袁新躍，胡麗霞，印方平，季昱，周陽元，沈丹玉

1(杭州市富陽區(qū)食品安全檢驗(yàn)檢測中心，浙江 杭州，311400)2(中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州，311400)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)是蕓香科花椒屬植物，原產(chǎn)于中國，廣泛分布于亞洲、美洲、非洲以及大洋洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)?；ń肥莻鹘y(tǒng)的香辛料，其果皮被譽(yù)為“中國八大調(diào)味品之一”?；ń肪哂兴幱脙r(jià)值，不僅有溫中、行氣、逐寒、止痛、殺蟲等多種功效，還可醫(yī)治嘔吐、胃痛、腹瀉等病癥，并可以作為表皮麻醉鎮(zhèn)定劑[1]?；ń吩谖覈颇稀①F州、四川、重慶等地均有廣泛栽植，是云貴川山區(qū)農(nóng)民脫貧致富的重要經(jīng)濟(jì)作物[2]。

花椒為多年生灌木，除了有危害根部、葉部和樹干等多種病害外，還容易發(fā)生銅色跳甲、藍(lán)桔跳甲、紅蜘蛛、蚜蟲、小吉丁蟲、大衰蛾、木撩尺蠖等多種蟲害，因此農(nóng)藥的使用不可避免[3]。花椒一年之中打十一、二次農(nóng)藥。催芽、催枝、?；?、保果、打蚜蟲、治蜘蛛都要打農(nóng)藥，而且打農(nóng)藥經(jīng)常要重復(fù)打2次或3次才能起效果。農(nóng)藥測定是花椒質(zhì)量安全的重要保證。

測量不確定度是指由于測量誤差的存在，對(duì)被測量值不能確定的程度[4-5]。測量不確定度直接影響測量結(jié)果的判定[6]，是檢測數(shù)據(jù)可靠性的重要保證[7]。目前關(guān)于菊酯類農(nóng)藥的檢測方法很多，對(duì)氣相色譜法測定氯菊酯和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS)測定其他種菊酯類農(nóng)藥的不確定度評(píng)定也有較多報(bào)道[3,8-10]，而關(guān)于GB 23200.113—2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》測定氯菊酯的不確定度評(píng)定還未見相關(guān)報(bào)道。本文根據(jù)《測量不確定度標(biāo)示指南》和JJF 1059.1—2012技術(shù)規(guī)程[11]要求，對(duì)GC-MS/MS法測量花椒中氯菊酯結(jié)果的不確定度進(jìn)行評(píng)定,分析不確定度來源,確定影響結(jié)果的主要因素，提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確度。

1 材料與方法

7000B氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，美國Agilent公司；T10均質(zhì)機(jī)，德國IKA公司；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA公司；HSC-24氮吹儀，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSB05-2309-2016，100 μg/mL，不確定度0.11 μg/mL)，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；環(huán)氧七氯標(biāo)準(zhǔn)品(C 14101000，10 mg，99.36%，不確定度0.3%)，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；正己烷、乙腈、甲苯、乙酸乙酯(色譜純)，美國FISHER公司；氯化鈉(優(yōu)級(jí)純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；花椒，當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確移取1.0 mL氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)母液，用正己烷定容得到10 μg/mL氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液用乙酸乙酯稀釋成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取10.0 mg(精確至0.1 mg)環(huán)氧七氯標(biāo)準(zhǔn)品，用乙酸乙酯溶解定容為1 mg/mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，再進(jìn)一步用乙酸乙酯稀釋為5 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.2 樣品前處理

根據(jù)國標(biāo)GB 23200.113—2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》要求，準(zhǔn)確稱取5.00 g(精確至0.01 g)粉碎好的花椒樣品，置于100 mL塑料離心管中，加10 mL超純水渦旋混勻，靜置30 min。再加20 mL乙腈，以15 000 r/min高速均質(zhì)2 min。加5 g氯化鈉劇烈振蕩10 s，在4 ℃下以4 200 r/min離心5 min。準(zhǔn)確吸取5 mL上清液，40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，待凈化。

用5 mL乙腈-甲苯溶液(體積比3∶1)預(yù)淋洗活化洗石墨化碳黑-氨基柱，棄去淋洗液。用5 mL乙腈-甲苯溶液溶解旋蒸瓶中待測物，過柱。重復(fù)2次，再用5 mL乙腈-甲苯溶液淋洗小柱，收集所有淋洗液，40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，用2.5 mL乙酸乙酯復(fù)溶，加50 μL環(huán)氧七氯內(nèi)標(biāo)溶液渦旋混勻，過0.22 μm濾膜，用于GC-MS/MS測定。以離子對(duì)進(jìn)行定性，內(nèi)標(biāo)法定量。

