陳樹(shù)俊，王婉榕

(山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原，030006)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥，山西靜樂(lè)；沙棘原漿，山西廈普賽爾食品飲料股份有限公司；黃桃濃漿、胡蘿卜濃漿，福建臻富果汁食品有限公司；開(kāi)菲爾乳桿菌(ZKCC-378)，北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；α淀粉酶(3 700 U/g)、β淀粉酶(102 000 U/g)、胃蛋白酶(3 000 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg),北京索萊寶生物科技有限公司；DPPH等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JYL-C010料理機(jī)，九陽(yáng)股份有限公司；XL-600B多功能粉碎機(jī)，小寶電器有限公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HHS-11-6電熱恒溫水浴鍋、YXQ-LS-75Ⅱ全自動(dòng)高壓滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HPS-250生化培養(yǎng)箱，哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，上海梅特勒托利多儀器有限公司；SCIENTZ-10 N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)流程

實(shí)驗(yàn)流程如下：

藜麥種子→萌發(fā)→磨漿→糊化→液化→糖化→殺菌→發(fā)酵→藜麥發(fā)酵乳、混合果蔬汁調(diào)配后，真空冷凍干燥→體外胃腸消化模擬→抗氧化分析

1.3.2 藜麥漿的制備

藜麥種子在22 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)34 h，期間每6 h澆1次蒸餾水[14]，結(jié)束后在-20 ℃保存24 h，在45 ℃烘干11 h，粉碎過(guò)篩，得到藜麥芽粉；藜麥粉以1∶5(g∶mL)的料液比進(jìn)行磨漿(保證藜麥濃漿的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)>2.5%)；糊化的實(shí)驗(yàn)條件為80 ℃、30 min，使其達(dá)到糊化的終點(diǎn)；通過(guò)正交試驗(yàn)確定液化和糖化過(guò)程的實(shí)驗(yàn)條件分別為75 ℃、55 min、α淀粉酶18 U/g和55 ℃、90 min、β淀粉酶240 U/g，從而制得藜麥濃漿。

1.3.3 發(fā)酵

1.3.3.1 殺菌、冷卻

將制好的藜麥濃漿，90 ℃殺菌20 min后冷卻[15]。

1.3.3.2 菌種活化稀釋

將開(kāi)菲爾乳桿菌凍干粉用少量無(wú)菌水稀釋后，滴加至平板培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h?；罨笥媒臃N環(huán)取少量菌至液體培養(yǎng)基中，反復(fù)接種活化后至活菌總數(shù)約為109CFU/mL，作為菌種接種液備用。

1.3.3.3 接種、發(fā)酵

藜麥濃漿殺菌后，接入開(kāi)菲爾乳桿菌，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間后，測(cè)其酸度和活菌數(shù)。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

以酸度和活菌數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察接種量(2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%)、發(fā)酵時(shí)間(9、10、11、12、13、14、15 h)、發(fā)酵溫度(34、35、36、37、38、39、40 ℃)對(duì)藜麥濃漿發(fā)酵效果的影響。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，考察3因素之間的交互作用并得到開(kāi)菲爾發(fā)酵藜麥的最優(yōu)條件。以活菌數(shù)和酸度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的試驗(yàn)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 1 Codes and levels of response surface test

1.3.6 果蔬發(fā)酵乳的復(fù)配

以感官評(píng)分和固形物含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定果蔬-開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵混合乳的比例為藜麥發(fā)酵乳50 g、沙棘原漿13 g、黃桃濃漿30 g和胡蘿卜濃漿10 g。

1.3.7 真空冷凍干燥工藝

將藜麥濃漿、開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵乳和果蔬-開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵混合乳3組在-43 ℃的條件下冷凍2 h后脫模，設(shè)置加熱板溫度為45 ℃、干燥倉(cāng)內(nèi)真空度10 Pa。

1.3.8 體外胃腸消化模擬試驗(yàn)

胃消化模擬試驗(yàn)[16-17]：將藜麥濃漿、開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵乳和果蔬-開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵混合乳進(jìn)行適度稀釋，加入1 mol/L HCl溶液使pH至2.0，加入200 U胃蛋白酶進(jìn)行胃消化過(guò)程，每隔1 h取樣、共4次，離心后測(cè)定消化及抗氧化指標(biāo)。

