王靜，李靈敏，劉曉峰,樊代明

250000 濟(jì)南，中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六〇醫(yī)院 消化內(nèi)科(王靜、李靈敏、劉曉峰)；710032 西安，空軍軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院 腫瘤生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(王靜、樊代明)

胃癌是全球致死率第三的惡性腫瘤[1]，也是我國(guó)發(fā)病率最高的消化道惡性腫瘤，進(jìn)展期胃癌患者的5年生存率僅約20%[2]。因此，探討胃癌惡性進(jìn)展的關(guān)鍵分子機(jī)制，是預(yù)防胃癌轉(zhuǎn)移、改善患者預(yù)后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。叉頭框蛋白J1(forkhead box J1, FOXJ1)在胃彎曲的發(fā)育形成中發(fā)揮重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能[3]。我們前期率先發(fā)現(xiàn)FOXJ1是抑制胃癌增殖和轉(zhuǎn)移的重要轉(zhuǎn)錄因子，并可作為影響胃癌患者生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素[4]。然而FOXJ1在胃癌中的作用機(jī)制仍未明確。

胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多階段進(jìn)展過(guò)程，而細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)降解、基底膜破壞是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移最初環(huán)節(jié)。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)可降解ECM，有利于腫瘤細(xì)胞穿破基底膜，發(fā)生浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。其中，IV型膠原酶MMP-2、MMP-9的作用最為直接[5]。我們前期發(fā)現(xiàn)FOXJ1可抑制胃癌細(xì)胞分解Matrigel從而穿過(guò)微孔濾膜的能力[4]，而Matrigel的主要成分即為Ⅳ型膠原、層黏連蛋白等。另外，Wnt/β-catenin通路異?；罨谖赴┑脑鲋?、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等多種病理過(guò)程均發(fā)揮重要作用[6]。有研究報(bào)道，F(xiàn)OXJ1-Wnt/β-catenin軸調(diào)控斑馬魚(yú)Kuffer’s囊泡纖毛的形成[7]，Wnt通路可能是FOXJ1轉(zhuǎn)錄調(diào)控纖毛形成網(wǎng)絡(luò)中的重要通路[8]。因此，本研究針對(duì)參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子MMPs和通路Wnt/β-catenin，探討FOXJ1抑制胃癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為進(jìn)一步拓展對(duì)胃癌轉(zhuǎn)移信號(hào)通路的新認(rèn)識(shí)、開(kāi)發(fā)干預(yù)胃癌轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

高/低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細(xì)胞系MKN28M/MKN28NM由空軍軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院腫瘤生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建立并保存，即將人胃癌細(xì)胞系MKN28經(jīng)反復(fù)Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)篩選獲得的高/低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細(xì)胞亞系，病毒包裝細(xì)胞293T購(gòu)自ATCC。MKN28M-FOXJ1、MKN28M-control、MKN28NM-shFOXJ1、MKN28NM-shcontrol使用含2 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系建立

過(guò)表達(dá)慢病毒和RNA干擾慢病毒載體系統(tǒng)購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，包括：GV166載體、GV248載體、pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體。根據(jù)MOI值1∶100進(jìn)行慢病毒感染，加入嘌呤霉素(2～4 μg/mL)篩選7～10 d，獲得穩(wěn)定感染細(xì)胞株，利用Real-time PCR和Western blot鑒定感染效率。

1.3 Real-time PCR

各靶基因的引物序列為：FOXJ1(F)：5’- TGGATCACGGACAACTTCTGCTA-3’;FOXJ1(R)：5’- CACTTGTTCAGAGACAGGTTGTGG-3’;MMP2(F)：5’- ACGATGATGACCGCAAGT-3’;MMP2(R)：5’-GGTTCATTTGGCGGACTG-3’;MMP9(F)：5’- TCCCTGGAGACCTGAGAACC-3’;MMP9(R)：5’-AAACTACTCGGAAGACTTGCC-3’;TIMP1(F)：5’- TCTGGAAACGACATTTATGG-3’;TIMP1(R)：5’- GTTGGAGGCCTGCTTATGGG-3;TIMP2(F)：5’-ACTGTTGGTGGGAACTCAGAAG-3’;TIMP2(R)：5’-CAAGGTCAATGTCAGGAGAGG-3’;GAPDH(F)：5’- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’;GAPDH(R)：5’- TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。

使用SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒，進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。