1.2.3 儀器條件

色譜柱：HP-5MS柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)；升溫程序?yàn)槌跏?0 ℃保持1 min，先以40 ℃/min速率升至120 ℃，再以5 ℃/min速率升至240 ℃，最后以12 ℃/min 速率升至300 ℃保持6 min；流速1.2 mL/min；進(jìn)樣口溫度280 ℃；接口溫度280 ℃；進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣；載氣為高純氦氣，純度≥99.999%；四極桿溫度150 ℃；離子源(EI)溫度 230 ℃；電離能量70 eV；檢測方式，多反應(yīng)監(jiān)測模式，氯菊酯的定量離子對(duì)183.1>153.0m/z，定性離子對(duì)183.1>168.0，碰撞能量分別為15、10 eV；環(huán)氧七氯的定量離子對(duì)353>262.8m/z，定性離子對(duì)353>218.9m/z，碰撞能量分別為15、35 eV。

1.2.4 數(shù)學(xué)模型的建立

按照標(biāo)準(zhǔn)方法，試樣中氯菊酯含量的計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：X，花椒樣品中氯菊酯的含量，mg/kg；Cs，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中氯菊酯質(zhì)量濃度，μg/mL；A，試樣溶液中氯菊酯的色譜峰面積；Ci，試樣溶液中環(huán)氧七氯的濃度，μg/mL；Asi，標(biāo)準(zhǔn)工作液中環(huán)氧七氯的色譜峰面積；As，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中氯菊酯的色譜峰面積；Csi，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中環(huán)氧七氯的質(zhì)量濃度，μg/mL；Ai，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中環(huán)氧七氯的色譜峰面積；V，試樣上機(jī)液的最終定容體積，mL；m，花椒的質(zhì)量，g。

1.2.5 不確定來源的分析

根據(jù)測定步驟和數(shù)學(xué)模型，GC-MS/MS法測定花椒中氯菊酯的不確定度來源包括：氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)環(huán)氧七氯溶液的配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度(B類評(píng)定)；花椒樣品重復(fù)測定引入的不確定度(A類評(píng)定)；花椒稱量過程引入的不確定度(B類評(píng)定)；提取、凈化和定容等前處理過程引入的不確定度(B類評(píng)定)；分析儀器GC-MS/MS引入的不確定度(B類評(píng)定)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制引入的不確定度

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的不確定度

由1 mL單線刻度移液管和10 mL A級(jí)容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別如公式(2)～公式(4)所示：

=0.003 71

(2)

0.002 50

(3)

由氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制所產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為

(4)

2.1.3 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)引入的不確定度

由于在本次花椒測定氯菊酯過程中標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品待測液均加入同體積的同一份配制好的環(huán)氧七氯內(nèi)標(biāo)溶液，環(huán)氧七氯的純度和配制不影響花椒樣品中氯菊酯的含量測定，因此內(nèi)標(biāo)物質(zhì)環(huán)氧七氯引入的不確定度只由其移取體積所產(chǎn)生。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制引入的不確定度

分別吸取0.1、0.2、0.5、1、2、5 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，配制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/mL這6個(gè)不同質(zhì)量濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)工作液。再用100 μL移液槍移取50 μL環(huán)氧七氯溶液，分別與1 mL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液混合于1.5 mL進(jìn)樣瓶中，得到與待測樣液相同環(huán)氧七氯內(nèi)標(biāo)含量的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。此過程產(chǎn)生的不確定度主要由玻璃量器、移液槍和室溫變化所引入。玻璃量器和移液槍的最大允許誤差按照檢定規(guī)程[13]規(guī)定。前處理室溫度設(shè)置為20 ℃，實(shí)際在±3 ℃范圍內(nèi)波動(dòng)。標(biāo)準(zhǔn)工作液用乙酸乙酯進(jìn)行定容，當(dāng)室溫為20 ℃時(shí)，其膨脹系數(shù)為1.38×10-3/℃。計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，具體結(jié)果見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中移液管、移液槍的不確定度Table 1 Uncertainty of pipette and adjustable pipette in preparation of standard solution

