謝思怡，付余*，鄔威

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(西南大學,食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，重慶，400715) 3(西南大學 動物科學技術學院，重慶，400715)

肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MP)是一類肌肉中重要的鹽溶性蛋白，占豬肉總蛋白的50%～55%，其主要成分包括肌球蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白和肌動球蛋白等[1]。MP的結構和功能性質與肉制品的加工特性密切相關，能夠影響肉制品的最終品質[2]。使用包括物理、化學、酶等技術對MP進行修飾[3]，可以有效地改變MP的功能性質進而滿足食品工業(yè)的相應需求。然而，這些修飾方法尚存在不足，包括修飾程度有限、食品安全性低以及成本較高[4]。蛋白質糖基化反應(美拉德反應)，是指通過還原糖的羰基與蛋白質游離賴氨酸的ε-氨基共價連接而形成糖蛋白[5]，是一種綠色的蛋白質修飾方法。有研究表明，糖基化修飾可以提高蛋白質的乳化性、溶解性、熱穩(wěn)定性的功能特性[3, 6-7]。一些蛋白質如蛋清蛋白[8]、鰱魚肌球蛋白[9]、黑米谷蛋白[10]、大豆分離蛋白[11]通過糖基化反應修飾能夠顯著改善其功能性質[12]。此外，美拉德反應能夠有效改善蛋白質抗氧化性[13-14]，其主要原因在于美拉德反應過程中產生類黑精等高級糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)。有研究發(fā)現，雞肉MP與不同還原糖(葡萄糖和麥芽糖)的美拉德反應產物，具有超氧陰離子自由基清除活性[13]。核糖作為一種五碳醛糖具有極強的還原性，可以作為糖基化反應的良好羰基供體。因此，利用核糖對MP進行糖基化修飾，有望獲得具有良好功能特性和抗氧化活性的產物。然而，核糖糖基化修飾對豬肉MP的功能特性和抗氧化活性有何影響，仍然需要深入研究，例如糖基化修飾時間對這些性質影響尚未見相關的研究報道。本研究從提高MP的功能特性和抗氧化活性角度出發(fā)，采用核糖對豬肉MP進行糖基化改性修飾，探究不同反應時間對糖基化產物的功能特性和抗氧化活性的影響，從而為有效改善MP功能特性和抗氧化性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬里脊肉、金龍魚食用大豆油,重慶市北碚區(qū)永輝超市；食品級D-核糖(純度98%),深圳一諾食品配料有限公司。

十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、DPPH、鄰二氮菲、鄰苯三酚，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；本研究所用其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

XHF-DY高速勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司；85-2型磁力攪拌器，鄭州長城科工貿有限公司；Synergy多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學儀器有限公司；UV-6100紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 MP的提取以及糖基化產物的制備

MP提取參照文獻方法[15]在4 ℃進行。取100 g 豬里脊肉糜，加入4倍體積10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(含0.1 mmol/L NaCl, 2 mmol/L MgCl2, pH 7.0)，勻漿后浸提30 min，在4 ℃、8 000 r/min條件下離心15 min，棄上清液；沉淀用4倍體積磷酸鹽緩沖液溶解、離心；重復操作3次，獲得MP。采用雙縮脲法測定MP含量，以牛血清白蛋白為標準蛋白。

MP溶解于0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液，質量濃度為10 mg/mL。核糖溶解于0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液，濃度為10 mg/mL。MP溶液100 mL與核糖溶液100 mL混合，并在85 ℃下反應0、1、3、6、24 h，反應后的樣品置于冰浴中，冷卻后進行分析。

1.3.2 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析

采用Laemmli方法對糖基化產物進行電泳分析。5 mg/mL的樣品溶液與4倍上樣緩沖液混合，沸水浴加熱2 min；取10 μL樣品加入泳道，在80 V恒壓條件下進行電泳2 h。濃縮膠質量分數為5%，分離膠質量分數為12%。電泳結束后，用考馬斯亮藍R-250染色，漂洗、脫色后拍攝電泳圖像。

1.3.3 褐變指數和高級糖基化終末產物測定

不同反應時間下的糖基化樣品溶解于10%質量分數(下同) SDS溶液中，蛋白質終質量濃度為5 mg/mL。由于褐變產物在420 nm處具有最大的吸光值，通過紫外分光光度計測定420 nm下的吸光值，進而測定糖基化樣品的褐變指數[16]。

