孔梓璇，王巧莉，程志虹，贠建民，張紊瑋，趙風云

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，是生物體不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)之一，與生命活動有著密切的關(guān)系[1]。氨基酸可作為有機氮源，促進食用菌的生長，也可作為功能性物質(zhì)對機體生命活動產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用[2]。MEMMOTT等[3]研究發(fā)現(xiàn)，添加脯氨酸可以促進炭疽菌產(chǎn)生孢子。LEUNG等[4]通過在培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺，有效提高了冬蟲夏草中蟲草素和胞外多糖的含量。賁松彬等[5]在蛹蟲草液體培養(yǎng)基中添加精氨酸可顯著增加菌絲體的生物量及蟲草素產(chǎn)量。馬元偉等[6]通過在培養(yǎng)基中添加組氨酸和賴氨酸，使綠僵菌退化菌株的產(chǎn)孢及產(chǎn)色素能力恢復(fù)明顯。

草菇(Volvariellavolvacea)又稱稻草菇、中國蘑菇，是世界上最早人工栽培的大宗食用菌之一，子實體味道鮮美、營養(yǎng)豐富且富含多種生物活性物質(zhì)，深受消費者喜愛。同其他食用菌一樣，菌種退化是制約草菇產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的重要原因之一。草菇不耐低溫的特性使其無法像其他食用菌菌種一樣長期低溫保藏，故退化現(xiàn)象尤為嚴重。尋找一種簡單高效的退化菌株復(fù)壯方法是草菇產(chǎn)業(yè)亟需解決的關(guān)鍵問題。

課題組前期研究表明，草菇菌種在退化過程中，子實體中的多種氨基酸含量均呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢[7]。通過改變培養(yǎng)基的碳源，可有效復(fù)壯草菇退化菌種[8]。添加外源氨基酸能否對草菇退化菌種有復(fù)壯作用，目前尚未見報道。本研究以草菇V844及其退化菌株為實驗材料，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)中等量添加20種L-型氨基酸，考察不同氨基酸對退化菌種的影響；篩選出5種復(fù)壯效果較好的氨基酸進行外源添加，測定草菇菌絲體的生理特性、營養(yǎng)成分、活性氧含量、抗氧化酶活力等指標，為草菇及其他食用菌退化菌種的復(fù)壯研究提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基

1.1.1 供試菌株

草菇菌株V844原種(D0)，退化菌株(D1～D3)：由課題組前期通過組織分離繼代方式獲得[7]，D1：連續(xù)組織分離繼代6次，產(chǎn)量較D0降低18%；D2：連續(xù)組織分離繼代12次，產(chǎn)量較D0降低35%；D3：組織分離繼代18次，產(chǎn)量較D0降低67%。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

對照組PDA：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，KH2PO40.1%，MgSO40.1%，瓊脂粉2%，pH自然。處理組PDA：參照陳長蘭等[9]的方法，在PDA中分別添加20種L型氨基酸[丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)及纈氨酸(Val)]，每種氨基酸的添加量為0.2%。

1.2 生理指標測定

1.2.1 氣生菌絲密度

觀察記錄D0～D3在不同培養(yǎng)基中第3天的氣生菌絲生長狀況。

1.2.2 菌絲生長速度

參考安學明等[7]的方法測定。

1.2.3 菌絲生物量

參照宗元元[10]的方法：將玻璃紙裁剪成9 mm培養(yǎng)皿大小的圓形并滅菌處理，接種前將其覆蓋在凝固的PDA表面，待菌絲長滿平皿后小心將其取出，60 ℃ 烘干至恒重并稱重。

1.3 營養(yǎng)成分測定

將菌絲體進行凍干粉碎，測定各營養(yǎng)成分時，精確稱取菌絲體粉末0.5 g。

1.3.1 粗多糖含量

加入10 mL蒸餾水，90 ℃水浴3 h；4 000 r/min離心15 min，取上清液，沉淀部分按上述方法再次浸提，合并2次上清液，濃縮至2 mL；加入10 mL 80%乙醇溶液，4 ℃在超聲波清洗機中以100%功率處理60 min，8 000 r/min離心15 min，取沉淀部分，采用苯酚-硫酸法測定[11]。

1.3.2 粗蛋白質(zhì)含量

加入10 mL PBS，4 ℃在超聲波清洗機中以100%功率處理60 min，8 000 r/min離心15 min，取上清液，采用考馬斯亮藍法測定[12]。

1.3.3 黃酮含量

加入10 mL 80%乙醇溶液，25 ℃在超聲波清洗機中以100%功率處理60 min，8 000 r/min離心15 min，取上清液，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法測定量[13]。

1.3.4 多酚含量

加入10 mL 80%乙醇溶液，25 ℃在超聲波清洗機中以100%功率處理60 min，8 000 r/min離心15 min，取上清液，采用福林酚法測定[14]。

