鼠經(jīng)口LD50：205 mg/kg[3]，未能檢索到其含有導(dǎo)致細(xì)菌回復(fù)突變的毒性數(shù)據(jù)。針對(duì)亞硝酸異丁酯的遺傳毒性，本研究應(yīng)用經(jīng)典的鼠傷寒沙門氏桿菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)(Ames實(shí)驗(yàn))和小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)，針對(duì)堿基突變及亞硝酸異丁酯的遺傳毒性進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以期對(duì)亞硝酸異丁酯的遺傳毒性評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和菌株

ICR小鼠由浙江省醫(yī)學(xué)院提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(浙)2019-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(浙)2018-0003，體質(zhì)量25～30 g，共50只，雌雄各半。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)福利倫理審查，審查編號(hào)：2019002。Ames標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)菌株(TA97a、TA98、TA100和TA102)由MOLTOX引進(jìn)，產(chǎn)品質(zhì)量保證證書批號(hào)分別為5454D、5444D、5439D、5457D及5437D，經(jīng)過(guò)菌株鑒定及陽(yáng)性對(duì)照物測(cè)定，菌株情況良好。

1.2 受試物和主要試劑

2-氨基芴，批號(hào)：G1429031、環(huán)磷酰胺(CP)，批號(hào)：K1701078和亞硝酸異丁酯，批號(hào)：C1911179，購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司提供；磷酸鹽緩沖溶液(pH6.8)、吉姆薩染液和敵克松，購(gòu)自Dr. Enrenstorfer GmBH；1，8-二羥基蒽醌，購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C10429233；疊氮鈉，購(gòu)自上海埃彼化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20120615；大鼠肝S9，購(gòu)自CHI Scientific. Inc，批號(hào)20FS070C。

1.3 致突變實(shí)驗(yàn)方法[4]

1.3.1鼠傷寒沙門氏菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)(Ames實(shí)驗(yàn))，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及受試物的毒性和溶解度的最高劑量設(shè)計(jì)原則,預(yù)實(shí)驗(yàn)表明是否加入S9，受試物最低抑菌濃度均為3.0 mg/皿。故首次實(shí)驗(yàn)根據(jù)化學(xué)品標(biāo)準(zhǔn)中劑量設(shè)置原則將亞硝酸異丁酯設(shè)為3.0、1.5、0.75、0.38和0.19 mg/皿5個(gè)劑量組。另設(shè)自發(fā)回變對(duì)照組、陰性對(duì)照組(DMSO)、陰性對(duì)照組(玉米油)和陽(yáng)性對(duì)照組。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)將亞硝酸異丁酯設(shè)為3.0、0.95、0.30、0.09和0.03 mg/皿5個(gè)劑量組，同時(shí)另設(shè)自發(fā)回變對(duì)照組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組,劑量均與首次實(shí)驗(yàn)相同。用Ames實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株TA97a、TA98、TA100和TA102在是否加入S9混合液的條件下，分別對(duì)受試物做平板摻入法實(shí)驗(yàn)，37 ℃培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和自發(fā)回變對(duì)照組也依此方法操作。各菌株每劑量做三個(gè)平行皿，每皿加入菌和受試物各0.1 mL，代謝活化組加S9 0.5 mL，記錄各皿回變菌落數(shù)。如果受試物的回變菌落數(shù)是自發(fā)回變菌落數(shù)的兩倍以上，并且有劑量—反應(yīng)關(guān)系則定為陽(yáng)性。

1.3.2小鼠嗜多染紅細(xì)胞(PCE)微核實(shí)驗(yàn)，健康、體質(zhì)量為20～30 g之間的ICR小鼠，50只，編號(hào)及稱體質(zhì)量，隨機(jī)分為5組：陰性對(duì)照組(玉米油)、低劑量組(11 mg/kg)、中劑量組(41 mg/kg)、高劑量組(103 mg/kg)，陽(yáng)性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺，CP 60 mg/kg)，每組10只。陰性對(duì)照組和染毒組(低、中及高劑量組)，劑量為0.1 mL/g經(jīng)口灌胃給藥，連續(xù)4 d，第5天頸椎脫位法處死動(dòng)物。按常規(guī)方法解剖小鼠，每只動(dòng)物涂?jī)蓮埞撬柰科捎秒p盲法閱片，每只小鼠觀察2 000個(gè)PCE，記錄含有微核的PCE數(shù)，規(guī)定PCE中出現(xiàn)多個(gè)微核的按一個(gè)計(jì)算，計(jì)算微核率(‰)。

2 結(jié)果

2.1 Ames實(shí)驗(yàn)

亞硝酸異丁酯的各劑量組各菌株回變菌落數(shù)均未超過(guò)自然回變菌落數(shù)的兩倍，而陽(yáng)性對(duì)照組超過(guò)自然回變菌落數(shù)的兩倍以上，并且無(wú)劑量—效應(yīng)關(guān)系，見(jiàn)表1和表2所示。