采用文獻方法分析AGEs[17]。樣品用8 mol/L尿素稀釋50倍，向1 mL樣品中加入10 μL的1 mol/L二硫蘇糖醇，旋渦混勻，熒光分光光度計檢測，激發(fā)波長為350 nm，發(fā)射波長為450 nm，在500 nm 處讀取熒光強度。分析結果以熒光單位表示。

1.3.4 溶解性測定

參照NISHIMURA等[13]的方法，并稍作修改。稱取一定量的肌原纖維蛋白，溶解于Tris-HCl 緩沖溶液(40 mmol/L，pH 7.5，0.05 mol/L的NaCl)中，其終質量濃度為1.5 mg/mL。離心(10 000×g，4 ℃，15 min)后，通過雙縮脲法測定蛋白質濃度。糖基化肌原纖維蛋白的溶解性通過計算上清液蛋白質含量與樣品中的蛋白質含量的比值來表示。

1.3.5 乳化活性和乳化穩(wěn)定性測定

乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測定采用AGYARE等[18]的方法。采用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)稀釋待測樣品(蛋白質質量濃度1 mg/mL)；然后蛋白溶液與精煉大豆油混合(體積比，3∶1)，10 000 r/min條件下均質1 min；在0 min和靜止10 min，分別從樣品底部取出50 μL乳液于試管中，隨后加入0.1%的SDS溶液5 mL，混合均勻后，利用紫外分光光度計測定其500 nm波長處的吸光度(A0)。以0.1% SDS溶液作為空白，重復3次。乳濁液的乳化活性指數(emulsifying activity index，EAI)和乳化穩(wěn)定性(emulsion stability index，ESI)分別按公式(1)和公式(2)計算：

(1)

(2)

式中：A0，0 min時的吸光度；ρ，乳化前蛋白樣品的質量濃度(g/mL);φ，溶液中油的體積分數，0.25；ESI，乳化穩(wěn)定性；A10，乳液靜置10 min后的吸光度；N，稀釋倍數。

1.3.6 抗氧化活性分析

1.3.6.1 DPPH自由基清除活性的測定

配制濃度為20 μmol/L 的DPPH乙醇溶液，存于暗處待用。取1 mL DPPH乙醇溶液與2 mL樣品溶液(5 mg/mL，溶于0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液)混合，迅速置于暗處，室溫反應30 min，以無水乙醇作為空白對照，在517 nm處測定吸光值[19]。DPPH自由基清除活性的計算如公式(3)所示：

(3)

式中：ΔA空白，空白溶液吸光度；ΔA樣品，樣品溶液的吸光值。

1.3.6.2 羥自由基清除活性的測定

2 mL、0.75 mmol/L 的鄰二氮菲(溶于0.15 mol/L，pH 7.4磷酸鹽緩沖液)與2 mL、0.75 mmol/L 的FeSO4(溶于0.15 mol/L，pH 7.4磷酸鹽緩沖液)充分混合，隨后加入1 mL樣品(5 mg/mL，溶于0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液)和1 mL、0.01%(體積分數)的H2O2?；旌衔镌?7 ℃保溫60 min，在536 nm下測定吸收率[19]。計算如公式(4)所示：

(4)

式中：AS，樣品的吸光值；A1，鄰二氮菲、FeSO4和H2O2的對照溶液的吸光值；A0，鄰二氮菲和FeSO4的空白溶液的吸光值。

1.3.6.3 超氧陰離子自由基清除活性的測定

1.0 mL樣品(5 mg/mL，溶于0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液)與1.8 mL、50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.2)緩沖液混合。25 ℃下孵育10 min，加入0.1 mL、10 mmol/L的鄰苯三酚。在320 nm處測定吸光值，每隔0.5 min記錄吸光值，總觀測時間為4 min。樣品的鄰苯三酚氧化速率由吸收率曲線的斜率(A1)計算[19]?？瞻奏彵饺幼匝趸俾释ㄟ^1.0 mL 雙蒸水代替樣品(ΔA0)來測定。計算如公式(5)所示：