腸消化模擬試驗(yàn)：取胃消化4 h的樣品，緩慢加入1 mol/L NaHCO3溶液調(diào)pH至7.8，加入200 U胰蛋白酶進(jìn)行腸消化過(guò)程，每隔1 h取樣、共5次，離心后測(cè)定消化及抗氧化指標(biāo)。

1.3.9 相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

1.3.9.1 活菌數(shù)和酸度的測(cè)定

參照標(biāo)準(zhǔn)[18-19]，分別進(jìn)行活菌數(shù)和酸度的測(cè)定。

1.3.9.2 黃酮和多酚的測(cè)定

依據(jù)參考文獻(xiàn)[20-21]，分別在510和765 nm 處對(duì)黃酮和多酚進(jìn)行測(cè)定。

1.3.9.3 抗氧化能力的測(cè)定

依據(jù)參考文獻(xiàn)[22]，在517和320 nm處分別進(jìn)行DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定；依據(jù)參考文獻(xiàn)[23]，在510和700 nm處分別進(jìn)行羥自由基清除率和鐵還原力的測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均為平均值。實(shí)驗(yàn)圖表用Origin 8.0繪制，使用SPSS 17.0和Design-Expert 8.0.6進(jìn)行顯著性統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 接種量對(duì)開(kāi)菲爾發(fā)酵藜麥效果的影響

接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響見(jiàn)圖1，隨著接種量的增加，酸度、活菌數(shù)均先上升后趨于平緩，原因可能是接種量的大小與開(kāi)菲爾菌在藜麥漿體系中的生長(zhǎng)有很大的關(guān)系，當(dāng)開(kāi)菲爾菌的接種量<5%時(shí)，藜麥漿中的活菌數(shù)隨之減少，導(dǎo)致藜麥漿沒(méi)有充分發(fā)酵，造成藜麥漿原料的浪費(fèi)；當(dāng)開(kāi)菲爾菌的接種量>5%時(shí)，藜麥漿所能利用的活菌數(shù)是有限的，造成酸度幾乎無(wú)明顯變化。所以，綜合接種量對(duì)酸度和活菌數(shù)的影響程度，選擇接種量為5%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 接種量對(duì)酸度和活菌數(shù)的影響Fig.1 Effect of inoculation amount on acidity and the number of viable bacteria

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)開(kāi)菲爾發(fā)酵藜麥效果的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響見(jiàn)圖2，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌數(shù)、酸度變化均先上升后趨于平緩，原因可能是將開(kāi)菲爾菌加入到藜麥濃漿后，菌體大量生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)酸，使得藜麥芽濃漿環(huán)境酸化，適宜的酸度有利于提高活菌數(shù)，使酸度增大。當(dāng)發(fā)酵到12 h時(shí)，碳源的大量消耗和乳酸的堆積阻礙了開(kāi)菲爾菌的生長(zhǎng)，從而形成活菌數(shù)變化不明顯的現(xiàn)象。所以，綜合發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸度和活菌數(shù)的影響程度，選擇發(fā)酵時(shí)間為12 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸度和活菌數(shù)的影響Fig.2 Effect of fermentation time on acidity and the number of viable bacteria

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)開(kāi)菲爾發(fā)酵藜麥效果的影響

發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響見(jiàn)圖3，當(dāng)發(fā)酵溫度為 34～37 ℃時(shí)，開(kāi)菲爾菌的活菌數(shù)和酸度增長(zhǎng)較快，當(dāng)發(fā)酵溫度高于37 ℃，開(kāi)菲爾菌的活菌數(shù)和酸度幾乎無(wú)明顯變化，原因可能是溫度的影響對(duì)于開(kāi)菲爾發(fā)酵來(lái)說(shuō)是至關(guān)重要的，溫度的持續(xù)增加不利于開(kāi)菲爾菌的生長(zhǎng)，而開(kāi)菲爾菌活菌數(shù)的穩(wěn)定進(jìn)而會(huì)影響產(chǎn)酸效果。所以，綜合發(fā)酵溫度對(duì)酸度和活菌數(shù)的影響程度，選擇發(fā)酵溫度為37 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)酸度和活菌數(shù)的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on acidity and the number of viable bacteria

