王子媛，宋庭羽，邵毅君，凌霞，侯強(qiáng)川，郭壯*

1(湖北文理學(xué)院, 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽，441053)2(襄陽市公共檢驗檢測中心，湖北 襄陽，441001)

酸肉是采用自然發(fā)酵的方式制得的一種特色發(fā)酵食品，因其味道獨特、香氣宜人和口感較佳，在湖南省、貴州省和江西省等地廣泛流傳[1]。酸肉的制作流程為將鹽均勻涂抹在生鮮肉上，而后將處理好的鮮肉放入密封性能良好的土陶中，同時加入辣椒、米粉、胡椒和糯米粉等輔料進(jìn)行密封發(fā)酵，發(fā)酵完成至少需要2周[2]。近年來，國內(nèi)學(xué)者圍繞酸肉制作工藝進(jìn)行了諸多優(yōu)化實驗，其中姜亞[3]得出制作酸肉最優(yōu)的發(fā)酵工藝參數(shù)為糯米粉添加量25%、食鹽添加6%、35 ℃發(fā)酵60 d；韋誠等[4]通過研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵周期為50～80 d的酸肉品質(zhì)最佳；羅珍岑等[5]用乳酸鏈球菌素(Nisin)對酸肉貯藏時間進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示Nisin的添加可以顯著延長產(chǎn)品的貯藏時間。微生物類群對發(fā)酵食品的品質(zhì)形成和食用安全性均具有較大的影響[6]，但是目前有關(guān)酸肉微生物類群的研究仍相對較少。

經(jīng)過10多年的發(fā)展，高通量測序技術(shù)逐漸的被改進(jìn)并優(yōu)化，相較于上一代測序技術(shù)，其通量更高、測序成本更低且方便易操作[7]，目前該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于風(fēng)干發(fā)酵肉[8]、發(fā)酵蔬菜[6]以及發(fā)酵飲料[9]微生物多樣性解析中。本研究采用MiSeq高通量測序技術(shù)對湖南省張家界市慈利縣和湖南省湘西土家族苗族自治州古丈縣酸肉微生物多樣性進(jìn)行揭示，在對其門屬含量、α多樣性和β多樣性進(jìn)行比較分析的基礎(chǔ)上，使用BugBase以及PICRUSt軟件對酸肉中細(xì)菌表型和所行使的功能進(jìn)行預(yù)測。通過本研究的實施以期為后續(xù)酸肉產(chǎn)品品質(zhì)的改善提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸肉：納入本研究的酸肉樣品共有12 個，依次編號為CL1～CL5和GZ1～GZ7，其中CL1～CL5采集自慈利縣城西市場和柳林農(nóng)貿(mào)市場，GZ1～GZ7采集自古丈縣農(nóng)貿(mào)市場和默戎鎮(zhèn)農(nóng)貿(mào)市場。所有酸肉樣品均以豬肉為原料、切片大小一致且發(fā)酵時間為1個月左右。

rTaq酶、脫氧核糖核苷三磷酸、10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液，北京全式金生物技術(shù)有限公司；微生物基因組提取試劑盒，德國QIAGEN公司；338F/806R正反向引物，武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

R930機(jī)架式服務(wù)器，美國DELL公司；FluorChem FC3化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，美國ProteinSimple公司；CR21N型高速離心機(jī)，日本日立金屬株式會社；Vetiri梯度基因擴(kuò)增儀，美國AB公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺，美國Illumina公司；ND-2 000C微量紫外分光光度計，美國Nano Drop公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酸肉微生物宏基因組提取、16S rRNA序列擴(kuò)增及高通量測序

使用試劑盒對酸肉中微生物宏基因組DNA進(jìn)行提取，參照郭壯等[10]的擴(kuò)增體系及條件對細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而后將檢測合格且清潔的擴(kuò)增產(chǎn)物郵寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，通過MiSeq PE300平臺進(jìn)行高通量測序。

