邱有玉，張世文

650100昆明，昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 頭頸外科

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)是最常見的惡性腫瘤之一[1]，男性發(fā)病率顯著高于女性，HNSCC在男性中的發(fā)病率和死亡率分別位于所有惡性腫瘤的第6位和第7位，是頭頸部最常見的惡性腫瘤，約占頭頸部所有惡性腫瘤的90%以上，并且其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢[2-3]。雖然早期HNSCC患者的預(yù)后相對較好，5年生存率約為77%～91%,但大于70%的患者就診時為局部侵犯和(或)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后較差，5年生存率僅有4%～61%[4]。據(jù)報道，盡管近幾十年來外科技術(shù)的進(jìn)步、輔助放射治療、化療方案的優(yōu)化，以及近年來免疫治療和靶向治療的臨床應(yīng)用，使早期和少部分中期HNSCC患者通過手術(shù)和相應(yīng)的輔助治療干預(yù)獲得較好的預(yù)后，但是大部分中晚期HNSCC患者的生存率和生活質(zhì)量并沒有隨著治療手段的提高而得到實質(zhì)性改善[5]。并且免疫治療和靶向藥物的價格昂貴，大部分患者無力承擔(dān)昂貴的醫(yī)療費用使其很難成為臨床上常規(guī)的治療方法，并且其在臨床上的應(yīng)用窗口較窄。因此，迫切需要探索新的有效廉價治療方法來改善HNSCC患者的預(yù)后，提高患者的生活質(zhì)量并減少毒副作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)金納米棒(gold nanorods,GNRs or AuNRs)在近紅外光的照射下，其表面離子吸收光產(chǎn)生表面等離子共振效應(yīng)(surface plasmon resonance,SPR)，將光能轉(zhuǎn)化為瞬時熱效應(yīng)能夠高效的殺滅腫瘤細(xì)胞，稱為等離子共振光熱療法(plasmonic photothermal therapy,PPTT)[6]。AuNRs-SPR光熱療法在腫瘤的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。本文綜述了近年來AuNRs在腫瘤中的應(yīng)用進(jìn)展，并著重探討AuNRs誘導(dǎo)HNSCC癌細(xì)胞的死亡機制和腫瘤的關(guān)系，為將來AuNRs在臨床上治療HNSCC提供理論依據(jù)。

1 AuNRs在腫瘤中的研究概述

近年來，隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展，使得人們對納米材料的研究更加深入，研究發(fā)現(xiàn)金納米顆粒(gold nanoparticles,AuNP)具有獨特的物理特性，功能多樣，易制備，且在生物體具有獨特的生物親和效應(yīng)和相對低毒等優(yōu)點[7-9]。其有望為將來腫瘤的診斷和治療帶來新的變革。AuNP的形貌和尺寸可控，可根據(jù)需要將其制備成多種不同形狀的AuNP，如金納米棒、金納米殼、金納米球、金納米籠、金納米星狀體和金納米圓盤等結(jié)構(gòu)，從而廣泛應(yīng)用于生物成像、生物傳感、材料檢測和疾病診治[7]。其中，在生物醫(yī)學(xué)體系中應(yīng)用最廣泛的是AuNRs，由于AuNRs具有由長度和寬度決定的SPR譜帶，可使其譜帶范圍從可見光(600 nm)到近紅外光(1 100 nm以上)的電磁頻譜區(qū)域[9]。AuNRs由于形貌及尺寸可控、尺寸大小接近生物分子，光學(xué)可調(diào)以及獨特的SPR等特性，易被葉酸、單抗等修飾后獲得腫瘤靶向性，并且其沿襲了本材料的理化性質(zhì)，易于制備，具有良好的穩(wěn)定性，同時具備獨特的生物親和效應(yīng)、光學(xué)特性和低生物毒性，使得其在惡性腫瘤診斷、治療等領(lǐng)域體現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢[7]。