1.4 活性氧含量及抗氧化酶活力測定

采用羥胺反應(yīng)法測定[15]。

1.4.2 H2O2含量

采用分光光度計比色法測定[16]。

1.4.3 過氧化物酶(peroxidase，POD)活力

采用愈創(chuàng)木酚法測定[17]。

1.4.4 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力

采用氮藍四唑(nitro-blue tetrazolium，NBT)法測定[18]。

1.4.5 過氧化氫酶(catalase，CAT)活力

參照KATO等[19]的方法測定。

1.4.6 谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)活力

采用二硫代雙硝基苯甲酸直接法測定[20]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

以上試驗均重復(fù)3次，取平均值。采用Origin 2018軟件繪圖；SPSS 19.0進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 20種氨基酸對草菇菌絲體生理指標的影響

以D2作為初篩菌株，在PDA中分別添加20種氨基酸進行退化菌種復(fù)壯試驗，結(jié)果如圖1、圖2所示。從氣生菌絲密度、菌絲生長速度和菌絲生物量3個指標上看，Ser、Ala、Val、Leu、Pro的對菌絲生長有明顯的促進效果，Gly、Phe、Trp、Asn、Asp、Arg、Met、Ile、Thr、Gln的3個生理指標均優(yōu)于對照組；His、Glu、Cys、Lys、Tyr對菌絲生長有抑制作用，其中Cys、Lys、Tyr的抑制作用尤為明顯。

通過初篩，選擇5種(Ser、Ala、Val、Leu、Pro)復(fù)壯效果最佳的氨基酸對不同退化程度的草菇菌株D1～D3作進一步的研究。

2.2 五種氨基酸對菌絲生長速度及生物量的影響

測定D0～D3的菌絲體生長性狀，結(jié)果如圖3所示。菌絲生長速度、菌絲生物量均隨菌種退化程度的增加而逐漸降低；D3的菌絲生長速度、生物量較D0分別下降了36%、40%。外源添加5種氨基酸后，退化菌株D1～D3的菌絲生長速度、生物量均優(yōu)于對照組。5種氨基酸對草菇菌種生長性狀的影響由大到小依次是Ser>Ala>Val>Leu>Pro。Ser的復(fù)壯效果最佳，外源添加Ser后，相較于對照組，D1的菌絲生長速度和生物量分別增加了7%、10%，D2分別增加了24%、15%，D3分別增加了33%、30%。Ser對退化最嚴重菌株D3的復(fù)壯效果最佳。

圖1 20種外源氨基酸對草菇氣生菌絲密度的影響Fig.1 Effects of 20 kinds of exogenous amino acids on the mycelial density of Volvariella volvacea

圖2 20種外源氨基酸對草菇菌絲生長速度、生物量的影響Fig.2 Effects of 20 kinds of exogenous amino acids on growth rate and biomass of Volvariella volvacea

2.3 五種氨基酸對草菇菌絲體營養(yǎng)指標的影響

測定D0～D3菌絲體的營養(yǎng)成分，結(jié)果如圖4所示。隨著退化程度增加，草菇菌絲各營養(yǎng)成分含量均逐漸降低。D3的粗多糖、粗蛋白質(zhì)、多酚、黃酮含量比D0分別降低了43%、14%、15%、28%。外源添加5種氨基酸后，D0～D3的各營養(yǎng)成分含量均呈現(xiàn)不同程度的升高，Ser的促進作用最明顯。外源添加Ser后，D3的粗多糖、粗蛋白質(zhì)、多酚、黃酮含量較對照分別提高了17%、40%、3%、14%。

2.4 五種氨基酸對草菇菌絲體活性氧含量的影響

A-生長速度；B-生物量圖3 外源氨基酸對草菇菌絲生長速度和生物量的影響Fig.3 Effects of exogenous amino acids on growth rate and biomass of Volvariella volvacea

2.5 五種氨基酸對草菇菌絲體抗氧化酶活性的影響

測定D0～D3菌絲體內(nèi)抗氧化酶活力，結(jié)果如圖6所示。隨菌種退化程度的增加，抗氧化酶活力逐漸下降。與對照組相比，D3的POD、SOD、CAT、GPX活力分別降低了42%、84%、79%、59%。外源添加5種氨基酸后，D0的4種抗氧化酶活力沒有顯著變化(P>0.05)，而D1～D3呈現(xiàn)不同程度的增長。添加Ser后，D3菌株的POD、SOD、CAT、GPX活力分別提高了46%、60%、167%、92%。

