李志萍 楊利峰 周向梅 趙德明

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家動(dòng)物海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease，AD)是常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，典型病理特征為腦組織內(nèi)大量淀粉樣蛋白沉積，臨床表現(xiàn)為記憶力衰退、認(rèn)知功能障礙和行為異常改變[1]。在AD動(dòng)物模型的研究中，基因修飾小鼠模型通過(guò)改變基因組的表達(dá)，將基因型和表型關(guān)聯(lián)，實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程的機(jī)制研究?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種基因與AD相關(guān)，如淀粉樣蛋白前體(amyloid precursor protein，APP)基因、Tau蛋白基因、載脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)基因、早老蛋白(Presenilin，PS)基因、ob(leptin)基因等。圍繞這些基因在指定位點(diǎn)上進(jìn)行突變，開(kāi)發(fā)出不同的基因修飾小鼠模型來(lái)模擬AD的發(fā)病過(guò)程或者是對(duì)藥物治療效果的評(píng)價(jià)，對(duì)深入了解疾病的發(fā)生發(fā)展提供重要的科學(xué)工具。本研究總結(jié)了APP、PS-1、APOE及ob這4種基因與AD疾病的相關(guān)性，并探討隱藏突變?nèi)祟惢蛐∈蟮牟±硖卣?、表型差異以及在科學(xué)研究中的應(yīng)用。

1 APP基因修飾小鼠模型

神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)和老年斑(SP)是AD患者的兩大病理特征，SP的形成原因是第21號(hào)染色體上的APP基因突變?cè)斐傻腫2]。APP基因突變及異常表達(dá)，可以部分解釋多肽的降解路徑及AD的發(fā)病機(jī)制。目前，APP轉(zhuǎn)基因小鼠仍不能復(fù)制出AD患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛的神經(jīng)元死亡現(xiàn)象[3]。

PDAPP小鼠：首次報(bào)道能產(chǎn)生AD病理樣病變的轉(zhuǎn)基因小鼠，由C57BL/6鼠與DBA/2鼠交配產(chǎn)生[4]。PDAPP小鼠能過(guò)表達(dá)APP的三種形式(695、751和770)，6～9個(gè)月形成淀粉樣斑塊，并表現(xiàn)出與年齡相關(guān)的空間學(xué)習(xí)障礙[5]。PDAPP小鼠模型的建立進(jìn)一步支持了APP和β淀粉樣蛋白(Aβ)在AD發(fā)病中的作用，有利于研究Aβ產(chǎn)生和沉積的抑制機(jī)制和治療途徑。

Tg2576小鼠及APP23小鼠：由兩種轉(zhuǎn)基因品系在不同啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下和不同的APP亞型表達(dá)相同的突變產(chǎn)生。Tg2576小鼠是轉(zhuǎn)APP695基因小鼠，APP23小鼠是轉(zhuǎn)APP751基因小鼠，APP23小鼠比Tg2576小鼠的更具有致病性[5-6]。APP23小鼠在6月齡開(kāi)始形成淀粉樣蛋白，而Tg2576小鼠在11月齡才開(kāi)始形成淀粉樣蛋白。APP23在3月齡開(kāi)始出現(xiàn)記憶障礙，而Tg2576小鼠記憶障礙發(fā)生在10月齡[5-6]。APP23在海馬CA1區(qū)顯示神經(jīng)元丟失而Tg2576不顯示。除此之外，兩種小鼠都有腦淀粉樣血管病(cerebrai amyloid angiepathy，CAA)的發(fā)展，Tg2576在血管周圍發(fā)現(xiàn)95%的致密斑塊，APP23出現(xiàn)自發(fā)性出血性中風(fēng)，臨床上約有90%的AD患者可能發(fā)展為CAA，這兩種品系的小鼠同時(shí)還可提供CAA模型研究血管病[7]。

TgCRND8小鼠、J20小鼠和TASD小鼠：它們是APP雙突變小鼠，TASD結(jié)合Swedish和London雙突變，TgCRND8和J20是結(jié)合Swedish和Indiana突變[8]。雙突變模型與單突變模型相比，Aβ聚集與沉積更為快速，形成SP的年齡顯著降低，此類小鼠更有利于早發(fā)性AD的研究。TgCRND8小鼠兩個(gè)突變位點(diǎn)的結(jié)合導(dǎo)致非常高水平的Aβ42產(chǎn)生，3月齡表現(xiàn)為顯著的認(rèn)知功能障礙，并可見(jiàn)典型的SP、神經(jīng)元丟失及行為學(xué)上多種能力的損傷[9]。J20小鼠海馬和皮質(zhì)區(qū)表現(xiàn)年齡依賴性的SP，6～7月齡出現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶缺陷，顯示腦部癲癇與海馬區(qū)代償性抑制相關(guān)，提示類似癲癇類異常興奮的神經(jīng)元活動(dòng)可能代表了促進(jìn)認(rèn)知障礙產(chǎn)生的上游事件[10]。

