朱仁威，敦惠瑜，劉婷，陸俊*

1(銅仁學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，貴州 銅仁，554300)2(中南林業(yè)科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙，410003) 3(中國(guó)檢驗(yàn)認(rèn)證集團(tuán)湖南有限公司，湖南 長(zhǎng)沙，410003)

粥是中國(guó)獨(dú)特的飲食之一，歷史悠久，傳統(tǒng)的粥大多由五谷雜糧熬制而成。研究表明,有色米及雜糧比普通白色大米及淺色品種雜糧的營(yíng)養(yǎng)成分尤其是多酚類化合物更加豐富[1]，如黑米平均的黃酮含量為0.305 g/100g，分別比紅米和白米高17倍和33倍[2]，黑米還富含矢車菊素類和芍藥素類活性成分[3-4]，使黑米具有抗氧化、抑菌、防治貧血[5]、抗衰老、抑制動(dòng)脈粥樣硬化[6]等多種生理功能。目前，人們對(duì)熬粥的食材種類搭配和口感關(guān)注較多，而忽略了不同原料之間的配比對(duì)粥營(yíng)養(yǎng)成分的影響，且目前的研究大多局限于對(duì)粥原材料的分析，缺乏對(duì)原材料加工成粥之后、經(jīng)過(guò)人體消化后的影響的研究。有研究表明，復(fù)合谷類粥比普通米粥有更強(qiáng)的自由基清除能力，復(fù)合米粥更具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和研究?jī)r(jià)值[7]。APEA-BAH等[8]對(duì)高粱豇豆粥和玉米大豆粥研究發(fā)現(xiàn)體外模擬胃腸消化提高了其總酚和類黃酮的含量及抗氧化活性。為了使日常米粥可以最大限度在人體內(nèi)發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)保健作用，需要進(jìn)一步研究不同比例不同原料中的活性物質(zhì)在加工過(guò)程中是否具有相互作用以及人體消化過(guò)程對(duì)其生物活性的影響。

因此，本實(shí)驗(yàn)以黑米為基本原料，與高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、有一定抗氧化能力的黑麥、黑豆、紫米、紅米這4種作物分別熬制復(fù)配營(yíng)養(yǎng)米粥。采用胃腸體外模擬消化，研究消化前后不同種營(yíng)養(yǎng)米粥中多酚、黃酮及花青素的含量、抗氧化活性的變化，以及不同原材料再加工過(guò)程中的相互影響，為今后有色米粥的開(kāi)發(fā)利用提供一定的借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米、紫米、紅米產(chǎn)地均為陜西漢中洋縣，黑麥產(chǎn)地為山東臨沂，黑豆產(chǎn)地為貴州安順。胃蛋白酶(800～2 500 U/mg)、豬胰酶、膽鹽，美國(guó)Sigma公司；福林酚試劑，上海源葉股份有限公司；沒(méi)食子酸、兒茶素，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DPPH，日本TIC有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JRC-2000超聲波清洗機(jī)，濟(jì)寧市潤(rùn)通超聲電子有限公司；JP-150A-8高速多功能粉碎機(jī)，永康式久品工貿(mào)有限公司；101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；UV1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 米粥的熬制

黑米、黑麥、黑豆、紫米、紅米在水中浸泡2 h，按配方搭配混合(每份粥原料總重80 g，以質(zhì)量比1∶1、3∶1、5∶1將黑米分別與黑麥、黑豆、紫米、紅米混合)，每份加入400 mL水，用電飯鍋熬粥功能煮開(kāi)后再熬制1 h，冷卻后的成品粥在-50 ℃下冷凍干燥72 h后裝于樣品袋置于-20 ℃保存待用。

1.3.2 米粥的模擬胃腸消化

參考陸俊等[9]的方法，稱取10 g凍干樣品，加入去離子水使總重達(dá)到110 g并攪拌均勻，用1 mol/L HCl將樣品懸濁液pH值調(diào)至2.0，再加入0.5 mL模擬胃液(0.5 g胃蛋白酶溶于5 mL 0.01 mol/L HCl)，用錫紙將錐形瓶包好以避光，充入氮?dú)夂笤?7 ℃的恒溫水浴搖床中模擬胃消化2 h。第二階段是模擬腸消化，向懸濁液中加入1 mol/L NaHCO3至pH值為7.0，加入1 mL模擬腸液(4 g胰酶、25 g膽汁提取物溶于1 L 0.1 mol/L NaHCO3緩沖溶液)，包好錫紙，充入氮?dú)夂笤?7 ℃的恒溫水浴搖床中消化2 h，4 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.3.3 米粉和米粥提取液的制備

