馬文藝，李興飛，劉軍，時(shí)玉強(qiáng)，魯緒強(qiáng)，華欲飛*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(臨邑禹王植物蛋白有限公司，山東 德州，251507)

基于植物酸奶或無乳制品在世界范圍內(nèi)越來越被接受，目前，由杏仁、椰子、大豆和燕麥制成的無乳酸奶在加工技術(shù)和市場份額方面都取得了有意義的進(jìn)展。盡管如此，還是需要為無乳酸奶制品開發(fā)新的植物來源。

黃豌豆(PisumsativumL.)是豆科植物豆莢的可食用種子，原產(chǎn)于南歐和沿海地區(qū)，但在世界各地廣泛種植。與其他豆類相比，豌豆的蛋白質(zhì)含量極高，約為18%～30%[1-3]。豌豆蛋白含有8種必需氨基酸，特別是含有高水平的賴氨酸和精氨酸[4-6]。其次，豌豆蛋白還具有許多功能特性，如凝膠性、水溶性、起泡性和乳化性[7-9]。與大豆蛋白相比，豌豆蛋白具有較低的致敏性和較高的消化率[10-11]。此外，豌豆還含有多種維生素和礦物質(zhì)，如維生素B、葉酸、鈣、鐵、鉀等。胰蛋白酶抑制劑和植酸鹽等抗?fàn)I養(yǎng)因子也低于大豆。

阻礙豌豆在蛋白質(zhì)飲料或植物酸奶中使用的最重要因素是令人不快的味道[12-13]。加工過的豌豆的味道被描述為“青草味”或“干草味”。2-甲氧基-3-異丙基-(5或6)-甲基吡嗪是豌豆乳中異味的一個(gè)重要來源，其閾值極低。其他揮發(fā)性化合物，如己醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、壬醛和1-己醇對豌豆?jié){的風(fēng)味也有重要影響[14-16]。

關(guān)于用豌豆作為蛋白質(zhì)來源制備植物酸奶報(bào)道很少。DENKOVA等[17]報(bào)道了用不同比例的豌豆乳和脫脂牛奶的混合物作為發(fā)酵基料，并添加益生菌，制備酸奶和嗜酸飲料，其產(chǎn)品活細(xì)胞濃度高，可滴定酸度適中，在(4±2) ℃保存穩(wěn)定性好。一些研究則通過對豌豆蛋白和牛奶或奶粉的混合物進(jìn)行發(fā)酵制成類似酸奶的產(chǎn)品[18]。結(jié)果表明，豌豆蛋白含量越高，產(chǎn)品的酸度越高，脫水收縮作用越強(qiáng)，產(chǎn)品的硬度越低。

然而，豌豆酸奶的感官特性不僅取決于豌豆蛋白的比例，還取決于發(fā)酵劑的選擇。DENKOVA等[19]報(bào)道了Saccharomycesdiastaticus25-G可在含脫脂牛奶和豌豆乳的發(fā)酵基料上生長，獲得非傳統(tǒng)的發(fā)酵產(chǎn)品，所得產(chǎn)品具有高含量的活菌數(shù)和中等的可滴定酸度。發(fā)酵劑作為植物酸奶品質(zhì)的一個(gè)重要影響因素，它會對發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)和感官產(chǎn)生不同的影響，所以通過篩選發(fā)酵劑可以使得產(chǎn)品具有較好的品質(zhì)[20]。作為一種新型發(fā)酵劑，直投式發(fā)酵劑具有無需菌種活化和擴(kuò)培等優(yōu)勢，并且其活菌含量高，可以長期保藏，所以在生產(chǎn)上常采用直投式發(fā)酵劑，不僅可以降低成本，還可以保證較好的產(chǎn)品品質(zhì)[21]。

在這項(xiàng)研究中，無乳豌豆酸奶制品是用豌豆乳或豌豆的水提取物制成的，而不是用豌豆蛋白或豌豆和乳制品的混合物制成的。本文通過對豌豆?jié){加工工藝的改進(jìn)以及對6種直投式酸奶發(fā)酵劑的篩選，為日后豌豆酸奶的制備提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

直投式發(fā)酵劑A、B、C(嗜熱鏈球菌，保加利亞乳桿菌)、D(保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌)、E(保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌，鼠李糖乳桿菌，發(fā)酵乳桿菌，副干酪乳桿菌，瑞士乳桿菌，長雙歧桿菌)、F(嗜熱鏈球菌，植物乳桿菌)，市場；黃豌豆：表面有光澤，無霉變，顆粒飽滿，市售；蔗糖，市售食用白砂糖；葡萄糖，市售食用葡萄糖；2-甲基-3-庚酮，西格瑪-奧德里奇公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