1.3.2 序列質(zhì)控及生物信息學(xué)分析

使用QIIME平臺對質(zhì)控后的下機(jī)序列進(jìn)行分析[11]，首次使用PyNAST工具將序列對齊[12]，繼而使用UCLUST算法構(gòu)建分類操作單元(operational taxonomic unit，OTU)[13]，然后使用ChimeraSlayer工具刪除含有嵌合體的OTU[14]，并從余下的OTU中挑選代表性序列在RDP[15]、Greengenes[16]和SILVA[17]數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行綜合比對，進(jìn)而明確酸肉細(xì)菌類群的構(gòu)成和相對含量，緊接著使用FastTree軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[18]，最后對細(xì)菌類群的α多樣性和β多樣性進(jìn)行分析，其中α多樣性指標(biāo)包含Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)，β多樣性分析為非加權(quán)主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis，PCoA)和加權(quán)非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA)聚類分析。本研究將平均相對含量>1.0%的門和屬定義為優(yōu)勢門和優(yōu)勢屬。

1.3.3 BugBase表型及PICRUSt基因功能預(yù)測

將OTU數(shù)據(jù)文件和樣品分類信息文件上傳至BugBase網(wǎng)站(https://bugbase.cs.umn.edu/)進(jìn)行樣品表型預(yù)測[19]；選取序列文件使用PICRUSt工具進(jìn)行酸肉微生物基因功能預(yù)測，同時使用蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫(clusters of orthologous groups of proteins，COGs)對預(yù)測的功能進(jìn)行注釋[20]。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

使用Past軟件進(jìn)行Mann-Whitney分析，使用R軟件進(jìn)行氣泡圖、瀑布圖、相關(guān)性圖和熱圖的繪制，使用Origin 2017軟件繪制主坐標(biāo)分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸肉細(xì)菌類群測序的基本情況

本研究使用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對采集自慈利和古丈地區(qū)的酸肉細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析，其測序產(chǎn)出序列信息如表1所示。

表1 測序深度、序列比對情況和α多樣性指標(biāo)Table 1 Sequencing depth, sequence alignment and α diversity index

由表1可知，12 個酸肉經(jīng)測序共得到402 138 條高質(zhì)量序列，其中有23 條序列比對失敗，因此共有402 115 條高質(zhì)量序列參與OTU的構(gòu)建，按照97%相似度對序列進(jìn)行劃分，去除嵌合體序列后，得到17 088個OTU，并將其劃分為9 個門、16 個綱、38 個目、59 個科和98 個屬。由表1亦可知，GZ5的Chao1和Shannon指數(shù)均為最高，其數(shù)值分別為2 289和7.19，說明GZ5的群落豐度及多樣性較其他酸肉均為最高。經(jīng)Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn)，慈利地區(qū)酸肉細(xì)菌類群的Chao1和Shannon指數(shù)均顯著偏低(P<0.05)，這說明其菌群豐度和多樣性均低于古丈地區(qū)酸肉。

2.2 酸肉細(xì)菌類群各分類學(xué)地位的含量及差異分析

由圖1-a可知，慈利地區(qū)酸肉中平均相對含量>1.0%的細(xì)菌門有厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)，平均相對含量分別為93.86%、2.92%和2.63%；古丈地區(qū)酸肉中平均相對含量>1.0%的細(xì)菌門僅有Firmicutes，平均相對含量為99.07%。經(jīng)Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn)，慈利地區(qū)酸肉中Firmicutes的含量顯著偏低(P<0.05)，而其他細(xì)菌門的含量在不同地區(qū)酸肉中差異不顯著(P>0.05)。

由圖1-b可知，慈利地區(qū)酸肉中平均相對含量>1.0%的細(xì)菌屬為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)和色鹽桿菌屬(Chromohalobacter)，平均相對含量分別為40.23%、44.35%、7.94%、2.40%和1.64%；古丈地區(qū)酸肉中平均相對含量>1.0%的細(xì)菌屬為Lactobacillus、Staphylococcus、Weissella、Lactococcus(乳球菌屬)和Macrococcus(巨型球菌屬)，平均相對含量分別為62.61%、5.18%、22.79%、3.65%和1.33%。經(jīng)Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn)，慈利地區(qū)酸肉中Lactococcus的含量顯著低于古丈地區(qū)(P<0.05)，分別為0.05%和3.65%，而其他細(xì)菌屬的含量差異則不顯著(P>0.05)。

a-門水平；b-屬水平圖1 基于門和屬水平的酸肉細(xì)菌類群構(gòu)成分析Fig.1 Bacterial taxa composition analysis of sour meat based on phylum and genus levels