(5)

1.3.7 數據處理

每個試驗重復3次，結果表示為平均值±標準差。采用SPSS 22.0對實驗數據進行單因素方差分析和Pearson相關性分析，并用Duncan法進行事后多重比較。

2 結果與分析

2.1 反應時間對糖基化反應程度的影響

褐變強度可以反映出美拉德反應的進行程度。美拉德反應終末階段所產生的類黑精等褐色物質，可以通過測定420 nm處的吸光值來表示。在本研究中，MP糖基化產物的褐變強度隨反應時間的變化情況如圖1所示。在反應1 h時，褐變強度僅為0.098，表明美拉德反應仍處于初始階段。在3、6、24 h之后，MP糖基化產物的褐變強度顯著提高(P<0.05)，其褐變強度分別為0.295、0.708和1.977，所以隨著美拉德反應的進行，MP糖基化產物的褐變強度逐漸增強，反應時間為24 h時達到最高值。該結果與之前研究工作的報道結果一致，即MP通過美拉德反應進行糖基化修飾時，美拉德反應的高級產物的生成量不斷增加[20-21]。

圖1 不同反應時間下MP糖基化產物的褐變強度Fig.1 Browning intensity of glycosylated MP products at different reaction times注：不同字母代表各處理組之間具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

AGEs具有熒光特性，因此也可以通過測定MP糖基化產物的熒光強度來評估糖基化反應的程度[17]。本研究中，不同反應時間下MP糖基化產物的熒光強度變化如圖2所示。在反應初期1 h時，熒光強度較低。在3、6、24 h之后，MP糖基化產物的熒光強度顯著提高(P<0.05)?？傮w來看，MP糖基化產物熒光強度隨著反應時間的延長呈逐漸增加趨勢。VILLAVERDE等[17]發(fā)現，在MP與葡萄糖糖基化反應中，隨著糖基化反應時間的延長，熒光強度逐漸增大。

圖2 不同反應時間下MP糖基化產物的熒光強度Fig.2 Fluorescence intensity of glycosylated MP products at different reaction times

2.2 反應時間對糖基化產物分子質量的影響

SDS-PAGE分析常用于分析蛋白質亞基及分子質量變化情況[6]。本研究中，不同反應時間得到的MP糖基化產物的電泳圖如圖3所示。電泳分析表明，有分子質量更高的糖基化產物生成。此外，與未修飾的MP相比，隨著反應時間的延長，糖基化反應產物的各個亞基條帶逐漸減弱。在高溫糖基化反應過程中，蛋白質的交聯反應和熱降解反應可能同時發(fā)生[22]，而長時間高溫加熱會導致肌原纖維蛋白的部分降解[23]。有研究表明，明膠與葡萄糖糖基化產物在長時間高溫加熱條件下，導致明膠的熱降解，并釋放出一些低分子質量肽[24]。因此，推測長時間高溫熱處理可能會導致MP的部分亞基降解，表現為蛋白條帶減弱。這些結果暗示MP與核糖發(fā)生糖基化反應，反應產物分子質量增大。本研究發(fā)現，肌球蛋白、肌動蛋白、肌鈣蛋白等分子質量增加，這與前人報道的研究結果一致，即糖基化反應中參與的蛋白主要為肌球蛋白重鏈與肌動蛋白[6]。LIU等[6]研究鰱魚MP與葡萄糖和麥芽糖糊精的糖基化反應產物，電泳結果表明交聯后的反應產物分子質量增大，同時糖基化反應也導致MP的部分降解。

圖3 不同反應時間下MP糖基化產物的電泳圖Fig.3 Electropherogram of glycosylated MP products at different reaction times注：M-標準蛋白Marker；0、1、3、6、24 h-不同反應時間下 MP-核糖糖基化產物