AB204-N分析天平、PHS-3TC數(shù)顯pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；TH-300梯度混合器，上海瀘西分析儀器廠有限公司；超凈工作臺，無錫一凈設(shè)備有限公司；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；SC202-2電熱恒溫干燥箱，江蘇南通實(shí)驗(yàn)電器廠；TA.XTPlus質(zhì)構(gòu)儀，英國SMS公司；DVB/CAR/PDMS，50/30 μm萃取頭，美國Supelco公司；氣質(zhì)聯(lián)用儀(SCION SQ 456GC-MS)，美國bruker 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豌豆?jié){的制備工藝

豌豆?jié){的制備工藝如下：

豌豆→燙漂(沸水，10 min)→浸泡(20 min)→脫殼→堿泡10～11 h[m(原豆)∶m(0.07 mol/L氫氧化鈉溶液)=1∶5]→清洗→打漿[m(原豆)∶m(水)=1∶3，3 min]→離心(5 000×g，15 min，20 ℃)→豌豆?jié){

1.2.2 豌豆酸奶的發(fā)酵工藝

豌豆酸奶的發(fā)酵工藝如下：

豌豆?jié){→調(diào)配→殺菌(95 ℃，15 min)→冷卻至42 ℃左右→接種→發(fā)酵終點(diǎn)至pH 4.7→冷藏→后熟→待用

1.2.3 pH值的測定

用PHS-3TC 型高精密酸度計(jì)測定。

1.2.4 總酸度的測定

根據(jù)GB 5009.239 — 2016[22]，用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定法測定。

1.2.5 質(zhì)構(gòu)的測定

采用英國 SMS 公司的TA.XTPlus 型質(zhì)構(gòu)儀對豌豆酸奶進(jìn)行測定，測定方法采用Yoghurt back extrusion，采用圓柱形探頭P25；測試前探頭下降速度：1 mm/s；測試速度：0.5 mm/s；測試后探頭回程速度：1 mm/s;應(yīng)變程度30%。每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。

1.2.6 揮發(fā)性風(fēng)味的測定

GC-MS 條件：采用 DB-WAX 色譜柱(30 mm×0.25 mm，0.25 μm)，升溫程序：起始溫度40 ℃，保持3 min；以6 ℃/min升溫至100 ℃；然后以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持7 min；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：離子源EI源，離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，電子能量70 eV，掃描范圍為33～350m/z，采集方式為Scan。

樣品預(yù)處理方法:參照周艷平等[23]的方法并稍作修改，準(zhǔn)確稱取 20 g 豌豆酸奶，先加入20 g NaCl 溶液(ω=16%)，將酸奶進(jìn)行微弱剪切，再用10 g NaCl 溶液(ω=16%)清洗剪切機(jī)上殘留的酸奶，搖勻。稱取 5 g 該溶液于萃取瓶中，并向其中加入10 μL 32 μg/mL的內(nèi)標(biāo)物(2-甲基-3-庚酮)，迅速旋緊蓋子，搖勻，置于60 ℃水浴中，將老化的固相微萃取針插入樣品瓶，邊攪拌邊頂空吸附，萃取時(shí)間為30 min。首次使用前，萃取頭于250 ℃老化1 h。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

借助 Origin 軟件作圖得到豌豆?jié){體系中pH和酸度隨發(fā)酵時(shí)間變化的趨勢圖。酸奶產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)特性測試完成后，專用軟件 Texture Expert Exceed可自動(dòng)對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行存儲分析，生成表格進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用IBM SPSS Statistics 19對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析(P<0.05表示有顯著性差異)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆預(yù)處理方式對豌豆?jié){揮發(fā)性風(fēng)味的影響