此外，Lactobacillus和Weissella在慈利和古丈地區(qū)酸肉中的累計平均相對含量分別為48.17%和85.40%，且古丈地區(qū)酸肉中亦含有3.65%的Lactococcus。通過研究云南地區(qū)酸肉細(xì)菌類群構(gòu)成，米瑞芳等[21]發(fā)現(xiàn)Lactobacillus、Weissell和Lactococcus為其優(yōu)勢菌屬，平均相對含量分別為53.68%、22.31%和8.63%。由此可見，由于不同地區(qū)的酸肉均以豬肉為原料，并采用厭氧發(fā)酵制作而成，因此為乳酸菌的生長創(chuàng)造了有利的環(huán)境，進(jìn)而促使其成為了優(yōu)勢細(xì)菌類群。乳酸菌可使酯類物質(zhì)含量明顯增加，進(jìn)而提升了酸肉的風(fēng)味品質(zhì)[22]。除酸肉外，臘肉亦是湖北和湖南地區(qū)較為常見的發(fā)酵肉制品，采用高通量測序技術(shù)，董蘊(yùn)等[23]對恩施地區(qū)臘肉的菌群多樣性進(jìn)行了解析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其蘊(yùn)含的細(xì)菌類群主要為Staphylococcus、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)和假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)。酸肉和臘肉細(xì)菌類群存在明顯差異的原因可能在于兩者的制作工藝不同，臘肉為開放式發(fā)酵，且增加了煙熏等操作工藝[24]。

若某一OTU存在于所有12 個酸肉樣品中，則將其定義為核心OTU，本研究共發(fā)現(xiàn)了6 個核心OTU，其平均相對含量及注釋結(jié)果如圖2所示。

圖2 核心OTU平均相對含量的瀑布圖Fig.2 Waterfall plot representing the average relative content of core OTUs

由圖2可知，6 個核心OTU分別為OTU1407(Staphylococcus)、OTU3714(Lactobacillus)、OTU13870(Weissella)、OTU6884(Lactococcus)、OTU366(Corynebacterium)和OTU9607(Macrococcus)，其平均相對含量分別為14.89%、5.01%、1.79%、1.62%、0.99%和0.63%，累計平均相對含量達(dá)24.9%。由此可見，2個地區(qū)制作的酸肉共有部分細(xì)菌類群，這與屬水平上的研究結(jié)果一致。Staphylococcus和Macrococcus均隸屬于葡萄球菌科(Staphylococcaceae)[25]，有研究發(fā)現(xiàn)Staphylococcus具有降低廣式臘腸中亞硝酸鹽含量的作用[26]，而隸屬于Macrococcus的M.caseolyticus(溶酪大球菌)則可以加快廣式臘腸中脂肪和蛋白質(zhì)的氧化與風(fēng)味的降解[27]，因而劃分到OTU1407和OTU9607的細(xì)菌類群對酸肉品質(zhì)的形成可能具有積極的意義。值得一提的是，部分隸屬于Staphylococcus的細(xì)菌類群還具有潛在的致病性，如AN等[28]研究發(fā)現(xiàn)，S.epidermidis(表面葡萄球菌)可導(dǎo)致脂溢性皮炎的發(fā)生，BUBECK WARDENBURG等[29]研究發(fā)現(xiàn)S.aureus(金黃色葡萄球菌)可導(dǎo)致肺炎，嚴(yán)重情況下甚至還能導(dǎo)致死亡，因此在后續(xù)研究中積極開展隸屬于Staphylococcus菌株的篩選和安全性評價，對酸肉制品的產(chǎn)業(yè)化推動具有積極的意義。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，OTU10585(芽孢桿菌屬)僅存在于5 個慈利地區(qū)酸肉樣品中，但其相對含量均低于0.1%，何江紅等[30]研究發(fā)現(xiàn)Bacillus在川藏牦牛酸肉中具有較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶能力，由于酸肉制作過程中常加入糯米粉或米粉為原料，因而推測劃分到OTU10585的細(xì)菌可能會通過分解蛋白質(zhì)和淀粉進(jìn)而對酸肉的品質(zhì)產(chǎn)生影響。此外，本研究沒有發(fā)現(xiàn)有OTU僅存在于7 個古丈地區(qū)酸肉樣品中。為進(jìn)一步解析核心細(xì)菌類群間的互作關(guān)系，本研究對核心OTU的相關(guān)性進(jìn)行了分析，其結(jié)果如圖3所示。OTU13870(Weissella)和OTU366(Corynebacterium)之間呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(P<0.05)，且其相關(guān)系數(shù)為0.92，由此推測隸屬于Weissella與Corynebacterium的細(xì)菌類群在酸肉中可能存在一定的共生關(guān)系。