2.3 反應時間對糖基化產物的溶解度的影響

作為蛋白質最重要的功能性質之一，溶解性與蛋白質的許多功能特性密切相關。有研究表明，糖基化改性修飾能夠提高肌原纖維蛋白的溶解性和利用效率[16]。不同反應時間下MP糖基化產物在低離子強度介質中(0.05 mol/L NaCl)的溶解度如圖4所示。與未糖基化的MP相比，糖基化反應1、3、6 h后，MP糖基化產物的溶解度隨著反應時間的延長呈逐漸增加趨勢(P<0.05)。類似地，SAEKI等[16]發(fā)現，在MP與葡萄糖糖基化反應中，在低離子強度下，隨著糖基化反應時間的延長，糖基化產物的溶解度呈增加趨勢。然而，在反應24 h時，MP糖基化產物的溶解度未顯著提高(P>0.05)，可能是由于較長的高溫處理引起MP的部分亞基降解，導致其溶解度降低。

圖4 不同反應時間下MP糖基化產物的溶解度Fig.4 The solubility of glycosylated MP products at different reaction times

2.4 反應時間對糖基化產物的乳化活性和穩(wěn)定性的影響

乳化活性是衡量蛋白質促進水包油型乳狀液形成能力的指標[27]。不同反應時間下MP糖基化產物的乳化活性如表1所示?？傮w而言，糖基化產物的乳化活性略高于未糖基化MP，由3.68 m2/g(0 h)上升到4.41 m2/g(1 h)，然而統(tǒng)計學上無顯著性差異(P>0.05)。在反應初始階段，接入少量的核糖使得糖基化反應產物具有兩親性，表面活性增大，從而提高乳化活性。然而，反應時間過長造成糖基化反應產物的親水能力進一步提高，進而削弱了其在油-水界面上的吸附能力，最終導致乳化能力未能顯著提高。

表1 不同反應時間下MP糖基化產物的乳化活性 和乳化穩(wěn)定性Table 1 Emulsifying activity and stability of glycosylated MP products at different reaction times

乳化穩(wěn)定性是指蛋白質維持乳化體系穩(wěn)定的能力，不同糖基化反應時間對MP乳化穩(wěn)定性的影響見表1。糖基化MP的乳化穩(wěn)定性呈現出先增加后降低的趨勢，在1 h后達到最高值98.25 min(P<0.05)。該現象的主要原因是糖基化MP增加了混合體系的黏度，導致油水界面上蛋白的吸附層厚度增加，進而阻止油滴聚集，最終使體系乳化穩(wěn)定性提高。但當糖基化程度過高時，蛋白親水能力的提高，削弱了其界面吸附能力且降低了界面張力，進而導致乳化穩(wěn)定性降低[4]。因此，糖基化的反應程度能夠影響MP的乳化性能，而糖基化早期階段能夠改善MP的乳化性能。然而，過高的糖基化反應程度會導致乳化性能的降低。因此，有必要將糖基化反應控制在初級階段，有利于改善MP的乳化性能的作用。

2.5 反應時間對糖基化產物抗氧化性的影響

2.5.1 DPPH自由基清除活性

當DPPH自由基與抗氧化物接觸后，抗氧化物可以提供氫原子與DPPH自由基結合，進而形成更加穩(wěn)定的分子[19]。在本研究中，前期預實驗的全波長掃描(200～600 nm)結果證明，美拉德反應產物的A420nm吸光值對3種自由基(DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基)清除活性評估影響可忽略。以未修飾的MP為對照，不同反應時間下MP糖基化產物的DPPH自由基清除活性如圖5所示。經過核糖糖基化修飾后，MP糖基化產物的DPPH自由基清除活性顯著提高(P<0.05)。在質量濃度為5 mg/mL時，反應6 h后，DPPH自由基清除活性達到最高(16.21%)。隨著反應時間的延長，一些具有抗氧化性的美拉德反應終末產物逐漸積累，進而抗氧化活性逐漸提高[28]。

圖5 不同反應時間下MP糖基化產物的DPPH 自由基清除活性Fig.5 DPPH radical scavenging activity of glycosylated MP products at different reaction times

2.5.2 羥自由基清除活性

羥自由基屬于活性氧的一種，是最活潑的自由基，能夠引起生物大分子損傷[19]。不同反應時間下MP糖基化產物的羥自由基清除活性如圖6所示?？偟膩碚f，MP及其糖基化產物對羥自由基的清除活性較低，該結果表明糖基化反應產物對羥自由基的清除能力有限。在5 mg/mL質量濃度下，不同反應時間的MP糖基化的羥基自由基清除率均高于MP。反應24 h后，羥自由基清除活性達到最高(10.07%)。其主要原因是美拉德反應過程中的中間產物和終末產物可以作為良好的供氫體，具有羥自由基清除能力。隨著美拉德反應時間延長，羥自由基清除能力也隨之增強[25]。

