李紅麗，吳曉琴，趙博，候美玲，吳彥蕾，黃先亮

(重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶，401120)

UPLC-MS/MS因分析效率、準(zhǔn)確度和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于獸藥殘留的檢測(cè)[1-4]。但由于動(dòng)物性食品基質(zhì)復(fù)雜，含蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、肽類(lèi)、胺類(lèi)及等內(nèi)源性干擾物[5-6]及前處理過(guò)程中引入的無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)酸、塑化劑等外源性雜質(zhì)[7]，會(huì)增強(qiáng)或抑制待測(cè)物在電噴霧接口處的離子化效率[8-9]，對(duì)待測(cè)物產(chǎn)生一定的干擾，影響檢測(cè)的選擇性和靈敏度，從而導(dǎo)致分析結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度受到不同程度的影響，這一過(guò)程稱(chēng)為基質(zhì)效應(yīng)[10-11]。2001年，美國(guó)食品和藥物管理局指出，在LC-MS/MS的方法開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證過(guò)程中，需評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)[12]。

本文采用改善的QuEChERS前處理法[27]結(jié)合UPLC-MS/MS檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)離子抑制率(ion suppression，IS)[13-15]對(duì)6種不同的動(dòng)物性食品中24種獸藥的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)性地評(píng)價(jià)；考察同位素內(nèi)標(biāo)[16-17]、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線[18-19]對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的補(bǔ)償效果。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ Endura三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、Ultimate 3000超高效液相色譜儀，美國(guó)Thermo-Fisher公司；VORTEX GENIUS3渦旋儀，德國(guó)IKA公司；Milli-Q型全自動(dòng)超純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司。

乙腈、甲醇、正己烷均為色譜純，德國(guó)Merck公司；甲酸(色譜純)，德國(guó)CNW公司；無(wú)水硫酸鈉(分析純)，重慶川東化工(集團(tuán))有限公司；C18E粉，美國(guó)Welch公司。

本實(shí)驗(yàn)室所用的標(biāo)準(zhǔn)品純度除替米考星(tilmicosin，TIL)和諾氟沙星-D5(norfloxacine-D5hydrate，NOR-D5)外純度均在92%以上，TIL純度為80.71%，NOR-D5純度為80.40%。沙拉沙星(sarafloxacin，SAR)、金剛烷胺(amantadine，AMA)、金剛乙胺(rimantadina，RIM)、環(huán)丙沙星-D8(ciprofloxacin-D8，CIP-D8)、恩諾沙星-D5(enrofloxacin-d5，ENR-D5)、NOR-D5，Bepure公司；磺胺間二甲氧嘧啶-D6(sulfadimethoxine-D6，SDT-D6)、磺胺鄰二甲氧嘧啶-D3(sulfadoxine，SDX-D3)，德國(guó)WITEGA公司；金剛烷胺-D15(AMA-D15)，德國(guó)CNW公司；紅霉素-13C2(erythromycin-13C2，ERY-13C2)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；其余21種標(biāo)準(zhǔn)品均來(lái)自德國(guó)DR.Ehrenstorfer。

分別稱(chēng)取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確移取一定量的各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配；同法配制內(nèi)標(biāo)工作液。

1.2 樣品前處理

稱(chēng)取動(dòng)物組織5.00 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入2 mL乙腈飽和正己烷；加入10 mL 0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸-乙腈，3 g無(wú)水硫酸鈉，加蓋渦旋1 min，超聲5 min，8 000 r/min離心5 min；取中間層提取液于含有2 g C18E的凈化管中，超聲5 min，4 000 r/min離心3 min；準(zhǔn)確移取5 mL上清液于氮吹管中，40 ℃氮吹至干，用20%(體積分?jǐn)?shù))甲醇-水定容至1 mL，渦旋，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，供UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Thermo-Fisher Hypersil GOLD aQ色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.9 μm)；柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積5 μL；流動(dòng)相A：0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸-水溶液，流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫程序：0～0.5 min，90%A；0.5～3 min，90%A～10%A；3～4 min，10%A；4.1～5 min，90%A。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；噴霧電壓：3 500 V；鞘氣(Arb)：45；輔助氣(Arb)：13；吹掃氣(Arb)：2；離子傳輸管溫度：350 ℃；蒸發(fā)溫度：300 ℃；碰撞氣壓力：氬氣2 mTorr；Q1半峰寬：0.7 Da；Q3半峰寬：0.7 Da；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)。24種獸藥質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 各獸藥保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectral parameters of various veterinary drugs

