李斌山，喬彩虹，張忠，畢陽(yáng)，梁偉，朱亞同，李子和

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)

隨著有害食品微生物對(duì)化學(xué)合成抑菌劑抗藥性的不斷增強(qiáng)，使得研發(fā)綠色環(huán)保的新型替代性抗菌物質(zhì)成為了食品研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題之一。精油存在于植物的根、莖、葉、樹皮、花和果實(shí)中[1]。精油最初的用途僅在制備香熏，化妝品等方面，但近年許多研究發(fā)現(xiàn)精油具有良好的抗菌活性，如丁香精油[2]、牛至精油[3]、百里香精油[4]等。由于精油具有的一些理化特性優(yōu)勢(shì)，使它能夠很好的與熏蒸處理結(jié)合，讓處理方式變得更加簡(jiǎn)單有效，而且能夠有效的解決合成抑菌劑在使用過程中引發(fā)的危害人體健康、污染環(huán)境和微生物抗藥性等問題。

柏科類植物資源豐富，組織富含精油，其精油在工業(yè)中多被用作調(diào)香原料，還可以應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域[5]。祁連圓柏(SabinaprzewalskiiKom.)為柏科(Cupress aceae)圓柏屬(Sabina)高大常綠針葉喬木，是我國(guó)特有的綠化樹種[6]。該樹種生長(zhǎng)于海拔2 600～4 300 m的陽(yáng)坡、半陽(yáng)坡，生態(tài)適應(yīng)幅度寬，抗逆性強(qiáng)，極耐高寒、干旱和土壤貧瘠，主要分布在青藏高原東北部和黃土高原的西部邊緣地帶[7-8]。許多在比較極端苛刻環(huán)境下生長(zhǎng)的生物反而能夠?yàn)槿祟愄峁┚哂兄匾獞?yīng)用價(jià)值的代謝物質(zhì)。周寶石[9]從祁連圓柏成熟果實(shí)的甲醇提取物中分離得到二萜類化合物，結(jié)果表明祁連圓柏果實(shí)可以作為二萜類化合物的天然資源寶庫(kù)。王文蜀等[10]從祁連圓柏的種子中分離出結(jié)構(gòu)為3α-hinokiol的二萜且該物質(zhì)對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(HO-8910)具有一定抑制作用。劉喜梅等[6]和劉林芳[7]研究發(fā)現(xiàn)海拔高度的變化對(duì)祁連圓柏葉揮發(fā)油成分及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)有一定規(guī)律性的影響。但有關(guān)祁連圓柏精油抑菌(細(xì)菌和真菌)活性的研究鮮見報(bào)道。

本文采用水蒸餾法提取祁連圓柏精油，并用GC-MS分析了祁連圓柏精油的主要化學(xué)成分；對(duì)該精油對(duì)多種食品腐敗真菌和細(xì)菌的抑菌活性進(jìn)行研究評(píng)價(jià)，旨在為柏科類植物天然抑菌劑的開發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

祁連圓柏(野生)，采自甘肅省天祝藏族自治縣祁連山區(qū)；4種采后果蔬腐敗真菌[互隔交鏈孢(Alternariaalternate) 、擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum) 、硫色鐮刀菌(Fusariumsulphureum) 、粉紅單端孢(Trichosporonroseum)]、2種革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)〗和2種革蘭氏陰性菌[糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)]均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

CN69M/FW80高效植物樣品粉碎機(jī)，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司；BS200S型電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；7890B GC-MS聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9272B型恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

將祁連圓柏枝葉去除較粗枝干，然后將枝葉剪為約0.5 cm的短枝，烘干(40 ℃、5 h)備用。

1.3.2 祁連圓柏精油的提取

取干燥后的祁連圓柏枝葉400 g，采用水蒸餾法提取精油。物料比為6∶1(g∶g)，蒸餾4 h，停止加熱，油水分離后油相用無(wú)水硫酸鈉脫水干燥，收集精油于棕色瓶?jī)?nèi)4 ℃保存待用。計(jì)算精油提取得率，計(jì)算公式(1)如下：

(1)

1.3.3 精油成分分析

采用GC-MS計(jì)算機(jī)聯(lián)機(jī)分析得到檢出成分，經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索譜庫(kù)，人工分析質(zhì)譜圖，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)資料對(duì)檢出成分進(jìn)行篩選鑒定，通過峰面積歸一法確定各組分的相對(duì)含量。