3 結(jié)論與討論

食用菌菌種相當于作物的種子，菌種的質(zhì)量直接影響著食用菌的產(chǎn)量，但菌種退化是眾多食用菌共同存在的問題。目前，食用菌菌種復(fù)壯主要有尖端菌絲分離、單孢分離、分子選育、更換培養(yǎng)基配方等方法。食用菌培養(yǎng)一般選用PDA培養(yǎng)基，長期不更換培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)的組成，可能導(dǎo)致菌株對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收率降低，加速菌種退化。研究表明，適當更換培養(yǎng)基配方可有效復(fù)壯食用菌菌種。ROYSE等[21]在香菇培養(yǎng)基中添加0.6% CaCO3溶液，使其產(chǎn)量提高了24.9%；RODRIGUEZ ESTEADA等[22]在棉籽殼/鋸末基質(zhì)中添加150 μg/g Mn和250 μg/g Cu顯著提高了杏鮑菇產(chǎn)量；HOU等[23]在草菇栽培的噴水期用0.02% NaAc處理基質(zhì)，使得產(chǎn)量增加了16.25%。REN等[24]在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加Na2SeO3(7 mg/L)，使得蛹蟲草的菌絲體生物量提高了35.1%。外源氨基酸作為有機氮源，能在一定程度上刺激菌絲的代謝，促進草菇菌株的生長。除此之外，氨基酸在生物體抗衰老方面也發(fā)揮著重要作用[2]。草菇中的氨基酸含量較高，是其主要的鮮味物質(zhì)。本研究擬在不引入其他外源物質(zhì)的前提下，復(fù)壯草菇退化菌種。結(jié)果表明，通過外源添加Ser，可顯著改良草菇退化菌株的菌絲體生理指標(圖1～圖3)，增加菌體營養(yǎng)成分(圖4)，降低了活性氧的積累(圖5)并提高了抗氧化酶的活性(圖6)。

A-粗多糖；B-粗蛋白質(zhì)；C-黃酮；D-多酚圖4 外源氨基酸對草菇菌絲體粗多糖、粗蛋白質(zhì)、黃酮、多酚含量的影響Fig.4 Effects of exogenous amino acids on polysaccharide, protein content, flavonoid content and polyphenol content of Volvariella volvacea mycelium

圖5 外源氨基酸對草菇菌絲含量的影響Fig.5 Effects of exogenous amino acids on and H2O2 content of Volvariella volvacea mycelia注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

自然界中發(fā)現(xiàn)或人工分離的氨基酸有300多種。構(gòu)成蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的氨基酸只有20種，且均為L-型氨基酸。本研究在培養(yǎng)基中等量添加20種L-型氨基酸以復(fù)壯草菇退化菌種。20種氨基酸的含氮量為7.7%～32.2%，理論上都能作為氮源促進草菇的生長。但實驗結(jié)果表明，有5種氨基酸(His、Glu、Cys、Lys、Tyr)反而抑制了草菇菌絲體的生長性狀。特別是培養(yǎng)基中添加了Cys、Lys、Tyr后，草菇菌絲生長極為緩慢，說明氨基酸在草菇生長發(fā)育過程中可能擔負著復(fù)雜的生理功能。His在組氨酸脫羧酶的催化下易脫羧產(chǎn)生組胺，組胺對細胞具有毒性[25]，組胺的積累可能導(dǎo)致草菇菌絲細胞的增殖能力下降，從而抑制草菇菌絲的生長。Cys極易氧化，外源添加Cys后，可能會導(dǎo)致培養(yǎng)基中溶解氧的含量下降，抑制菌體生長。林必桂等[26]研究發(fā)現(xiàn)Lys可以通過抑制銅綠微囊藻細胞的 Ca2+Mg2+-ATPase活性以抑制銅綠微囊藻的生長。潘凱等[27]研究發(fā)現(xiàn)Tyr對黃瓜枯萎病病原菌有明顯抑制作用。Lys和Tyr對草菇菌絲生長抑制作用的具體機理，還有待進一步研究。

A-POD；B-SOD；C-CAT；D-GPX圖6 外源氨基酸對草菇菌絲體POD、SOD、CAT、GPX活性的影響Fig.6 Effects of exogenous amino acids on POD, SOD, CAT and GPX activities of Volvariella volvacea mycelium

L-絲氨酸是哺乳動物的非必需氨基酸，在氨基酸代謝中處于中間位置，是機體內(nèi)甘氨酸和半胱氨酸的前體，具有許多重要的生物學功能[28]。Ser能夠進入一碳循環(huán)，生成一碳單位，一碳單位如甲基能夠參與嘌呤等重要物質(zhì)的合成，而嘌呤能夠促進香菇菌絲生長[29]。Ser在本研究中也顯著提高了草菇退化菌株的菌絲生長速度和菌絲生物量(圖3)。有研究表明，Ser可以轉(zhuǎn)化為甘氨酸，進入一碳代謝，調(diào)節(jié)甲硫氨酸通路[30]，同時為細胞提供還原力，產(chǎn)生還原型輔酶Ⅱ和谷胱甘肽[31]。Ser是連接糖酵解、谷胱甘肽合成循環(huán)的中間節(jié)點，補充Ser可改善谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)，減少氧化自由基的產(chǎn)生，防止自由基對細胞的損傷，從而降低氧化應(yīng)激水平[32]。本研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加Ser后，退化菌株的活性氧含量積累減少(圖5)，抗氧化酶如POD、SOD、CAT、GPX的活力增加(圖6),有效復(fù)壯了草菇退化菌種的菌絲特性。本研究為草菇及其他食用菌退化菌種的復(fù)壯研究提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。