米粉和米粥提取液的制備參考SUN等[10]的方法并適當(dāng)修改。首先按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的配比進(jìn)行各種樣品的混合，其中原料米粉進(jìn)行粉碎并過(guò)40目篩。再取1 g粉碎好的米粉或米粥樣品放入錐形瓶中，加入20 mL含0.1% HCl的70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇溶液超聲40 min(功率500 W，40 kHz)，以4 000 r/min離心15 min，取上清液，沉淀加10 mL酸化甲醇重復(fù)上述步驟，合并2次所得提取液備用。

1.3.4 總酚、總黃酮和花青素的測(cè)定

1.3.4.1 多酚的測(cè)定

多酚含量的測(cè)定采用福林-酚試劑比色法，參照BURSAL等[11]的方法。取250 μL樣品提取液置于25 mL的比色管中，用蒸餾水定容至23 mL，再加入500 μL 的福林酚試劑和300 μL 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的碳酸鈉溶液，靜置30 min，在760 nm處用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度。以100 g干樣品中的毫克沒(méi)食子酸當(dāng)量(gallic acid equivalent,GAE)(mg GAE/100g DW)表示樣品中多酚的含量。

1.3.4.2 黃酮的測(cè)定

參照Z(yǔ)IELINSKI等[12]采用的亞硝酸鈉-氯化鋁法測(cè)定黃酮并稍作修改。取250 μL樣品提取液置于5 mL的離心管中，加2 720 μL的30%(體積分?jǐn)?shù))乙醇，再加120 μL亞硝酸鈉溶液(0.5 mol/L)，搖勻，反應(yīng)5 min后，加120 μL氯化鋁(10%,質(zhì)量分?jǐn)?shù))反應(yīng)5 min，再加800 μL 1 mol/L NaOH溶液，在510 nm處測(cè)吸光度，30%乙醇空白調(diào)零，以100 g干樣品中毫克兒茶素當(dāng)量(catechin equivalent)(mg CE/100g DW)計(jì)算黃酮含量。

1.3.4.3 花青素的測(cè)定

參考LEE等[13]的方法，采用pH示差法測(cè)定花青素的含量。分別用pH 1.0的HCl-KCl緩沖液和pH 4.5的CH3COOH-CH3COONa緩沖溶液適當(dāng)稀釋。在20～50 min內(nèi)，分別在520、700 nm處測(cè)吸光度值，以蒸餾水做空白對(duì)照?；ㄇ嗨睾坑?jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：A=(A520nm-A700nm)pH1.0-(A520nm-A700nm)pH 4.5；MW(分子質(zhì)量)=449.2 g/mol，矢車菊-3-葡萄糖苷的分子質(zhì)量；DF=稀釋倍數(shù)；ε=26 900 L/(mol·cm)，矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)。

1.3.5 協(xié)同抗氧化活性的研究

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

DPPH自由基清除能力參照周瑋婧等[14]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5.2 等輻射分析圖的繪制

參考劉瑾等[15]的方法繪制等輻射分析圖，將單一食材粥清除DPPH自由基的IC50標(biāo)于橫、縱坐標(biāo)，用A、B表示；連接2個(gè)IC50值即得相加效應(yīng)線；依據(jù)劑量-效應(yīng)回歸方程得出95%的置信區(qū)間，并使之相連；根據(jù)公式(2)計(jì)算理論復(fù)配值(IC50 add)將實(shí)際測(cè)量值(IC50 mix)與理論值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較分析，利用等效線圖解法對(duì)復(fù)配米粥食材之間的相互作用進(jìn)行分析。

(2)

式中：R為A、B 2種原料單獨(dú)應(yīng)用時(shí)的效價(jià)比，即R=IC50 A/IC50 B；P1為原料A在復(fù)配組中所占的比例；P2為原料B在復(fù)配組中所占的比例，P2=1-P1。

1.3.5.3 相互作用指數(shù)(γ)

參考丁煌等[16]的方法，用γ來(lái)評(píng)價(jià)2種原料間協(xié)同或拮抗作用的程度，計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：IC50 Amix、IC50 Bmix分別為復(fù)配組中A、B 2種粥中的IC50值；IC50 A、IC50 B分別為A、B 2種粥單獨(dú)作用時(shí)的IC50值。若γ=1，表示相互作用為相加；若γ<1，表示相互作用為協(xié)同；γ值越小說(shuō)明協(xié)同作用越強(qiáng)；若γ>1，表示相互作用為拮抗。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