(1)樣品處理：液體直接進(jìn)樣，進(jìn)樣量2.0 μL。

(2)氣相色譜條件：色譜柱DB-17MS (30 m×250 mm，0.25 μm)，柱溫：50～250 ℃程序升溫。初始溫度為50 ℃，保持1 min，以4 ℃/min升至220 ℃，保持8 min，再以20 ℃/min升至250 ℃，保持2 min。進(jìn)樣口溫度為250 ℃，氦氣載氣，柱流量為1.0 mL/min，以分流方式進(jìn)樣，分流比為250 ∶1。

(3)質(zhì)譜條件：采用EI電離方式，電離能量70 eV，離子源溫度250 ℃，接口溫度230 ℃，分子質(zhì)量掃描范圍15～500 u。

按照本條件進(jìn)行正構(gòu)烷烴混合對(duì)照品C8～C20的GC-MS分析，以正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間計(jì)算祁連圓柏精油中各組分的保留指數(shù)(kovats index,KI)。計(jì)算公式(2)如下：

(2)

式中：tx，被分析組分流出峰的保留時(shí)間，min；tn，碳原子數(shù)為n的正構(gòu)烷烴流出峰的保留時(shí)間，min；tn+1，碳原子數(shù)為n+1的正構(gòu)烷烴流出峰的保留時(shí)間，min；且tn

1.3.4 精油抑菌活性的評(píng)價(jià)

1.3.4.1 培養(yǎng)基的制備

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯塊莖200 g，1 000 mL蒸餾水，煮沸30 min，4層紗布過濾，濾液加葡萄糖20 g、瓊脂18～20 g，補(bǔ)充蒸餾水至1 000 mL，裝入三角瓶滅菌備用。

液體培養(yǎng)基:牛肉膏0.9 g、蛋白胨3.0 g、NaCl 1.5 g、蒸餾水300 mL、pH 7.4～7.6，滅菌備用。

1.3.4.2 菌懸液的制備

真菌：分別將4種真菌在PDA中培養(yǎng)7 d后，在培養(yǎng)皿中加入無(wú)菌水約15 mL，用玻璃涂布棒刮取孢子，4層紗布過濾于50 mL的三角瓶中，充分振蕩，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，調(diào)至濃度為1×106～3×106CFU/mL備用。

細(xì)菌：將活化后的細(xì)菌接種于液體培養(yǎng)基，在搖床37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，備用。

1.3.5 祁連圓柏精油對(duì)真菌的抑菌效果

1.3.5.1 祁連圓柏精油對(duì)真菌菌落生長(zhǎng)的影響

參考HABA等[11]的方法并略做修改。在無(wú)菌條件下，將1.3.4.2中制備的菌懸液接種在對(duì)應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)皿蓋中心放入滅菌后的濾紙片(直徑為6 mm)，濾紙片上滴加6、12、24、48 μL的精油，使其在培養(yǎng)皿內(nèi)空間濃度分別為0.125、0.25、0.5、1 μL/mL，以無(wú)菌水做空白對(duì)照，密封倒置，28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫孵育7 d，以十字交叉法測(cè)定菌落直徑，取其平均值，試驗(yàn)重復(fù)3次。

按照濃度梯度測(cè)定最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)和最低殺菌濃度(minimum fungicidal concentration, MFC)。以48 h內(nèi)抑制率為100%精油濃度為其MIC；連續(xù)培養(yǎng)72 h，若仍沒有菌生長(zhǎng)，則為MFC。

1.3.5.2 祁連圓柏精油對(duì)真菌孢子萌發(fā)的影響

采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定孢子萌發(fā)率。在無(wú)菌條件下，用打孔器制取直徑為9 mm、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂培養(yǎng)基，置于滅菌載玻片上，滴加孢子懸浮液20 μL，再用滅菌鑷子夾取無(wú)菌濾紙片置于培養(yǎng)皿蓋中央，在濾紙片上分別滴加6、12、24、48 μL的精油，以無(wú)菌水作對(duì)照，于27 ℃孵育后鏡檢觀察孢子萌發(fā)情況，當(dāng)對(duì)照組孢子萌發(fā)率達(dá)到80%時(shí)開始計(jì)時(shí)。每次鏡檢100個(gè)真菌孢子，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。孢子萌發(fā)抑制率計(jì)算如公式(3)所示：

孢子萌發(fā)抑制率/%

(3)