2.2 開(kāi)菲爾發(fā)酵藜麥濃漿響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

依據(jù)表2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行回歸分析，建立開(kāi)菲爾發(fā)酵藜麥乳酸度和活菌數(shù)的二次多項(xiàng)回歸方程如下：

Y1=85.25+0.54A+0.74B+1.09C+0.33AB+0.17AC+0.60BC-1.50A2-1.36B2-1.72C2(R12=96.47%)

Y2=9.28+0.075A+0.17B+0.29C+0.025AB-0.050AC+0.050BC-0.22A2-0.30B2-0.38C2(R22=99.24%)

試驗(yàn)方差結(jié)果如表3所示，模型均極顯著(P<0.000 1)，F(xiàn)值為1.36和0.87，P值為 0.375 8和0.527 1(P>0.05)，表示失擬項(xiàng)不顯著；R12為 96.47%、R22為99.24%，表示模型擬合度較高，可用于預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)F值大小，表明3個(gè)因素對(duì)藜麥乳發(fā)酵效果影響的主次順序均為C>B>A。由P值可得，B、C、A2、B2和C2對(duì)酸度和活菌數(shù)均極顯著(P<0.01)，A對(duì)酸度和活菌數(shù)影響分別為顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)，BC對(duì)活菌數(shù)影響極顯著(P<0.01)。

3個(gè)因素交互作用對(duì)酸度和活菌數(shù)的影響如圖4所示，以開(kāi)菲爾菌接種量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度分別為中心水平時(shí)，酸度和活菌數(shù)均呈先上升后趨于平緩的趨勢(shì)，發(fā)酵溫度的大幅度升高致使產(chǎn)生大量乳酸，使得發(fā)酵體系的pH降低，不利于開(kāi)菲爾菌的生長(zhǎng)，故發(fā)酵過(guò)程趨于穩(wěn)定，酸度無(wú)明顯變化、活菌數(shù)略有所降低。由圖4-a、圖4-c、圖4-d和4-f可知，發(fā)酵溫度響應(yīng)面曲面陡于其余兩因素曲面，說(shuō)明發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響最大，與方差分析結(jié)果一致。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis

a-發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸度的影響;b-發(fā)酵時(shí)間 與接種量對(duì)酸度的影響;c-發(fā)酵溫度與接種量對(duì)酸度 的影響;d-發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間對(duì)活菌數(shù)的影響;e-發(fā)酵 時(shí)間與接種量對(duì)活菌數(shù)的影響;f-發(fā)酵溫度與接種量對(duì) 活菌數(shù)的影響圖4 三因素交互作用對(duì)酸度和活菌數(shù)的影響Fig.4 Effect of interaction of three factors on acidity and the number of viable bacteria

2.2.2 最佳發(fā)酵工藝的確定

通過(guò)Design-Expert 8.0.6 軟件分析可得,發(fā)酵溫度37.39 ℃、接種量5.21%、發(fā)酵時(shí)間12.35 h為最佳開(kāi)菲爾發(fā)酵工藝條件。在此條件下，開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵乳的酸度理論值為85.672 4 °T，活菌數(shù)對(duì)數(shù)值為9.367 93 lgCFU/mL。以試驗(yàn)可操作性為前提，設(shè)置工藝條件為發(fā)酵溫度 37.4 ℃、接種量 5.2%、發(fā)酵時(shí)間12.4 h。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性，利用最優(yōu)發(fā)酵條件進(jìn)行3次重復(fù)性試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得藜麥漿的發(fā)酵酸度為85.62 °T(標(biāo)準(zhǔn)差值為1.394)，活菌數(shù)對(duì)數(shù)值為9.33 lgCFU/mL(標(biāo)準(zhǔn)差值為0.027)，其相對(duì)誤差<0.05，說(shuō)明該回歸模型的擬合度較高，可以利用其優(yōu)化藜麥漿的開(kāi)菲爾發(fā)酵工藝。

2.3 體外消化模擬試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 黃酮和多酚含量的動(dòng)態(tài)分析