利用GraphPad Prism7.0進(jìn)行IC50值的計(jì)算，利用SPSS 20軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05則認(rèn)為有顯著性差異，P<0.01則認(rèn)為有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 米粥原材料中多酚、黃酮和花青素含量

單一的5種食品原料和12種復(fù)配的米粥原料粉碎后經(jīng)酸化甲醇提取，原料粉提取液中多酚、黃酮和花青素的含量如圖1所示。大部分不同配方的原料在抗氧化成分含量上存在顯著性差異(P<0.05)。復(fù)配前的5種原料粉中，以黑米的多酚和黃酮含量最高。與陸俊等[9]的研究結(jié)果一致。復(fù)配后的多酚和黃酮含量大于2種單一原料而小于2種原料相加(除黑米黑豆以質(zhì)量比為3∶1的多酚含量最多外)。此外，黑米紫米、黑米黑麥和黑米紅米配方中3個(gè)比例的多酚含量均隨著黑米比例占比的增加而增多。對(duì)于花青素含量，則是黑米紫米質(zhì)量比為1∶1的配方最高(圖1-c)，這與紫米中含有較豐富的花青素含量有一定關(guān)系。

a-多酚含量；b-黃酮含量；c-花青素含量圖1 不同原料粉中多酚、黃酮和花青素含量Fig.1 The cotent of phenolics, flavonoids and anthocyanin in different material powder注：圖中同一柱形圖的不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)， 相同字母表示無(wú)顯著性差異(P>0.05)(下同)

2.2 有色米粥模擬體外消化前后多酚、黃酮和花青素含量

如圖2～圖4所示，經(jīng)過(guò)熬制成粥后，3種活性成分含量均明顯低于未熬制前的含量，這可能是由于熬制過(guò)程中高溫破壞了部分活性成分所致。熬制成粥后再經(jīng)過(guò)模擬體外消化，17種粥的3種抗氧化活性成分多酚、黃酮含量相對(duì)于未消化均顯著提高。對(duì)于單一原料熬制的5種粥，以黑米粥多酚含量最高[(324.38±2.245) mg/100g DW]。對(duì)于復(fù)配米粥，以黑米黑豆粥的多酚含量增長(zhǎng)最多，且在4種復(fù)配粥中不同質(zhì)量比的米粥消化后多酚含量提升的程度也明顯不同，除黑米黑麥粥消化后多酚含量最多的質(zhì)量比為1∶1外，其余的黑米紫米粥、黑米黑豆粥和黑米紅米粥消化后多酚含量均為質(zhì)量比3∶1的最高。對(duì)于體外模擬消化后各樣品的黃酮含量，4種原料單獨(dú)熬制的米粥也以黑米最高。復(fù)配后黑米紫米粥和黑米黑豆粥消化后黃酮含量接近于組成原料中黃酮含量的加和。其中以黑米紫米質(zhì)量比3∶1的配方黃酮含量最高[(1 409.97±2.648) mg/100g DW]，顯著高于黑米和紫米單獨(dú)熬制的粥中的黃酮含量。而黑米黑麥粥和黑米紅米粥2種粥的3個(gè)配方中的黃酮含量均低于各自組成原料中黃酮含量的加和。原因可能是消化環(huán)境使多酚和黃酮的的存在形式發(fā)生改變，從而使其進(jìn)一步釋放[17]。這與APEA-BAH等[8]的研究結(jié)果相似，經(jīng)過(guò)體外胃腸道消化的粥，總酚和類黃酮的含量能顯著提高，自由基清除活性等抗氧化能力增強(qiáng)。就花青素含量而言，5種原料單獨(dú)熬制的米粥和12組復(fù)配米粥模擬體外消化后，花青素含量與各自未消化組別相比均呈下降趨勢(shì)。王月華等[18]對(duì)藍(lán)靛果模擬體外消化后花青素含量降低了67.6%，而總酚含量增加了48.2%，變化趨勢(shì)與本實(shí)驗(yàn)相似。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是腸消化過(guò)程的堿性環(huán)境使得花青素不穩(wěn)定而被降解。但值得注意的是復(fù)配的黑米黑麥粥和黑米紅米粥無(wú)論消化與否，與其單一原料的花青素相比，復(fù)配后花青素含量呈顯著增加趨勢(shì)。其原因有待進(jìn)一步研究。