常規(guī)的豌豆?jié){處理方式為先打漿再高溫滅酶，此研究中采取了在打漿前熱燙滅酶，然后再脫殼和堿泡的制漿方式，表1對比了2種不同預(yù)處理方法對豌豆?jié){的揮發(fā)性風(fēng)味的影響。從整體來看，常規(guī)預(yù)處理方式的總揮發(fā)性物質(zhì)含量顯著高于本文的制漿方式，尤其是一些與脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)的氧化產(chǎn)物有關(guān)的揮發(fā)物的含量，這可能是因?yàn)槌Ｒ?guī)的預(yù)處理方式先打漿導(dǎo)致了LOX的酶促反應(yīng)，而后一種預(yù)處理方式則采取了熱燙滅酶的方式，在打漿前已經(jīng)使酶失活，抑制酶促反應(yīng)的發(fā)生以及氧化產(chǎn)物的生成。有研究報(bào)道[16]，2-甲氧基-3-異丙基-(5或6)甲氧基吡嗪是本身存在于豌豆中的一種具有“泥土、青椒和塑料”氣味的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其閾值極低，對豌豆?jié){的風(fēng)味貢獻(xiàn)度很高。本文的處理方式使得其含量有所下降，但并無顯著性差異，說明這2種預(yù)處理方式對其含量的影響不大。

相比于常規(guī)的制漿方式，本文采用的熱燙滅酶的預(yù)處理方式，減少了由于酶促反應(yīng)生成的氧化產(chǎn)物,脫殼會導(dǎo)致?lián)]發(fā)物含量的下降，但是并不顯著，但是脫殼更有利于后續(xù)浸泡時(shí)一些異味成分的溶出,堿泡不僅促進(jìn)異味物質(zhì)的溶出，還使得漿液的pH升高，促進(jìn)蛋白質(zhì)溶出，使得蛋白質(zhì)含量從2.81%提高至3.08%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，蛋白質(zhì)提取率從31.94%提高至48.89%。

綜上所述，相比于常規(guī)的豌豆?jié){制備工藝，通過燙漂、脫殼和堿泡的工藝手段使得豌豆?jié){的異味成分減少，風(fēng)味得到了極大的改善。

表1 不同制漿方式得到的豌豆?jié){的風(fēng)味成分Table 1 Flavor components of pea milk prepared with different pulping process

2.2 酸奶發(fā)酵劑對豌豆酸奶品質(zhì)的影響

2.2.1 酸奶發(fā)酵劑對豌豆酸奶發(fā)酵特性的影響

在制備好的豌豆?jié){中分別接種相同含量的直投式發(fā)酵劑A、B、C、D、E、F，在42 ℃下發(fā)酵直至終點(diǎn)(pH 4.7)。由圖1的pH變化曲線可知，達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，A、B、C、F所需時(shí)間接近，為3 h左右，D所需時(shí)間為3.5 h，而E所需時(shí)間最長為4.5 h。由圖2可知，整體的發(fā)酵速率是C>B>A>F>D>E(也是pH從最初的7.3降至5.5的快慢順序)，發(fā)酵菌種在前1 h 的差距不大，均呈現(xiàn)較慢的發(fā)酵速率，發(fā)酵速率最快的階段為1～2 h 或2～3 h，不同的發(fā)酵菌種在豌豆?jié){中的表現(xiàn)不同，其中C型菌種在1～2 h 的發(fā)酵速率最快，B、A、F、D型菌種在2～3 h 的發(fā)酵速率最快，而E型發(fā)酵劑在3～4 h 的發(fā)酵速率最快，即在前3 h的發(fā)酵速率均很慢，在3 h后發(fā)酵速率加快，且加快幅度較大。

圖1 不同發(fā)酵劑制備的豌豆酸奶pH變化曲線Fig.1 pH curve of pea yoghurt prepared with different starter cultures

圖2 不同發(fā)酵劑制備的豌豆酸奶酸度變化曲線Fig.2 Acidity curve of pea yoghurt prepared with different starter cultures