2 PS-1和PS-2基因修飾小鼠模型

PS-1位于14號(hào)染色體，PS-2位于1號(hào)染色體，PS-1和PS-2是γ-分泌酶的組成部分，γ-分泌酶裂解APP產(chǎn)生蛋白片段Aβ40和Aβ42，較長(zhǎng)片段的Aβ42可能導(dǎo)致淀粉樣斑塊的形成和AD的發(fā)展[11]。包含PS突變的小鼠模型會(huì)使Aβ42/Aβ40的比例增加，但不形成淀粉樣斑塊，因此將APP和PS轉(zhuǎn)基因小鼠雜交形成雙轉(zhuǎn)基因系，雙基因小鼠比單基因系更早顯示出淀粉樣蛋白的積累和認(rèn)知障礙。

PSAPP小鼠：M146L PS由C57BL/6與DBA/2F小鼠雜交產(chǎn)生，PSAPP小鼠比原始的單基因Tg2576小鼠更早的發(fā)生Aβ斑塊沉積，并且能增加Aβ42的產(chǎn)量[12]。PSAPP小鼠甚至在斑塊沉積前出現(xiàn)Y迷宮缺陷，這一發(fā)現(xiàn)更加清楚地解釋了斑塊沉積與認(rèn)知缺陷之間的關(guān)系。

2xKI小鼠：其APP基因被設(shè)計(jì)為表達(dá)Swedish突變加人源Aβ序列，PS基因被設(shè)計(jì)為表達(dá)與FAD相關(guān)的P264L[13]。無(wú)論APP突變還是PS突變都不能單獨(dú)導(dǎo)致淀粉樣蛋白病變，但2xKI小鼠可以。2xKI小鼠在標(biāo)準(zhǔn)版本的Morris水迷宮中沒(méi)有缺陷，但在更具挑戰(zhàn)性的任務(wù)中存在缺陷。在這個(gè)任務(wù)中，一旦它們知道了平臺(tái)的位置，平臺(tái)就會(huì)被移動(dòng)，從而要求小鼠學(xué)習(xí)其新位置[14]。2xKI小鼠模型的優(yōu)點(diǎn)之一是Aβ的沉積隨時(shí)間呈線性增加，而其它基因突變小鼠的Aβ沉積呈指數(shù)增長(zhǎng)[14]。

5xFAD小鼠：結(jié)合5個(gè)與AD相關(guān)的突變，包括APP中的Swedish、Florida(I716V)及London(V717I)突變和PS-1中的M146V，L286V突變是一個(gè)發(fā)展更為快速的品系[15]。5xFAD小鼠在1.5月齡即可表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的Aβ，2月齡時(shí)出現(xiàn)胞外Aβ沉積及形成SP，4～6月齡出現(xiàn)淀粉樣病理變化和認(rèn)知障礙[16]。此外，與其他APP突變或APP+PS-1突變小鼠不同，5xFAD小鼠9月齡時(shí)大腦皮質(zhì)出現(xiàn)大量神經(jīng)元丟失，與淀粉樣蛋白沉積出現(xiàn)的區(qū)域相同，因此成為研究AD病變機(jī)制的一個(gè)有利模型[17]。Oakley等[17]在較早月齡的5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠中觀察到AD大腦皮質(zhì)、海馬等區(qū)域形成大量淀粉樣斑塊沉積，NFT形成等多種神經(jīng)病理?yè)p害，并同時(shí)表現(xiàn)出明顯的行為學(xué)異常。

3xTg-AD小鼠：結(jié)合APPSwe、PS1M146 V和TauP301 L突變的三重轉(zhuǎn)基因小鼠[18]，是首個(gè)在AD病變的相關(guān)區(qū)域形成淀粉樣病變和NFT的動(dòng)物模型，因此被廣泛用于AD的研究。該模型有利于幫助闡明Aβ、NFT及突觸功能紊亂三者之間的關(guān)系，同時(shí)適用于研究針對(duì)Aβ及NFT兩種病理變化的AD療法[18]。3～4月齡小鼠皮質(zhì)區(qū)出現(xiàn)胞內(nèi)Aβ免疫反應(yīng)，4月齡水迷宮實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)長(zhǎng)期記憶功能障礙，6月齡在海馬CA1錐體神經(jīng)元出現(xiàn)胞內(nèi)Aβ免疫反應(yīng)，皮質(zhì)出現(xiàn)Aβ胞外沉積，并表現(xiàn)短期記憶功能受損，12月齡出現(xiàn)Tau蛋白的構(gòu)象變化，15月齡皮質(zhì)區(qū)有嚴(yán)重的Aβ沉積，Tau蛋白高度磷酸化，18月齡神經(jīng)突周圍觀察到明顯的球狀結(jié)構(gòu)。3xTg-AD小鼠能同時(shí)表現(xiàn)SP和NFT，神經(jīng)元死亡和突觸丟失等病理特征，更接近于臨床疾病的研究[19]。除淀粉樣病理學(xué)之外，3xTg-AD小鼠還是研究最多的Tau蛋白病模型[20]。