2 金納米微粒在腫瘤中的應(yīng)用

2.1 金納米微粒在腫瘤診斷中的作用

臨床應(yīng)用的金納米顆粒尺寸介于10～100 nm之間，具有較大的表面積，可同時結(jié)合多個或多種分子靶向配體(單克隆抗體、多肽或小分子)、放射性同位素和抗癌藥物用于診斷和治療疾病[10]。金納米微粒具有較大的X射線吸收系數(shù)和SPR效應(yīng)，可作為CT的造影劑應(yīng)用于影像學(xué)疾病診斷[11]。相較于傳統(tǒng)的全氟化納米碳超聲造影劑成像，金納米微粒包裹的L-薄荷醇可在近紅外激光照射下持續(xù)穩(wěn)定地產(chǎn)生L-薄荷醇?xì)馀?，增強體內(nèi)超聲成像的對比度且超聲持續(xù)時間更長，提高腫瘤的診斷及病理分型[12]。金納米棒等離子共振效應(yīng)產(chǎn)生較強的電磁場，可增強位于它們附近的熒光團(tuán)的熒光強度，提高熒光成像和X射線計算機斷層掃描雙模成像檢測腫瘤的準(zhǔn)確性[13]。另外，被聚乙二醇修飾的金納米微粒在生物體內(nèi)的生物相容性更好、生物利用度和紅外光的吸收效率更高[10]。肺癌細(xì)胞可分泌ENO1，在肺癌患者中水平升高[14]。研究發(fā)現(xiàn)耦合了ENO1抗體的金納米顆粒復(fù)合體可作為電化學(xué)信號探針，通過肺癌患者的呼氣即可檢測出極低水平的ENO1，達(dá)到診斷肺癌的目的[15]。耦合了ENO1抗體的金納米顆粒復(fù)合體是無創(chuàng)、簡易、安全地診斷肺癌的方法,可用作診斷肺癌的特異分子生物標(biāo)志物。

2.2 金納米微粒在腫瘤治療中的作用

輔助放化療藥物抵抗和毒副作用是當(dāng)前臨床工作面臨的一大挑戰(zhàn)，如何增加藥物在腫瘤組織中的富集，提高殺滅腫瘤的能力并減少藥物毒副作用是當(dāng)前亟需解決的問題。抗體修飾的金納米微粒能搭載多種化療藥物在腫瘤組織中特異性富集，且在達(dá)到腫瘤組織前不會被提前釋放降解，避免脫靶效應(yīng)，同時降低了化療藥物的給藥劑量，及最小化化療相關(guān)的副作用，從而使腫瘤組織中的有效藥物濃度更高[16]。

另外，金納米微粒在生物體內(nèi)半衰期較長，可增強其通透性和滯留性作用[17]，并通過脈管系統(tǒng)的滲漏延長金納米微粒在腫瘤組織中滯留時間。修飾過的金納米微粒復(fù)合體到達(dá)目標(biāo)靶位，在配體的介導(dǎo)下，通過細(xì)胞內(nèi)化(內(nèi)吞、吞噬、和胞飲)作用[18]進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)釋放抗腫瘤藥物，達(dá)到殺滅癌細(xì)胞的目的。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用金納米棒耦合表皮生長因子受體時，耦合的金納米棒復(fù)合體能夠在頭頸部鱗癌細(xì)胞中靶向富集，在近紅外光照射下，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[19]。金納米微粒在X線照射下，可加速癌細(xì)胞DNA鏈的快速斷裂和損傷，促進(jìn)癌細(xì)胞死亡，因此，金納米微?；蚩勺鳛榉派渲委煹脑雒魟?。因此，金納米棒光熱效應(yīng)在腫瘤的治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。

3 金納米棒光熱誘導(dǎo)頭頸部惡性腫瘤細(xì)胞死亡機制

金納米棒吸收近紅外光并將其轉(zhuǎn)換成熱量，主要通過凋亡和/或壞死導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20]。優(yōu)化AuNRs的濃度和PPTT激光功率，實現(xiàn)最大程度的誘導(dǎo)癌細(xì)胞啟動凋亡程序促進(jìn)細(xì)胞凋亡，避免細(xì)胞壞死釋放細(xì)胞內(nèi)成分到細(xì)胞外環(huán)境，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，損傷周圍正常組織[21]，同時探索其作用機理非常重要，為預(yù)測和優(yōu)化AuNRs光熱療法治療惡性腫瘤提供基礎(chǔ)。我們前期研究顯示[22]，AuNRs表面修飾表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)能特異性靶向表達(dá)EGFR的Hep-2細(xì)胞，且無明顯細(xì)胞毒性。在后續(xù)的相關(guān)實驗研究證實，AuNRs表面修飾EGFR，濃度為280 μg/kg，PPTT激光頻率為2.5 W/cm2時，實現(xiàn)最大程度地誘導(dǎo)頭頸鱗癌裸鼠移植瘤模型腫瘤細(xì)胞凋亡。Ali等[8]的研究報道了類似的研究結(jié)果。