1.3.5.3 祁連圓柏精油對(duì)真菌生物量的影響

在無(wú)菌條件下，將1×106CFU/mL菌懸液接種在鋪有玻璃紙的培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)皿蓋中心放入滅菌后的濾紙片，分別在濾紙片上滴加6、12、24、48 μL精油，使其在培養(yǎng)皿內(nèi)空間濃度分別為0.125、0.25、0.5、1 μL/mL，以無(wú)菌水做空白對(duì)照，密封倒置，在28 ℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫孵育7 d后取下玻璃紙，稱重，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 祁連圓柏精油對(duì)細(xì)菌的抑菌效果

采用濾紙片法測(cè)定不同濃度精油對(duì)4種細(xì)菌的抑菌圈直徑。用移液槍吸取150 μL(106～107CFU/mL)菌液，均勻涂布于培養(yǎng)基表面。將已滅菌的圓形濾紙片呈四邊形形狀鋪在培養(yǎng)基表面，每個(gè)培養(yǎng)皿中放4個(gè)濾紙片，再分別移取3、6、9、12 μL的精油滴在濾紙片上，每個(gè)培養(yǎng)皿只滴加同一個(gè)濃度的精油。將培養(yǎng)皿置于37 ℃的生化恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，十字交叉法測(cè)量抑菌圈的直徑，無(wú)菌水為對(duì)照，試驗(yàn)平行3次，記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果取重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值來(lái)評(píng)價(jià)抑菌效果。

用微量稀釋法測(cè)定精油對(duì)4種細(xì)菌的MIC和最低殺細(xì)菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)值[12]。將供試菌菌懸液與精油溶液置于96孔板孔內(nèi),使其精油濃度分別為150～0.29 μL/mL，置于37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察。順濃度梯度由大到小，第1個(gè)透明孔所對(duì)應(yīng)的濃度值為MIC。將濃度為MIC和2 MIC孔繼續(xù)培養(yǎng)24 h后觀察，透明孔所對(duì)應(yīng)的濃度值為MBC。無(wú)菌水為對(duì)照，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2013計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差(±SE)；采用SPSS Statistics 25.0 軟件進(jìn)行Duncan′s顯著性分析(P<0.05)；使用Origin 2017軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 精油提取得率

用水蒸餾法對(duì)祁連圓柏進(jìn)行精油提取，得到的精油為淡黃色的油狀液體，精油得率為2.83%。

2.2 精油的化學(xué)成分

從祁連圓柏精油中總共鑒別出47種化學(xué)成分(表1)，其中從已鑒定出的揮發(fā)精油化學(xué)成分類型看，主要成分為單萜烯類、倍半萜烯及其含氧衍生物，其他為少量的酯。其中相對(duì)含量較多的組分為檜烯(19.59%)、α-杜松醇(11.81%)、(-)-4-萜品醇(10.90%)、γ-松油烯(5.55%)、香茅醇(5.06%)、月桂烯(3.70%)和D-檸檬烯(3.34%)，占總成分的63.535%。此外，還有少量的酯類化合物，祁連圓柏精油可能是通過多種化學(xué)成分協(xié)同發(fā)揮作用從而產(chǎn)生抗菌效果。

表1 祁連圓柏精油揮發(fā)性成分Table 1 Volatile components of Sabina przewalskii Kom.essential oil

續(xù)表1

2.3 精油對(duì)真菌的抑菌活性

2.3.1 精油對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

隨著祁連圓柏精油處理濃度的增加，對(duì)真菌菌落生長(zhǎng)的抑制率逐漸增大(P<0.05)，說明祁連圓柏精油對(duì)4種真菌具有良好的抑制效果，且抑制效果與精油濃度密切相關(guān)(圖1)。在同一濃度處理下，精油對(duì)不同菌種的菌落生長(zhǎng)抑制率也不同，說明不同菌種對(duì)精油的耐受性不同。從4個(gè)濃度的抑菌效果可以看出(圖2)，青霉對(duì)精油的敏感性更強(qiáng)，根據(jù)精油對(duì)4種真菌菌落生長(zhǎng)的抑制作用由強(qiáng)到弱可以排序?yàn)椋簲U(kuò)展青霉﹥硫色鐮刀菌﹥粉紅單端孢﹥互隔交鏈孢。

圖1 精油處理對(duì)真菌菌落生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of essential oil treatment on fungal colony expansion