1.4 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)方法

溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用20%(體積分?jǐn)?shù))甲醇-水稀釋成5、10、20、50、100、200 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液?；|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別稱(chēng)取陰性鯽魚(yú)、雞肉、鴨胗、豬肝、牛肉、豬肉5.00 g(精確至0.01 g)按1.2處理，獲得6組不同的空白基質(zhì)溶液，加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，配制成6組5、10、20、50、100、200 ng/mL的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。在1.3的儀器條件下測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。離子抑制率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：IS，離子抑制率，%；K1，溶劑標(biāo)曲斜率；K2，基質(zhì)匹配標(biāo)曲斜率。IS>0，基質(zhì)增強(qiáng)[20]；IS<0，基質(zhì)抑制[21]；IS絕對(duì)值越大，基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

為了考察24種獸藥受基質(zhì)影響的程度，本實(shí)驗(yàn)選取鯽魚(yú)、雞肉、鴨胗、豬肝、牛肉、豬肉6種不同的基質(zhì)，采用1.2方法進(jìn)行前處理，用離子抑制率表示24種獸藥在這6種基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，同一獸藥在不同基質(zhì)中與不同獸藥在同一基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)均不同。這可能與基質(zhì)中含有蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和色素等物質(zhì)有關(guān)，這些物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)與待測(cè)物的結(jié)構(gòu)有相似之處，與基質(zhì)產(chǎn)生共提取現(xiàn)象[22-23]，共提取程度不同，基質(zhì)效應(yīng)也不同。其中鴨胗和豬肝對(duì)其影響比較大，可能是內(nèi)臟富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、煙酸、維生素等，比肌肉組織復(fù)雜，對(duì)待測(cè)物的影響更大，故基質(zhì)效應(yīng)也越強(qiáng)。

磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole，SMZ)、SDT、磺胺嘧啶(sulfadiazine，SDZ)、磺胺喹惡啉(sulfaquinoxaline，SQX)、SDX、NOR、培氟沙星(pefloxacin，PEF)、ERY、羅紅霉素(roxithromycin，ROX)、TIL多為中強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，需采用內(nèi)標(biāo)法或基質(zhì)匹配標(biāo)曲定量；剩余14種獸藥多為弱基質(zhì)效應(yīng)。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)標(biāo)獲得的難易程度，對(duì)SDT、SDX、CIP、ENR、NOR、ERY、AMA采用內(nèi)標(biāo)法校正基質(zhì)效應(yīng)，剩余17種獸藥采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線校正基質(zhì)效應(yīng)的影響。

表2 24種獸藥在6種不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)(n=3)Table 2 Matrix effects of 24 veterinary drugs in six food matrices

2.2 消除或者補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)

同位素內(nèi)標(biāo)與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線均能有效地補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)[22]?；|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線是用空白基質(zhì)溶液對(duì)標(biāo)準(zhǔn)使用液進(jìn)行稀釋?zhuān)@得系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液，使得樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)品在電噴霧接口處具有相同的離子化條件，從而校正基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果的影響[23]。同位素內(nèi)標(biāo)是較理想的內(nèi)標(biāo)物，它與待分析物的化學(xué)性質(zhì)非常相似，除了可以消除離子化過(guò)程對(duì)化合物的影響，同時(shí)也可以消除樣品前處理過(guò)程的損耗[24]，從而使得同位素內(nèi)標(biāo)法成為首選的定量方法。

2.2.1 內(nèi)標(biāo)法補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)

為了考察加入同位素內(nèi)標(biāo)后，SDT、SDX、CIP、ENR、NOR、AMA、ERY的基質(zhì)效應(yīng)是否減少，本實(shí)驗(yàn)繪制了它們?cè)邛a魚(yú)、雞肉、鴨胗、豬肝、牛肉基質(zhì)中使用內(nèi)標(biāo)前與使用內(nèi)標(biāo)后的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照?qǐng)D(圖1)。在使用內(nèi)標(biāo)前，不同的基質(zhì)標(biāo)曲與溶劑標(biāo)曲之所以呈現(xiàn)出不同的夾角，是因?yàn)橥换衔锸懿煌|(zhì)的影響在儀器上的峰面積響應(yīng)強(qiáng)度不同。響應(yīng)強(qiáng)度比溶劑中強(qiáng)的為基質(zhì)增強(qiáng)，在溶劑標(biāo)曲上方；響應(yīng)強(qiáng)度比溶劑中弱的為基質(zhì)抑制，在溶劑標(biāo)曲下方；與溶劑標(biāo)曲的夾角越大，表明基質(zhì)效應(yīng)越大，反之亦然。加入內(nèi)標(biāo)后，各基質(zhì)標(biāo)曲與溶劑標(biāo)曲的夾角明顯減小，說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)得到有效補(bǔ)償?？赡艿脑蚴莾?nèi)標(biāo)法的標(biāo)曲繪制是橫坐標(biāo)為待分析物與同位素內(nèi)標(biāo)濃度的比值，縱坐標(biāo)則為兩者在儀器上響應(yīng)強(qiáng)度的比值，待分析物與其同位素內(nèi)標(biāo)受基質(zhì)的影響基本相同，兩者相比則抵消了這種影響。