圖6 不同反應時間下MP糖基化產物的羥自由基清除活性Fig.6 Hydroxyl radical scavenging activity of glycosylated MP products at different reaction times

2.5.3 超氧陰離子自由基清除活性

超氧陰離子自由基清除能力可以用來評估MP糖基化產物的抗氧化性的強弱[26]。不同反應時間下MP糖基化產物的超氧陰離子自由基清除能力見圖7。與未糖基化修飾的MP相比，糖基化修飾后的反應產物具有較高的超氧陰離子自由基的清除活性。隨著糖基化反應的進行，超氧陰離子自由基的清除活性顯著提高(P<0.05)。在質量濃度為5 mg/mL時，不同反應時間的糖基化產物的清除率分別為38.60%(1 h)，42.39%(3 h)，44.94%(6 h)和45.32%(24 h)。這主要由于美拉德反應的高級階段形成的類黑精等AGEs具有超氧陰離子自由基的清除能力[29]。隨著糖基化反應的延長，具有抗氧化能力的美拉德反應產物不斷積累，進而在24 h之后達到最高。

圖7 不同反應時間下MP糖基化產物的超氧陰離子 自由基清除活性Fig.7 Superoxide anion scavenging activity of glycosylated MP products at different reaction times

2.6 相關性分析結果

由上述的結果可以發(fā)現，不同反應時間的MP糖基化產物具有不同的糖基化反應程度、乳化特性以及抗氧化活性，因此有必要進一步剖析糖基化反應程度與功能特性和抗氧化活性之間的相關性。Pearson相關性分析結果和相關性系數詳見表2。糖基化反應時間與褐變強度(r=0.994)和熒光強度(r=0.946)呈極顯著正相關，說明隨著反應時間的延長，糖基化反應程度逐漸加大。同時，褐變強度和熒光強度與抗氧化活性指標呈一定的正相關性(r>0.5)，主要是由于更多具有抗氧化活性的美拉德反應產物生成，進而造成其抗氧化活性提高。值得注意的是，MP的溶解度與其抗氧化性呈現極顯著正相關性(r>0.9)，主要是隨著MP糖基化的進行，形成了更多的糖蛋白，導致其溶解性提高。同時，隨著反應時間的延長，有更多的美拉德反應產物生成，進而其抗氧化活性提高。此外，MP糖基化產物的乳化活性與抗氧化活性指標呈顯著的正相關性(r>0.8)，由此可知，一定程度糖基化修飾可以同時改善MP的乳化活性和抗氧化活性。此外，抗氧化活性指標之間呈極顯著正相關(r>0.9)，說明MP糖基化產物對多種自由基均具有清除能力。

表2 反應時間、糖基化反應程度、溶解性、乳化特性以及抗氧化活性之間的相關性分析Table 2 Correlation among reaction time, degree of glycosylation reaction, solubility, emulsifying property and antioxidant activity

3 結論

通過探究不同反應時間對豬肉肌原纖維蛋白-核糖糖基化產物的糖基化反應程度、溶解性、乳化活性、乳化穩(wěn)定和抗氧化活性的影響，發(fā)現隨著時間的延長，MP糖基化反應程度增加，有高分子質量美拉德反應產物的生成，同時MP的部分亞基可能會發(fā)生降解。糖基化反應初級階段，可以有效地改善MP的溶解性、乳化性和乳化穩(wěn)定性；然而，長時間的糖基化反應會導致乳化性能的下降；隨著糖基化反應時間的延長，修飾產物的抗氧化活性逐漸提高，這主要歸因于產生了更多具有抗氧化活性的美拉德反應產物。因此，糖基化反應時間對MP產物的功能特性和抗氧化活性具有調控作用，可以據此進行精準糖基化修飾，以實現糖基化修飾后MP的應用目的。此外，糖基化產物的構效關系及產物的應用特性有待進一步研究。本研究為糖基化修飾MP改善其功能特性和抗氧化性提供理論依據。