2.3 復(fù)配米粥消化前后DPPH自由基清除能力

5種單一食材及不同復(fù)配粥消化后清除DPPH自由基活性見(jiàn)表1。17種粥經(jīng)過(guò)模擬消化后，其清除DPPH自由基的活性均比消化前有了顯著的提升。消化前的單食材粥中，以紅米粥的活性最強(qiáng)(IC50=3.12 mg/mL)，經(jīng)過(guò)模擬人體胃腸消化后黑麥粥的活性最強(qiáng)。而消化前的復(fù)配粥中，分別以黑米紅米粥活性最好，經(jīng)過(guò)模擬消化后，以黑米黑麥質(zhì)量比1∶1的活性最高。這可能是由于很多活性成分在酶或酸堿性環(huán)境下被釋放出來(lái)，如消化酶也可能將部分多酚分解或轉(zhuǎn)化，從而提高抗氧化性，產(chǎn)生了更好的抗氧化活性[19]，使其IC50值顯著小于模擬體化消化前的IC50值。

A-黑米紫米；B-黑米黑麥；C-黑米黑豆；D-黑米紅米圖2 不同配方米粥模擬體外消化前后多酚含量 Fig.2 The content of polyphenolics of different composite rice porridge before(after) simulated digestion in vitro

A-黑米紫米；B-黑米黑麥；C-黑米黑豆；D-黑米紅米圖3 不同配方米粥模擬體外消化前后黃酮含量Fig.3 The content of flavonoids of different composite rice porridge before(after) simulated in vitro

A-黑米紫米；B-黑米黑麥；C-黑米黑豆；D-黑米紅米圖4 不同配方米粥模擬體外消化前后花青素含量Fig.4 The content of anthocyanin of different composite rice porridge before(after) simulated digestion in vitro

表1 單一和復(fù)配粥模擬體外消化前后清除DPPH 自由基的IC50值Table 1 The IC50 value of DPPH radical scavenging ability of single(composite) porridge before and after simulated digestion in vitro

2.4 Isobologram法分析復(fù)配黑米粥評(píng)價(jià)不同食材之間的相互作用

根據(jù)表1所得的IC50值繪制復(fù)配黑米粥消化前后的等輻射分析圖，結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。消化前，黑米紫米粥和黑米紅米粥的2種配方的效應(yīng)點(diǎn)均落在相加線的95%可信限下方(左側(cè))，表明這2種食材搭配熬制的粥所含的抗氧化成分有較強(qiáng)的協(xié)同抗氧化作用。與之相反，黑米黑豆粥的效應(yīng)點(diǎn)均落在相加線的95%可信限的上方(右側(cè))，表明這兩者之間是拮抗作用。黑米黑麥粥在質(zhì)量比為1∶1和3∶1時(shí)有協(xié)同抗氧化作用，5∶1時(shí)則表現(xiàn)為拮抗作用。這些差異可能是由各食材中的不同抗氧化活性物質(zhì)發(fā)揮協(xié)同或拮抗作用所導(dǎo)致的。盛雪飛[20]研究了6種黃酮類化合物在不同濃度下的協(xié)同抗氧化作用，發(fā)現(xiàn)一些類黃酮單體單獨(dú)作用時(shí)具有很好的抗氧化活性，與其他類黃酮單體組合時(shí)，則具有良好的協(xié)同效應(yīng)，因此，推測(cè)本實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的協(xié)同抗氧化作用也可能是由于不同原料中包含黃酮在內(nèi)的多酚類化合物相互作用的結(jié)果。

模擬體外消化后，呈現(xiàn)協(xié)同抗氧化作用的營(yíng)養(yǎng)米粥種類減少，只有黑米紫米粥3∶1、黑米紫米粥5∶1、黑米黑麥粥3∶1仍然呈現(xiàn)協(xié)同抗氧化作用、而模擬消化前為拮抗作用的黑米紅米粥3∶1消化后則呈現(xiàn)協(xié)同抗氧化作用。其他組的仍為拮抗作用，由此可見(jiàn)，體外模擬消化處理對(duì)復(fù)配米粥的相互作用效果產(chǎn)生了顯著的影響。

2.5 復(fù)配米粥的相互作用指數(shù)γ

按照上述方法及相應(yīng)公式計(jì)算復(fù)配組理論上的IC50 add值和γ，對(duì)理論IC50 add值和實(shí)驗(yàn)IC50 mix值在95%置信區(qū)間進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 四種復(fù)配米粥體外模擬消化前后相互作用指數(shù)Table 2 The interaction index of four kinds of composite black rice porridge before and after simulated digestion in vitro