2.2.2 酸奶發(fā)酵劑對豌豆酸奶質(zhì)構(gòu)特性的影響

不同發(fā)酵劑對豌豆酸奶的質(zhì)構(gòu)有不同的影響，主要體現(xiàn)在硬度、稠度、黏聚性和黏聚指數(shù)4個(gè)方面。從整體看，這4個(gè)質(zhì)構(gòu)參數(shù)呈現(xiàn)相同的變化趨勢，即樣品硬度越大，稠度、黏聚性和黏聚指數(shù)的絕對值也越大，說明酸奶的質(zhì)構(gòu)性能越好。由表2可得，6種豌豆酸奶，質(zhì)構(gòu)參數(shù)由大到小依次是A>C>D>B>F>E，說明A型直投發(fā)酵劑在豌豆?jié){為基底的體系中很適用，發(fā)酵酸奶的凝膠結(jié)構(gòu)最為致密，質(zhì)構(gòu)性能最好，而由E型直投發(fā)酵劑發(fā)酵的豌豆酸奶的凝膠結(jié)構(gòu)最松散且質(zhì)構(gòu)性能最差。在這6種酸奶中，A、B、C、D型菌種發(fā)酵的豌豆酸奶的硬度均較強(qiáng)但差異不顯著(P≥0.05)，但與E型菌種發(fā)酵的豌豆酸奶均有顯著性的差異(P<0.05)，F(xiàn)型菌種發(fā)酵的酸奶的硬度稍高于E型菌種，但硬度都偏低且兩者無顯著性差異(P≥0.05)。在稠度方面，不同發(fā)酵劑制備的酸奶區(qū)別較大，除了A和B型菌種發(fā)酵的豌豆酸奶間無顯著差異(P≥0.05)，其他發(fā)酵劑制備的豌豆酸奶均有顯著性差異(P<0.05)。從黏聚性的測定來看，差距不大，從黏聚指數(shù)的測定結(jié)果來看，除B型、C型和D型菌種發(fā)酵的酸奶間無顯著差異，其他均有顯著差異。

表2 不同發(fā)酵劑制備的豌豆酸奶的質(zhì)構(gòu)參數(shù)Table 2 Texture parameters of pea yoghurt prepared with different starter cultures

2.2.3 酸奶發(fā)酵劑對豌豆酸奶揮發(fā)性風(fēng)味的影響

由表3可得，采用不同發(fā)酵劑會影響豌豆酸奶的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量。總的來看，A型菌種發(fā)酵的酸奶的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量最高，而D型菌種最低。

豆腥味物質(zhì)主要包含醛類、醇類以及呋喃類，具有青草味，蘑菇味。豌豆?jié){經(jīng)過發(fā)酵后，己醛的含量均有所下降，而己醇的含量有不同程度的上升，這是由于乳酸菌在豌豆?jié){體系中生長代謝，產(chǎn)生了還原酶類，將醛類轉(zhuǎn)化成醇類，由于己醛的閾值很低、豆腥味重，而己醇的閾值更高，所以經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵使得己醛發(fā)生轉(zhuǎn)化，改善酸奶的風(fēng)味[24]。2-戊基呋喃在豌豆酸奶中的含量也較高，尤其是在A型和B型菌種發(fā)酵的酸奶中，而在C型和D型發(fā)酵酸奶中的含量偏低。

2-甲氧基-3-異丙基-(5或6)甲氧基吡嗪，具有“辣椒、泥土”等令人不悅的強(qiáng)烈氣味，閾值極低，是豌豆中異味的主要貢獻(xiàn)者，其含量會對豌豆產(chǎn)品的風(fēng)味造成很大的影響，經(jīng)過不同類型的發(fā)酵劑發(fā)酵后，豌豆酸奶中的2-甲氧基-3-異丙基-(5或6)甲氧基吡嗪呈現(xiàn)出了不同的含量，經(jīng)過A型和C型菌種制備的豌豆酸奶中未檢測出吡嗪，在B型和F型菌種制備的酸奶中，吡嗪的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，均高于1 μg/kg。

揮發(fā)性酸和酮類是酸奶的重要風(fēng)味物質(zhì)，揮發(fā)性酮類風(fēng)味物質(zhì)是乳酸菌的代謝產(chǎn)物之一，是酸奶的特征風(fēng)味物質(zhì)。在豌豆酸奶中檢測到的酮類主要有2,3-丁二酮，2,3-戊二酮和3-羥基-2-丁酮，這些酮類物質(zhì)會賦予酸奶奶油味、干酪味等[24]。酸奶中的酮類總含量依次是A>C>E>F>D>B。2,3-丁二酮在A型菌種發(fā)酵酸奶中的含量顯著偏高，其次是E型和C型菌種發(fā)酵的酸奶，在B型、D型和F型菌種發(fā)酵酸奶中的含量最低。對于2,3-戊二酮，在A型和C型菌種發(fā)酵酸奶中的含量較高，對于3-羥基-2-丁酮?jiǎng)t在C型、D型和A型菌種發(fā)酵的酸奶中含量偏高。