圖2 精油處理對(duì)真菌菌落生長(zhǎng)的抑制作用Fig.2 Essential oil treatment inhibited the colony growth of fungi注：大小寫字母分別代表組間和組內(nèi)差異顯著性(P<0.05)(下同)

2.3.2 精油對(duì)孢子萌發(fā)的影響

祁連圓柏精油處理有效抑制了4種真菌孢子的萌發(fā)，其抑制作用隨著祁連圓柏精油濃度的增加而逐漸增強(qiáng)(圖3)。同一濃度下，精油對(duì)4種菌孢子萌發(fā)的抑制作用差異性不大，不同濃度的處理下，精油對(duì)青霉孢子萌發(fā)的抑制效果最佳。當(dāng)精油處理濃度達(dá)到1 μL/mL時(shí)，對(duì)4種真菌的孢子萌發(fā)抑制率皆在60%以上。

圖3 精油處理對(duì)真菌孢子萌發(fā)的抑制作用Fig.3 Essential oil treatment inhibited fungal spore germination

2.3.3 精油對(duì)菌絲生物量積累的影響

祁連圓柏精油處理能夠顯著降低4種真菌的生物量(P<0.05)(圖4)，其抑制效果有著顯著的濃度依賴性，即隨著祁連圓柏精油處理濃度的增加，真菌的生物量顯著降低。當(dāng)精油處理濃度為1 μL/mL時(shí)，4種真菌中擴(kuò)展青霉的生物量最小。

a-互隔交鏈孢；b-擴(kuò)展青霉；c-硫色鐮刀菌；d-粉紅單端孢圖4 精油處理對(duì)真菌生物量的降低作用Fig.4 Essential oil treatment reduced the biomass of fungi

2.4 精油對(duì)細(xì)菌的抑制活性

祁連圓柏精油對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)以及革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、糞產(chǎn)堿桿菌)均有明顯的抑制作用(圖5)。而且，同一精油濃度對(duì)不同菌種的抑制效果不同。在精油等梯度濃度增加時(shí)，4種菌抑菌圈直徑變化的幅度也有差異，對(duì)糞產(chǎn)堿桿菌的抑制效果較好，抑菌圈直徑可達(dá)21.29 mm；而對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果較差，抑菌圈直徑為18.67 mm(表2)。

2.5 MIC值和MBC/MFC值

擴(kuò)展青霉和硫色鐮刀菌的MIC和MFC值分別為0.875、1 μL/mL，比互隔交鏈孢和粉紅單端孢的MIC和MFC值低，說明擴(kuò)展青霉和硫色鐮刀菌對(duì)精油的敏感性要強(qiáng)于互隔交鏈孢和粉紅單端孢。通過對(duì)4種細(xì)菌的MIC和MBC值的比較可以發(fā)現(xiàn)(表3)，2種革蘭氏陰性菌有較高的MIC和MBC值，這表明祁連圓柏精油對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果強(qiáng)于革蘭氏陰性菌。革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的MIC值都為2.34 μL/mL；革蘭氏陰性菌大腸桿菌和糞產(chǎn)堿桿菌的MIC值為4.68 μL/mL，是革蘭氏陽(yáng)性菌的2倍。大腸桿菌的MBC值為9.36 μL/mL，在4種供試菌中最高，表明祁連圓柏精油對(duì)大腸桿菌的抑制效果較差。

表2 祁連圓柏精油對(duì)4種細(xì)菌的抑制作用Table 2 Inhibitory effect of essential oil of Sabina przewalskii Kom. on four bacteria species

圖5 精油處理對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of essential oil treatment on bacterial growth