由標(biāo)準(zhǔn)工作液配制引入的相對(duì)不確定度如公式(5)所示：

(5)

2.3 校正標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度

配制好的相同環(huán)氧七氯含量的6點(diǎn)不同氯菊酯濃度系列標(biāo)準(zhǔn)工作液分別進(jìn)行3次重復(fù)測定。以氯菊酯與環(huán)氧七氯的濃度比值作為橫坐標(biāo)x，氯菊酯與環(huán)氧七氯的峰面積比值作為縱坐標(biāo)y，進(jìn)行線性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.092 112x+0.003 107，R2=0.995 21。標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度如公式(6)所示:

(6)

對(duì)花椒陰性樣品添加氯菊酯，添加水平為0.3 mg/kg，進(jìn)行6次平行測定，使用前面擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為定量標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算氯菊酯的算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算加標(biāo)花椒重復(fù)測定引入的相對(duì)不確定度，花椒加標(biāo)測量結(jié)果見表2。

表2 花椒樣品添加氯菊酯重復(fù)測量結(jié)果Table 2 The determination result of permethrin in pepper

2.4 樣品前處理引入的不確定度

2.4.1 樣品稱量引入的不確定度

2.4.2 樣品提取、凈化、定容引入的不確定度

花椒在提取、凈化、定容過程引入的不確定度主要是玻璃容量器具和室溫變化。前處理室溫度設(shè)為20 ℃，實(shí)際在±3 ℃范圍內(nèi)波動(dòng)。乙腈和乙酸乙酯在20 ℃時(shí)的膨脹系數(shù)分別為1.37×10-3/℃和1.38×10-3/℃。本次提取、凈化、定容所用到玻璃量具的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果見表3。

表3 前處理過程中移液管、移液槍的不確定度Table 3 Uncertainty of pipette and adjustable pipette in pretreatment

花椒提取、凈化、定容引入的相對(duì)不確定度如公式(7)所示：

(7)

2.4.3 重復(fù)測量不確定度

由表2得花椒添加0.3 mg/kg重復(fù)測量6次的平均回收率為95.7%，其標(biāo)準(zhǔn)偏差S(X)計(jì)算如公式(8)所示：

(8)

因此，前處理過程引入的不確定度如公式(9)所示:

(9)

2.5 分析儀器引入的不確定度

2.6 合成不確定度

由上述各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量合成花椒中添加氯菊酯相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度如公式(10)所示：

urel(Z)

(10)

2.7 擴(kuò)展不確定度

依據(jù)國家計(jì)量技術(shù)規(guī)范JJF 1135—2005《化學(xué)分析測量不確定度評(píng)定》[14]的要求，正態(tài)分布在95.45%置信區(qū)間時(shí)包含因子k=2?；ń分刑砑?.3 mg/kg 氯菊酯的測量值為0.287 mg/kg，則花椒中氯菊酯含量測定的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為Urel=k×urel(Z)=2×0.063 49=0.127，擴(kuò)展不確定度為U=Urel×W=0.127×0.287= 0.036 4 mg/kg。

2.8 測量不確定度報(bào)告

花椒中添加0.3 mg/kg氯菊酯測量結(jié)果表示為：(0.287±0.036 4) mg/kg，k=2。其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度統(tǒng)計(jì)見表4。

表4 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 4 The statistics of the relative standard uncertainty

3 結(jié)論

采用GB 23200.113—2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》中GC-MS/MS法測定花椒中添加0.3 mg/kg氯菊酯的結(jié)果平均值為0.287 mg/kg，擴(kuò)展不確定度為0.036 4 mg/kg (k=2)，測量結(jié)果表示為(0.287±0.036 4) mg/kg。由表4可知，本方法不確定度來源中標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度為最大影響因素，其次是標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程和分析儀器引入的不確定度。樣品前處理對(duì)不確定度也有一定貢獻(xiàn)，氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制的影響最小。依據(jù)本研究結(jié)果，建議在GC-MS/MS檢測菊酯類農(nóng)藥過程中選用精度較好的量器，規(guī)范移液管和容量瓶的操作，確保標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度的準(zhǔn)確性；選擇擬合線性高的工作曲線進(jìn)行校準(zhǔn)；對(duì)分析儀器進(jìn)行日常維護(hù)和按時(shí)檢定；適當(dāng)增加平行樣，規(guī)范前處理步驟，進(jìn)一步提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。