3.1 PI3K/AKT/mTOR通路誘導(dǎo)下咽惡性腫瘤細(xì)胞凋亡

我們實驗組前期研究發(fā)現(xiàn)[23]，EGFRmAb-AuNPs可特異性結(jié)合高表達(dá)EGFR的下咽癌細(xì)胞。有研究顯示，EGFR及其下游的PI3K/AKT/mTOR信號通路可在多種惡性腫瘤中被激活，激活后的PI3K/AKT/mTOR信號通路可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞生長失控。下咽惡性腫瘤細(xì)胞在EGFRmAb-AuNPs+近紅外光譜(near-infrared,NIR)處理后，AKT的Thr308和Ser473位點的磷酸化水平顯著降低，磷酸化AKT Thr308位點的p-PDK1也降低，PI3K/AKT/mTOR信號通路下游靶點GSK-3β的磷酸化水平大幅度下降，其下游的Bax、caspase 3和caspase 9不被磷酸化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[24]。此外，負(fù)調(diào)控PI3K/AKT/mTOR通路的p-PTEN腫瘤抑制因子[25-26]水平升高。這些數(shù)據(jù)表明，在EGFRmAb-AuNPs+NIR處理后，PI3K/AKT/mTOR通路下調(diào)，下咽惡性腫瘤細(xì)胞凋亡(圖1)。

圖1 PI3K/AKT通路圖

3.2 DNA損傷應(yīng)答通路誘導(dǎo)下咽惡性腫瘤細(xì)胞凋亡

前期研究還發(fā)現(xiàn)[23]，EGFRmAb-AuNPs可進(jìn)入到下咽惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核，在NIR照射下，ATM、BRCA1等雙鏈DNA斷裂修復(fù)因子表達(dá)水平升高，提示DNA損傷，基因組完整性被破壞，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3.3 線粒體途徑誘導(dǎo)頭頸部鱗癌細(xì)胞凋亡

三苯基膦修飾的α螺旋凋亡肽(TPP-KLA)可特異性靶向線粒體膜，誘導(dǎo)線粒體功能障礙，觸發(fā)內(nèi)在線粒體通路，釋放細(xì)胞凋亡信號(如細(xì)胞色素C)，最終導(dǎo)致線粒體依賴性的程序性細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)陽離子肽R8和靶向線粒體的促凋亡肽TPP-KLA通過Au-S鍵共修飾金納米微粒，形成AuNS-pep,并通過靜電相互作用將帶負(fù)電荷的透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)進(jìn)一步涂覆在AuNS-pep表面，以靶向腫瘤細(xì)胞。被腫瘤細(xì)胞識別內(nèi)化后，AuNS-pep靶向線粒體膜，觸發(fā)內(nèi)源性線粒體凋亡通路，同時在NIR照射下，通過金納米微粒的光熱療法(photothermal therapy,PTT)，線粒體受損，線粒體跨膜點位喪失，觸發(fā)內(nèi)在線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[27-30]。Perez-Hernandez等[31]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AuNRs進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，在近紅外光照射下，Bid被蛋白裂解激活為有活性的tBid，tBid轉(zhuǎn)運至線粒體中，誘導(dǎo)Bax和/或Bak寡聚(激活)，線粒體外膜通透性增高，線粒體膜電位(Ψm)損失，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放和caspase-9激活，進(jìn)而導(dǎo)致caspase-3激活啟動線粒體通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[32]。我們的前期細(xì)胞學(xué)實驗中也顯示，Hep-2細(xì)胞中加入EGFRmAb-AuNRs,在近紅外光照射后，caspase-3表達(dá)增加，數(shù)據(jù)表明，EGFRmAb-AuNRs誘導(dǎo)的凋亡依賴線粒體通路[22]。

3.4 NETosis途徑誘導(dǎo)頭頸部鱗癌細(xì)胞凋亡

中性粒細(xì)胞胞外捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒細(xì)胞一種不同于凋亡和壞死的新型死亡方式，是以核內(nèi)或線粒體內(nèi)DNA為骨架，負(fù)載抗微生物肽及水解酶組成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包裹及殺傷外來入侵的病原體[33]。同時，NETs對病原體的捕捉固定可以增強其他白細(xì)胞的吞噬作用[34]。Ali等[8]研究金納米棒光熱效應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機制時，共測量了5 222種蛋白，有效蛋白1 202種，當(dāng)金納米棒介導(dǎo)的離子共振光熱療法運用于頭頸鱗狀細(xì)胞癌時，觀察到組蛋白H2、組蛋白H4、IL-18和Pin1表達(dá)水平明顯升高，通過IL-18[35]和染色質(zhì)脫凝[36]兩種途徑觸發(fā)NETosis途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3.5 金納米微粒誘導(dǎo)其他惡性腫瘤細(xì)胞死亡機制