圖3 核心OTU的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis of core OTUs注：圓圈顏色越深且直徑越大，表明其相關(guān)系數(shù)越大

2.3 兩個地區(qū)酸肉細(xì)菌類群的β多樣性分析

本研究進(jìn)一步采用非加權(quán)PCoA和加權(quán)UPGMA聚類分析對2個地區(qū)酸肉細(xì)菌類群的β多樣性進(jìn)行解析，其結(jié)果如圖4所示。由圖4-a可知，2個地區(qū)制作的酸肉樣品在空間排布上呈現(xiàn)出分離趨勢，其中慈利地區(qū)樣品主要分布在2、3象限，而古丈地區(qū)樣品分布在1、2、4象限。圖4-b的結(jié)果亦呈現(xiàn)出相似的現(xiàn)象，這說明2個地區(qū)的酸肉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在一定差異。

a-非加權(quán)PCoA;b-加權(quán)UPGMA聚類分析圖4 非加權(quán)PCoA和加權(quán)UPGMA聚類分析Fig.4 Unweighted PCoA and weighted UPGMA clustering analysis

2.4 酸肉細(xì)菌類群的表型預(yù)測及功能預(yù)測分析

本研究使用BugBase對2個地區(qū)酸肉細(xì)菌類群的表型進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，2個地區(qū)酸肉細(xì)菌類群在好氧、移動原件含量、生物膜形成、氧化脅迫耐受、革蘭氏陽性、革蘭氏陰性和致病潛力等表型上無顯著差異(P>0.05)，而在厭氧和兼性厭氧表型上分別有顯著(P<0.05)和非常顯著差異(P<0.01)，這說明慈利地區(qū)酸肉細(xì)菌類群中厭氧細(xì)菌的相對含量顯著高于古丈地區(qū)(P<0.05)，而兼性厭氧型細(xì)菌的相對含量則呈現(xiàn)相反的趨勢(P<0.01)。本研究進(jìn)一步對酸肉細(xì)菌類群的基因功能進(jìn)行了預(yù)測，其結(jié)果如圖6所示。

a-厭氧；b-好氧；c-移動原件含量；d-兼性厭氧；e-生物膜形成；f-氧化脅迫耐受；g-革蘭氏陽性；h-革蘭氏陰性；i-致病潛力圖5 慈利和古丈地區(qū)酸肉細(xì)菌類群的表型預(yù)測Fig.5 Phenotypic prediction of sour meat samples from Cili and Guzhang regions注：*代表差異顯著(P<0.05)，**代表差異非常顯著(P<0.01)

由圖6可知，慈利和古丈地區(qū)酸肉細(xì)菌類群在“氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝”、“碳水化合物運輸與代謝”和“翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生”功能上的相對含量較高，這說明2個地區(qū)酸肉細(xì)菌類群可能在自身代謝相關(guān)功能上表達(dá)較高。經(jīng)Mann-Whitney分析發(fā)現(xiàn)，2個地區(qū)酸肉細(xì)菌類群在各功能上的表達(dá)差異均不顯著(P>0.05)。

3 結(jié)論

使用高通量測序技術(shù)解析發(fā)現(xiàn)，慈利和古丈地區(qū)酸肉中的細(xì)菌類群主要由Lactobacillus、Staphylococcus和Weissella構(gòu)成，主要為厭氧菌或兼性厭氧菌，且細(xì)菌類群在“氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝”、“碳水化合物運輸與代謝”以及“翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生”等自身代謝相關(guān)功能上表達(dá)較高。同時，通過研究2個地區(qū)的酸肉發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)制作的酸肉細(xì)菌類群多樣性存在一定的差異。