據(jù)報(bào)道，酸奶的風(fēng)味不僅受體系中羰基化合物的影響，還受揮發(fā)性、非揮發(fā)性酸的影響[25-26]。對于豌豆酸奶中檢測到的揮發(fā)性酸，主要包括乙酸、己酸、辛酸和壬酸，這幾種揮發(fā)性酸幾乎均在上述6種發(fā)酵劑制備的豌豆酸奶中檢測到。不同發(fā)酵劑制備的酸奶中乙酸的含量差異較顯著，其中在E型、A型和F型酸奶中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，均在10 μg/kg以上。己酸作為酸奶中發(fā)酵菌種的重要代謝產(chǎn)物，與發(fā)酵劑中乳桿菌的比例有關(guān)，其在A型菌種制備的酸奶中的含量較高，在其他種酸奶中的含量無顯著性差異。辛酸在不同發(fā)酵劑制備的酸奶中含量差距并不大。

表3 不同發(fā)酵劑制備的豌豆酸奶的風(fēng)味成分Table 3 Flavor Components of pea yoghurt prepared with different starter cultures

2.2.4 酸奶發(fā)酵劑對豌豆酸奶感官特性的影響

豌豆酸奶的感官評價(jià)主要包括4個(gè)方面即氣味、滋味、顏色和質(zhì)構(gòu)。具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表4。表5展示了不同發(fā)酵劑制備的豌豆酸奶的感官評分。對于顏色，不同的樣品間并無顯著性差異，說明發(fā)酵劑對酸奶的顏色影響不大，主要與豌豆?jié){本身的顏色有關(guān)。在質(zhì)構(gòu)上，不同的發(fā)酵劑制備的酸奶評分具有一定的差異，但無顯著性差異，A型菌種發(fā)酵酸奶的質(zhì)構(gòu)評分最高，酸奶表面光潔，凝乳塊均勻且乳清析出少；而E型和F型菌種發(fā)酵酸奶的質(zhì)構(gòu)評分最低，主要表現(xiàn)為凝乳塊松散且乳清析出較多，該感官評價(jià)結(jié)果與質(zhì)構(gòu)的測定結(jié)果一致。

氣味方面，主要和揮發(fā)性風(fēng)味有關(guān)，其中D型、E型和F型菌種發(fā)酵的豌豆酸奶中的異味成分含量整體偏低，所以氣味評分偏高，A型、B型和C型菌種發(fā)酵的酸奶，則因?yàn)楫愇冻煞值暮科?，所以氣味評分偏低。

滋味除了與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有關(guān)，還與非揮發(fā)性酸以及發(fā)酵微生物的代謝產(chǎn)物有關(guān)，所以影響滋味的因素更加復(fù)雜。從感官評定的結(jié)果看，A型菌種和C型菌種制備的豌豆酸奶的滋味分別獲得最高評分和最低評分，且存在顯著性差異，剩余4種菌種制備的酸奶的滋味評分較為接近。從總體評價(jià)結(jié)果來看，A型菌種發(fā)酵酸奶接受程度最高，這主要跟其較高的滋味評分和質(zhì)構(gòu)評分有關(guān)。而C型菌種發(fā)酵酸奶的總體接受度最低，這主要是由于其滋味評分最低。

表4 豌豆酸奶的感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 4 Sensory evaluation standard of pea yoghurt

表5 不同發(fā)酵劑制備的豌豆酸奶的感官評分 單位：分

3 討論

本文的創(chuàng)新點(diǎn)主要是采用了一種新型的豌豆?jié){制備方式，優(yōu)化后的豌豆?jié){的風(fēng)味得到了極大的改善，異味成分明顯減少。本研究所使用的發(fā)酵基料完全來自于豌豆，而非采用豌豆和牛奶的混合物來進(jìn)行酸奶的制備。在提供了優(yōu)化的豌豆?jié){基料的基礎(chǔ)上，研究了不同直投式發(fā)酵劑對于豌豆酸奶的風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)、感官等品質(zhì)的影響。

與豆?jié){相比，豌豆?jié){的風(fēng)味物質(zhì)除了大豆酸奶中常見的醛酮類以外，還有特有的吡嗪，所以豌豆?jié){風(fēng)味較豆?jié){更為復(fù)雜。研究表明不同的發(fā)酵菌種會對大豆酸奶的風(fēng)味造成不同的影響，目前關(guān)于發(fā)酵劑對豌豆酸奶品質(zhì)影響的研究很少，市面上也無針對豌豆酸奶的直投式發(fā)酵劑。本研究采用優(yōu)化的制備工藝得到的豌豆?jié){作為原料，研究了不同的直投式發(fā)酵劑對豌豆酸奶風(fēng)味與質(zhì)構(gòu)特性的影響，從而得出品質(zhì)較佳的豌豆酸奶。