消化前復(fù)配米粥的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果如表2所示，經(jīng)過(guò)t檢驗(yàn)證明理論IC50 add值和實(shí)驗(yàn)值IC50 mix值有顯著性差異。黑米紫米粥和黑米紅米粥的γ都<1，橫向比較發(fā)現(xiàn)IC50 mix值均小于IC50 add值，表明黑米紫米粥和黑米紅米粥都是協(xié)同抗氧化作用。黑米紫米粥質(zhì)量比為1∶1時(shí)γ最小，協(xié)同抗氧化作用最強(qiáng)，黑米紅米粥的配比為5∶1時(shí)γ最小，協(xié)同作用最強(qiáng)。黑米黑麥粥為1∶1、3∶1時(shí)的IC50 mix值小于IC50 add值，呈現(xiàn)協(xié)同作用。黑米黑豆粥的IC50 mix值均大于IC50 add值，且質(zhì)量比為1∶1時(shí)拮抗作用最強(qiáng)。經(jīng)過(guò)消化處理后，呈現(xiàn)抗氧化協(xié)同作用的米粥配方為黑米紫米粥3∶1、5∶1，黑米黑麥粥3∶1及黑米紅米粥3∶1的IC50 mix值小于IC50 add值，且γ<1。營(yíng)養(yǎng)米粥的抗氧化成分相互作用的等輻射分析與相互作用指數(shù)分析結(jié)果是一致的。

a-黑米紫米復(fù)配粥；b-黑米黑麥復(fù)配粥；c-黑米黑豆復(fù)配粥；d-黑米紅米復(fù)配粥；圖5 體外模擬消化前4種復(fù)配米粥的Isobologram分析圖Fig.5 Isobologram analysis of four kinds of composite rice porridge before simulated digestion in vitro注：相加線上的矩形()代表理論IC50 add值，實(shí)心點(diǎn)()代表實(shí)驗(yàn)IC50 mix值(下同)

a-黑米紫米復(fù)配粥；b-黑米黑麥復(fù)配粥；c-黑米黑豆復(fù)配粥；d-黑米紅米復(fù)配粥圖6 體外模擬消化后4種復(fù)配米粥的Isobologram分析圖Fig.6 Isobologram analysis of four kinds of composite black rice porridge after simulated digestion in vitro

對(duì)比消化后4種復(fù)配米粥，當(dāng)黑米紫米粥、黑米黑麥粥、黑米紅米粥的質(zhì)量比為3∶1時(shí)γ最小，協(xié)同作用最強(qiáng)。由此可得出，消化前黑米紅米粥的協(xié)同作用最為顯著，消化后黑米紫米粥的協(xié)同作用更好，尤其是質(zhì)量比為3∶1時(shí)最好。因此在熬制這4種復(fù)配米粥時(shí)以黑米與其他食材質(zhì)量比為3∶1時(shí)可呈現(xiàn)更好的抗氧化作用。

3 結(jié)論

體外模擬消化對(duì)5種單一原料的粥和12種不同配方的復(fù)配黑米粥的抗氧化活性成分及抗氧化活性產(chǎn)生了顯著影響。熬制成粥后會(huì)導(dǎo)致活性成分含量的下降，但經(jīng)過(guò)體外消化處理后，米粥的多酚、黃酮的含量均較消化前顯著提高，花青素含量則有所下降，清除DPPH自由基的IC50值均明顯減小，抗氧化活性增強(qiáng)。等輻射分析圖和相互作用指數(shù)的結(jié)果都表明按質(zhì)量比進(jìn)行配比得到的復(fù)配米粥的協(xié)同抗氧化程度有明顯差異。經(jīng)過(guò)消化處理后，復(fù)配米粥的抗氧化協(xié)同作用均有減弱趨勢(shì)，但黑米紫米粥、黑米黑麥粥和黑米紅米粥均在質(zhì)量比為3∶1時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的協(xié)同抗氧化作用，黑米黑豆粥在3種比例下均表現(xiàn)為拮抗作用。因此在熬制復(fù)配米粥時(shí)以黑米與紫米、黑麥、紅米質(zhì)量比為3∶1復(fù)配時(shí)可呈現(xiàn)更好的抗氧化作用，不建議將黑米與黑豆搭配食用。米粥中產(chǎn)生協(xié)同抗氧化作用的物質(zhì)尚不明確，體外模擬與人體真實(shí)的消化吸收也存在一定差異，有待進(jìn)一步研究探索。