圖1 部分獸藥在不同基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線和 使用內(nèi)標(biāo)后校正的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curves of some veterinary drugs in different matrices and calibration curves after using internal standards注:圖A,C,E,G,I,K,M分別為SDT、SDX、CIP、ENR、NOR、AMA、 ERY在不同基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線;圖B,D,F,H,J,L,N分別為SDT、SDX、 CIP、ENR、NOR、AMA、ERY在不同基質(zhì)中使用內(nèi)標(biāo)后校正的標(biāo)曲; Ci表示溶液中某一獸藥濃度，Ci/CIstd表示溶液中某一獸藥濃度與該 獸藥的同位素內(nèi)標(biāo)濃度的比值;Ai/AIstd表示溶液中某一獸藥的峰面積 與該獸藥的同位素內(nèi)標(biāo)峰面積的比值

2.2.2 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)

雖然同位素內(nèi)標(biāo)法可以有效消除基質(zhì)效應(yīng)，但同位素內(nèi)標(biāo)價(jià)格昂貴，且不易獲取。研究表明[25-26]，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線也可消除基質(zhì)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)將其余17種獸藥的加標(biāo)結(jié)果(加標(biāo)量為10 μg/kg)分別用溶劑標(biāo)曲與空白豬肉基質(zhì)匹配標(biāo)曲定量，結(jié)果如圖2所示。通過(guò)空白豬肉基質(zhì)匹配標(biāo)曲校正后，17種獸藥的回收率均有不同程度地提高?；厥章视?17.03±1.21)%～(66.55±2.54)%提升至(71.10±2.68)%～(89.25±3.14)%。這從定量的角度也說(shuō)明了待分析物與標(biāo)準(zhǔn)品在電噴霧接口處具有相同的離子化條件時(shí)，可以有效地校正基質(zhì)效應(yīng)。

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系、檢出限及定量限

本實(shí)驗(yàn)選擇了對(duì)24種獸藥基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)的豬肝作為空白基質(zhì)，加入適量?jī)?nèi)、外標(biāo)工作液，配制系列匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，以24種化合物的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限(limit of detection，LOD)及定量限(limit of quantitation，LOQ)，見(jiàn)表3。

圖2 溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線定量結(jié)果與空白豬肉基質(zhì) 匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較Fig.2 Comparison of quantitative results by solvent standard curve and negative pork matrix-matched standard curve

表3 豬肝中24種獸藥的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 3 Linear equation, linear range, correlation coefficient, LOD and LOQ for 24 veterinary drugs in pork liver

2.3.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度

取豬肝陰性樣品，對(duì)24種獸藥作3水平加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。24種獸藥在豬肝中的回收率為71.6%～109.8%(n=6)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)≤10.6%，該方法符合獸殘檢測(cè)要求。

表4 豬肝中24種獸藥回收率和精密度(n=6)Table 4 Recoveries and RSDs of 24 veterinary drugs in pork liver(n=6)

續(xù)表4

3 結(jié)論

本研究以離子抑制率為衡量指標(biāo)，系統(tǒng)性地評(píng)價(jià)了采用QuEChERS-UPLC-MS/MS檢測(cè)技術(shù)，6種不同的動(dòng)物性食品基質(zhì)對(duì)24種獸藥的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，SMZ、SDT、SDZ、SQX、SDX、NOR、PEF、ERY、ROX、TIL 10種獸藥存在著較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，剩余14種獸藥為弱基質(zhì)效應(yīng)。采用同位素內(nèi)標(biāo)及基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線能有效地補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)，本研究為動(dòng)物性食品中多獸殘快速準(zhǔn)確檢測(cè)提供了一定的參考依據(jù)。