表3 MIC值和MBC/MFC值 單位：μL/mL

3 討論

精油是植物源天然產(chǎn)物中具有較強(qiáng)殺菌或抑菌活性的物質(zhì)，對(duì)于細(xì)菌、真菌等微生物都具有顯著的抑制作用，有替代傳統(tǒng)化學(xué)合成殺菌劑的潛力[13]，但某些植物由于其獨(dú)特的功效或特殊的生長(zhǎng)條件，使其自身價(jià)格昂貴。而柏科類植物資源豐富，生態(tài)適應(yīng)幅度寬，一般用作綠化植物，更適合作為精油提取的廉價(jià)材料。劉林芳[7]和劉喜梅等[14]發(fā)現(xiàn)不同海拔高度的祁連圓柏精油成分和含量存在差異性。本實(shí)驗(yàn)以天祝縣祁連圓柏為材料提取的精油得率為2.83%，且成分中共鑒別出47種化合物。在前人研究中發(fā)現(xiàn)，5種揮發(fā)精油化學(xué)組成存在差異，相同成分有7種，分別為α-蒎烯、γ-松油烯、(R)-(-)-4-萜品醇、大根香葉烯、(+)-δ-杜松烯、欖香醇和柏木腦,且這5種精油中α-蒎烯含量都在20%以上。而本實(shí)驗(yàn)所提取的精油成分中不含有α-蒎烯、(+)-δ-杜松烯、欖香醇和柏木腦，其他相同成分的含量也有很大差異。這說明不同地區(qū)及不同海拔高度的變化對(duì)祁連圓柏?fù)]葉油成分及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)有一定的影響，這可能是因?yàn)閾]發(fā)油的主要成分是單萜及其含氧衍生物和部分倍半萜類化合物，而萜類物質(zhì)的種類、質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)受到海拔高度、大氣溫度、薄霧天氣相對(duì)數(shù)量、太陽(yáng)輻射等環(huán)境因素的影響，所以會(huì)使精油成分種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)發(fā)生變化。

RYU等[15]研究發(fā)現(xiàn)刺柏針葉中木脂素類化合物具有一定抗炎、抗病毒等生物活性。蔣繼宏等[16]對(duì)6樹種的植物揮發(fā)油的抑菌活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明龍柏?fù)]發(fā)油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較好的抑制效果。DERWICH 等[17]對(duì)7種細(xì)菌進(jìn)行了體外抗菌活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)刺柏精油對(duì)供試細(xì)菌菌株表現(xiàn)出有效的殺菌活性，MIC為 0.02～0.40 mg/mL。本研究也發(fā)現(xiàn)，祁連圓柏精油對(duì)4種細(xì)菌均有一定的抑制作用，這與劉林芳[7]的研究結(jié)果一致，而且祁連圓柏精油對(duì)4種真菌(P.expansum、F.sulphureum、A.alternata及T.roseum)也具有抑制活性。植物精油具有較強(qiáng)抑菌活性的原因是成分中有酚類、萜烯類、醛酮類等物質(zhì)[18]。GARRE等[19]通過研究發(fā)現(xiàn)D-檸檬烯與熱處理結(jié)合能夠有效提高D-檸檬烯的抑菌活性。胡小剛等[20]研究發(fā)現(xiàn)R-和S-芳樟醇均具有良好的抗菌活性。本研究結(jié)果表明，祁連圓柏精油成分中含有大量的萜烯類物質(zhì)，其對(duì)4種真菌和4種細(xì)菌均有明顯的抑制作用，而D-檸檬烯、芳樟醇、丁香酚、香茅醇等物質(zhì)都在祁連圓柏精油中被檢測(cè)出來(lái)，結(jié)合丁華等[21]、郭峰等[22]發(fā)現(xiàn)丁香酚、香茅醇等物質(zhì)也具有抗菌功效，這能夠證實(shí)祁連圓柏具有抑菌活性的基礎(chǔ)，也可以作為精油單體提取優(yōu)先選擇的材料。雖然這幾種物質(zhì)含量占比不太高，但是微量成分在抗菌活性中也會(huì)有至關(guān)重要的作用，這可能是成分之間相互作用產(chǎn)生的協(xié)同作用[23]。綜合以上研究發(fā)現(xiàn)，柏科植物的抑菌效果具有普遍性，這為發(fā)現(xiàn)和開發(fā)柏科植物資源的利用價(jià)值提供新的思路。

4 結(jié)論

本研究所提取的祁連圓柏精油得率可達(dá)2.83%，經(jīng)GC-MS分析測(cè)定的主要成分為檜烯、α-杜松醇、(-)-4-萜品醇、γ-松油烯、香茅醇、萜品油烯、月桂烯、D-檸檬烯等物質(zhì)，占總成分的63.535%。該精油對(duì)4種果蔬腐敗真菌孢子萌發(fā)和菌落生長(zhǎng)均有較好的抑制活性，且抑制活性存在顯著濃度依賴性。對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌活性強(qiáng)于革蘭氏陰性菌。以上結(jié)果對(duì)祁連圓柏精油的開發(fā)利用提供依據(jù)，以期為開發(fā)天然綠色抑菌劑提供新材料。