表1 Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)(首次實(shí)驗(yàn))Table 1 Results of Ames experiment (n=3)(The first test)

表2 Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)(驗(yàn)證實(shí)驗(yàn))Table 2 Results of Ames experiment (n=3)(Validation test)

2.2 小鼠骨髓細(xì)胞PCE微核實(shí)驗(yàn)

各劑量染毒組與陰性對(duì)照組相比。其中，高劑量組小鼠骨髓細(xì)胞微核率差異顯著(P<0.05)，而陽(yáng)性對(duì)照組微核發(fā)生率與陰性對(duì)照組比較差異顯著(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下，亞硝酸異丁酯在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，隨著濃度增加小鼠骨髓細(xì)胞的為微核率依次增加，見(jiàn)表3所列。

表3 小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of mouse bone marrow micronucleus test

3 討論

微核(micronucleus，MN)的形成主要有兩種機(jī)制，一種是染色體的斷裂，另外一種是有絲分裂過(guò)程的紊亂。當(dāng)正常的個(gè)體暴露于污染的環(huán)境，放射或服用致畸藥物、有毒化學(xué)物等條件下，均可促進(jìn)MN的形成。在細(xì)胞之中，胞質(zhì)中核小體的出現(xiàn)并不一定是微核細(xì)胞，它應(yīng)該與凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞核溶解造成的MN相區(qū)別。微核細(xì)胞的特征包括：核小體的位置靠近主核，一般為細(xì)胞膜和細(xì)胞核中間的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。大小約為主核的1/16～1/3；染色與主核相一致或比主核染色更深；形態(tài)為圓形或橢圓形；MN的數(shù)量一般少于3個(gè)。另外，MN細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，主核清晰。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，無(wú)明顯的主核，核小體數(shù)量3個(gè)以上[6]。在本實(shí)驗(yàn)中，由于亞硝酸異丁酯微溶于水，所以選用玉米油當(dāng)做溶劑。本品常用于有機(jī)合成且有一定的毒性，所以在微核實(shí)驗(yàn)中根據(jù)LD50計(jì)算劑量。本微核實(shí)驗(yàn)中，小鼠PCE數(shù)量充足，微核易看清，陰性對(duì)照組微核自發(fā)率低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在劑量組范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，微核形成率逐漸升高，且小鼠并未出現(xiàn)死亡，與陰性對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)，表明在所選劑量下，亞硝酸異丁酯對(duì)小鼠有致突變作用，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)的組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型(his-)菌株，在含微量組氨酸的培養(yǎng)基中，除極少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)胞外，一般只分裂幾次，形成在顯微鏡下才能見(jiàn)到的微菌落。受誘變劑作用后，大量細(xì)胞發(fā)生回復(fù)突變，自行合成組氨酸，發(fā)育成肉眼可見(jiàn)的菌落。根據(jù)楊桂榕等[7]報(bào)道，某些化學(xué)物質(zhì)需經(jīng)代謝活化才有致變作用，因此，在測(cè)試系統(tǒng)中加入哺乳動(dòng)物微粒體酶，以彌補(bǔ)體外實(shí)驗(yàn)缺乏代謝活化系統(tǒng)。Verschaeve[8]報(bào)道，Ames實(shí)驗(yàn)是體外致突變實(shí)驗(yàn)，鑒于化學(xué)物質(zhì)的致突變與基因組突變之間密切相關(guān)，所以Ames是檢測(cè)基因突變的首選方法。需要注意的是由于該受試物微溶于水，且有揮發(fā)性，所以在Ames實(shí)驗(yàn)中選用二甲基亞砜(DMSO)當(dāng)做溶劑。另外，本品常用于有機(jī)合成，且有一定的毒性，根據(jù)以上選擇劑量的原則，受試物用溶劑稀釋后在Ames實(shí)驗(yàn)中最高劑量定為3 mg/皿，下設(shè)劑量為1.5 mg/皿、0.95 mg/皿、0.75 mg/皿、0.38 mg/皿、0.30 mg/皿、0.19 mg/皿、0.09 mg/皿和0.03 mg/皿，另設(shè)自發(fā)回變對(duì)照組、陰性對(duì)照組(DMSO)和陰性對(duì)照組(玉米油)，劑量為0.1 mL/皿。Ames實(shí)驗(yàn)所反映的遺傳學(xué)終點(diǎn)是DNA堿基序列的改變。本次亞硝酸異丁酯細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)，在活化與非活化條件下各菌株對(duì)應(yīng)各劑量組細(xì)菌回復(fù)突變數(shù)均小于陰性對(duì)照組細(xì)菌回復(fù)突變數(shù)的兩倍，而陽(yáng)性對(duì)照組引起測(cè)試菌株的回復(fù)突變菌落數(shù)成倍增長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)表明在所選擇的劑量水平下，亞硝酸異丁酯不會(huì)引起DNA堿基序列的改變，在致突變性方面未見(jiàn)顯著毒性。