3 Apo E基因修飾小鼠模型

ApoE基因有三種亞型，其中ApoE4是阿爾茨海默癥的主要遺傳學(xué)風(fēng)險(xiǎn)因子，攜帶這一基因的人患AD的風(fēng)險(xiǎn)比其他人高15倍[21]。ApoE4能使Tau蛋白磷酸化增加，干擾微管的裝配和完整性，導(dǎo)致NFT[22]。將ApoE序列定位引入小鼠基因組，同時(shí)呈現(xiàn)癲癇表型，病程變化與AD患者更為類似，是轉(zhuǎn)基因未來(lái)發(fā)展的一個(gè)趨勢(shì)。由于該模型所誘導(dǎo)的具體AD病理改變的機(jī)制還不十分清楚，仍有待進(jìn)一步研究。

Dumanis等[23]用現(xiàn)有的AD轉(zhuǎn)基因小鼠與攜帶人類ApoE4基因的小鼠雜交，得到新型小鼠模型，對(duì)該模型的研究顯示，攜帶ApoE4轉(zhuǎn)基因的小鼠與攜帶其他ApoE突變的小鼠相比，大腦中低聚形式的β淀粉樣蛋白更多，說(shuō)明ApoE4的作用機(jī)制可能會(huì)影響Aβ的累積。這一新型模型是首個(gè)能體現(xiàn)ApoE4與β淀粉樣蛋白之間作用的模型。另外，還可對(duì)攜帶人類ApoE轉(zhuǎn)基因的小鼠進(jìn)行藥物測(cè)試，以獲得更加全面的治療效果。

4 Ob基因修飾小鼠模型

Ob基因位于7號(hào)染色體，編碼瘦素(Leptin)。Leptin能下調(diào)BACE的表達(dá)，增加ApoE介導(dǎo)的Aβ的清除。下丘腦中Leptin功能缺乏會(huì)增加2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)及肥胖的風(fēng)險(xiǎn)，這些都是AD的危險(xiǎn)因素[24]。

ob/ob小鼠：是ob基因純合突變的小鼠，特征是肥胖及多食，最終發(fā)展為T2DM。ob/ob小鼠顯示出海馬區(qū)長(zhǎng)期無(wú)效的增強(qiáng)作用和焦慮行為，神經(jīng)元樹突棘密度減少，促進(jìn)Aβ的累積，大腦皮層中Tau蛋白裂解和過(guò)度磷酸化增加[24]。Sebasti?o等[25]證實(shí)，ob/ob小鼠與APP23模型雜交的后代表現(xiàn)出與AD相同的認(rèn)知功能障礙，卻沒(méi)有淀粉樣蛋白增加，表現(xiàn)出腦血管炎癥和嚴(yán)重的CAA。目前，ob作為一種新的療法，可能為AD研究進(jìn)展帶來(lái)新的發(fā)現(xiàn)。不過(guò)與AD的其他基因修飾模型相比，ob/ob小鼠模型的疾病機(jī)制更為復(fù)雜。另一個(gè)可進(jìn)行比較的模型是db/db小鼠。除了有相似的肥胖及多食之外還表現(xiàn)出高血糖，db/db小鼠伴隨有神經(jīng)纖維缺失、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)受損等周圍神經(jīng)病變。劉瀅[24]在對(duì)該模型的研究中還發(fā)現(xiàn)該小鼠在水迷宮中存在空間學(xué)習(xí)和記憶缺陷[24]。這可能會(huì)對(duì)AD研究提供有利的幫助。

5 基因修飾小鼠模型的發(fā)展與前景

在AD研究中最重要的基因修飾小鼠關(guān)鍵特征，見(jiàn)表1所列。

表1 AD基因修飾小鼠模型的關(guān)鍵特征[26]Table 1 The key features of the gene modified mouse models of AD[26]

理想的AD模型除了能在遺傳學(xué)上模擬AD特征性病理學(xué)改變之外，還需模擬人類AD患者的行為學(xué)改變。當(dāng)前AD的發(fā)病機(jī)制還不十分明確，現(xiàn)有的動(dòng)物模型是依據(jù)不同的機(jī)制假說(shuō)而開(kāi)發(fā)，并且由于基因表達(dá)可以被宿主的遺傳背景所修飾，不管是單轉(zhuǎn)基因模型還是多轉(zhuǎn)基因模型大多只是片面復(fù)制AD的特征性改變，難以全面模擬AD的病理改變。此外，由于各物種之間存在許多差異，因此必須在不同的物種上測(cè)試同一藥物，以評(píng)估有效性和安全性。

雖然當(dāng)前的基因修飾小鼠模型還存在一些不足，但對(duì)闡明AD具體致病機(jī)制依然具有重要的價(jià)值，在藥物開(kāi)發(fā)臨床前研究中起著關(guān)鍵作用以及對(duì)致病機(jī)制的新見(jiàn)解做出了貢獻(xiàn)。隨著與AD相關(guān)新基因的發(fā)現(xiàn)，基因構(gòu)建將更加完善，基因修飾模型也更加接近人類AD的全部特征，伴隨良好模型的不斷開(kāi)發(fā)將顯著加速對(duì)AD發(fā)病機(jī)制的研究和治療藥物篩選的進(jìn)程。