消化過(guò)程中藜麥濃漿未發(fā)酵組、開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵乳組和果蔬-開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵乳混合組的黃酮和多酚變化如圖5所示，由圖5-a可知，藜麥濃漿未發(fā)酵組、開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵乳組、果蔬-開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵乳混合組消化后的黃酮含量分別為0.748、0.779、0.853 mg/mL，較消化前分別提高了0.605、0.555、0.515 mg/mL，存在顯著性差異(P<0.05)；由圖5-b可知，藜麥濃漿未發(fā)酵組、開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵乳組、果蔬-開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵乳混合組消化后的多酚含量分別為3.256、8.487、10.361 mg/mL，較消化前分別提高了2.760、7.498、8.438 mg/mL，存在顯著性差異(P<0.05)。發(fā)酵和消化過(guò)程促進(jìn)樣品黃酮和多酚的釋放使得其含量有所增加，主要原因可能是發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進(jìn)一步形成酚類物質(zhì)[24]；蛋白酶和胰蛋白酶通過(guò)影響共價(jià)鍵的生成與斷裂，使得黃酮類物質(zhì)含量有所提高[25]。

a-黃酮含量；b-多酚含量圖5 體外消化過(guò)程中黃酮和多酚含量的動(dòng)態(tài)分析Fig.5 Dynamic analysis of flavonoids and polyphenols content during in vitro digestion

2.3.2 抗氧化結(jié)果分析

由圖6可知，藜麥濃漿未發(fā)酵組、開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵乳組和果蔬-開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵乳混合組的DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除率及鐵還原力隨時(shí)間的變化呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。對(duì)于藜麥濃漿未發(fā)酵組而言，經(jīng)過(guò)消化后其DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除率及鐵還原力為74.7%、53.5%、53.3%和0.602，較消化前分別提高了15.6%、15.1%、10.1%和0.152，存在顯著性差異(P<0.05)；對(duì)于開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵乳組而言，經(jīng)過(guò)消化后其DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除率及鐵還原力為80.8%、59.2%、61.0%和0.689，較消化前分別提高了15.7%、16.9%、11.6%和0.171，存在顯著性差異(P<0.05)；對(duì)于果蔬-開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵乳混合組而言，經(jīng)過(guò)消化后其DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除率及鐵還原力為85.6%、61.1%、65.1%和0.711，較消化前分別提高了13.8%、15.7%、11.4%和0.153，存在顯著性差異(P<0.05)。在消化過(guò)程中，自由基清除率強(qiáng)弱順序?yàn)楣?開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵乳混合組、開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵乳組、藜麥濃漿未發(fā)酵組，且各自抗氧化性均有所增強(qiáng)，原因可能是在發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物使得酚類物質(zhì)由結(jié)合狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x狀態(tài)，且有機(jī)酸的生成有效阻止了酚類物質(zhì)的進(jìn)一步分解[26]；在消化過(guò)程中，酶通過(guò)水解蛋白質(zhì)，從而使得與其結(jié)合的黃酮類物質(zhì)進(jìn)一步增多，而酚類和黃酮類物質(zhì)是影響抗氧化特性的重要活性物質(zhì)，故其抗氧化特性有所增加。

a-DPPH自由基清除率;b-羥自由基清除率;c-鐵還原力;d-超氧陰離子自由基清除率圖6 體外消化過(guò)程中抗氧化能力的動(dòng)態(tài)分析Fig.6 Dynamic analysis of antioxidant capacity during in vitro digestion

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得出接種量5.2%、發(fā)酵時(shí)間12.4 h和發(fā)酵溫度37.4 ℃為最佳工藝條件。通過(guò)體外消化模擬，對(duì)藜麥濃漿未發(fā)酵組、開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵乳組和果蔬-開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵乳混合組的多酚含量、黃酮含量和抗氧化性的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析，結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)消化后，3組的黃酮含量和多酚含量明顯升高；果蔬-開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵乳混合組的DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除率及鐵還原力比藜麥漿未發(fā)酵組分別高10.9%、7.6%、11.8%、0.190，比開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵乳組分別高4.8%、1.9%、4.1%、0.022，且果蔬-開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵乳混合組>開(kāi)菲爾藜麥發(fā)酵乳組>藜麥濃漿未發(fā)酵組，故可知發(fā)酵和果蔬汁的加入均提高了藜麥濃漿的抗氧化特性，為開(kāi)菲爾菌在谷物、果蔬領(lǐng)域的進(jìn)一步研究應(yīng)用奠定了扎實(shí)的基礎(chǔ)。