3.5.1 免疫激活介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡途徑 當(dāng)NK細(xì)胞活化后可通過釋放穿孔素和顆粒酶來進(jìn)行免疫監(jiān)視并誘導(dǎo)細(xì)胞溶解，同時還可以分泌干擾素和誘導(dǎo)死亡受體表達(dá)，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[37]，因此可通過靶向 NK細(xì)胞來誘導(dǎo)腫瘤死亡。Jiao等[38]通過靶向腫瘤的抗GD2抗體hu14.18K322A偶聯(lián)金納米顆粒形成HGNP復(fù)合物，通過Fab片段特異性識別GD2抗原陽性的神經(jīng)母細(xì)胞瘤和黑色素瘤細(xì)胞，同時功能性Fc段與NK細(xì)胞表面的FcR識別，引起抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，經(jīng)外源途徑引起腫瘤細(xì)胞的凋亡，且對GD2陰性的正常組織無毒副作用。結(jié)果表明，HGNP有望成為治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤和黑色素瘤癌癥的特異有效靶向藥。Mocan等[39]通過負(fù)載了MUC-1(CD227)的金納米顆粒(NPs)靶向腹膜巨噬細(xì)胞上呈遞的腫瘤特異性抗原，增強了腹膜巨噬細(xì)胞的活化，增加其對腫瘤細(xì)胞的吞噬作用。

3.5.2 沉默熱敏感基因增強光熱誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡途徑 應(yīng)激蛋白激酶(SAPK/JNK)在光熱誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中伴有重要角色，在熱休克蛋白70(heat shock protein 70， HSP70)高表達(dá)的細(xì)胞中，可強烈抑制SAPK/JNK的活化，提示HSP70可通過抑制SAPK/JNK活化上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻止細(xì)胞凋亡。然而，當(dāng)細(xì)胞中HSP70持續(xù)升高時，熱休克不抑制SAPK/JNK的活化，而是在SAPK/JNK活化后的某個時間點抑制細(xì)胞凋亡，阻斷細(xì)胞凋亡的效應(yīng)步驟[40]。因此，HSP70可通過抑制SAPK/JNK通路抑制細(xì)胞凋亡。Wang等[41]的研究顯示，HSP72(siHSP72)/HA耦合金納米微粒(GNS / siHSP72 / HA)，可有效沉默HSP72(95%)，通過金納米微粒介導(dǎo)的PTT，增加腫瘤細(xì)胞的熱療敏感性，提高了惡性腫瘤的治療效果。

4 總 結(jié)

金納米棒是用于疾病的診斷和治療最常用的納米材料之一，金納米棒在近紅外光的照射下表面產(chǎn)生等離子共振效應(yīng)，將光能轉(zhuǎn)化為熱能殺死腫瘤細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)精確控制金納米棒的量、近紅外光的照射功率和時間時，能達(dá)到誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞啟動凋亡途徑導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡的理想模型。且易于被特異抗體及抗腫瘤藥物等修飾形成共軛復(fù)合物，修飾后的金納米棒本身屬性不變，但腫瘤靶向富集特異性更好，全身毒性反應(yīng)較小和生物相容性更好。目前的研究發(fā)現(xiàn)，其可通過介導(dǎo)線粒體在內(nèi)的多條細(xì)胞凋亡途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，但是研究成果都是基于細(xì)胞水平和動物模型，且缺乏多中心的研究數(shù)據(jù)支持，具體誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機制還不清楚，需要后續(xù)進(jìn)一步的研究闡釋金納米棒誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機制，金納米棒有望成為將來治療頭頸鱗狀細(xì)胞癌的特異靶向藥物。

作者聲明：本文全部作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；并承諾論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)資料等已按照有關(guān)規(guī)定保存，可接受核查。

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測系統(tǒng)的學(xué)術(shù)不端檢測。

同行評議：經(jīng)同行專家雙盲外審，達(dá)到刊發(fā)要求。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

文章版權(quán)：本文出版前已與全體作者簽署了論文授權(quán)書等協(xié)議。