1.4 Western blot

分別提取總蛋白與核蛋白，應(yīng)用不連續(xù)Tris-SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳系統(tǒng)，采用半干電轉(zhuǎn)法，稀釋相應(yīng)一抗：FOXJ1(Abcam，ab220029，1∶1 000)，MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2(Santa Cruz，sc13595、sc21733、sc365905、sc21735，1∶500)，β-catenin、c-Myc、N-cadherin(Cell Signalling，#8480、#18583、#13116，1∶1 000)，β-actin(Sigma，A 1978，1∶2 000)，Histone H3(Cell Signalling，#4499，1∶2 000)孵育過(guò)夜，孵育對(duì)應(yīng)二抗(1∶2 000)，在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上記錄顯色情況。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

105例胃癌及其對(duì)應(yīng)癌旁組織石蠟標(biāo)本取自2007年11月至2009年2月西京消化病醫(yī)院的手術(shù)病例，并經(jīng)HE染色確診。所有患者術(shù)前均未接受放化療，術(shù)后接受常規(guī)化療?；颊呦嚓P(guān)信息及臨床病理資料通過(guò)病例系統(tǒng)獲取，其中男性67例，女性38例，臨床分期依據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)第七版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)審核通過(guò)并獲得知情同意。

采用SP免疫組化染色法，各一抗孵育濃度如下： FOXJ1(Abcam，ab220029)1∶400，β-catenin(Cell Signaling Technology，#8480)1∶200。

在對(duì)患者臨床病理資料未知的前提下，由2名病理科醫(yī)生參考Sinicrope[9]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，采用半定量法，主要依據(jù)染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占比率分別綜合評(píng)分。

1.6 細(xì)胞免疫熒光染色

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定20 min，1%BSA室溫封閉30 min，稀釋對(duì)應(yīng)一抗(鼠抗人FOXJ1單克隆抗體1∶400，兔抗人β-catenin多克隆抗體1∶200)分別孵育，加入綠色熒光標(biāo)記羊抗鼠二抗和紅色熒光標(biāo)記羊抗兔二抗(1∶200)，加入DAPI染細(xì)胞核(1∶1 000)，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

各組細(xì)胞以每孔6 000個(gè)細(xì)胞的濃度接種于96孔板上。將180 ng TOPflash或FOPflash表達(dá)質(zhì)粒與12 ng pRL-TK(Renilla-TK-熒光素酶載體，Promega)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以pRL-TK 為內(nèi)參，24 h后測(cè)定TOPflash/FOPflash值。TOPflash為報(bào)告質(zhì)粒，F(xiàn)OPflash為陰性對(duì)照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析FOXJ1和β-catenin在胃癌中的表達(dá)相關(guān)性；采用t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)分析各實(shí)驗(yàn)中的組間差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FOXJ1可抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力

前期細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：上調(diào)FOXJ1可抑制胃癌細(xì)胞遷移，而下調(diào)FOXJ1可促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移；Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：FOXJ1可抑制胃癌細(xì)胞遷移及侵襲入ECM的能力[4]。

2.2 FOXJ1抑制胃癌細(xì)胞中MMP2和MMP9的表達(dá)

采用real-time PCR和western blot分別檢測(cè)上調(diào)/下調(diào)FOXJ1對(duì)高/低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細(xì)胞亞系MKN28M/MKN28NM中MMP2和MMP9表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)FOXJ1可顯著降低MKN28M中MMP2、MMP9的表達(dá)，而干擾FOXJ1可明顯增加MKN28NM中MMP2、MMP9的表達(dá)(圖1)。

圖1 FOXJ1抑制胃癌細(xì)胞MMP2和MMP9的表達(dá)

2.3 FOXJ1促進(jìn)胃癌細(xì)胞中TIMP1、TIMP2的表達(dá)

對(duì)上調(diào)/下調(diào)FOXJ1的胃癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中TIMP1、TIMP2表達(dá)水平進(jìn)行mRNA和蛋白水平檢測(cè)，結(jié)果表明，MKN28NM-shFOXJ1細(xì)胞中TIMP1、TIMP2表達(dá)明顯減弱，而MKN28M-FOXJ1細(xì)胞中，雖然TIMP1表達(dá)變化不明顯，但是TIMP2表達(dá)明顯增強(qiáng)(圖2)。

圖2 FOXJ1促進(jìn)胃癌細(xì)胞TIMP2的表達(dá)

2.4 FOXJ1與β-catenin在胃癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)

通過(guò)免疫組化檢測(cè)FOXJ1和β-catenin在胃癌組織中的表達(dá)，并分析二者表達(dá)相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在105例胃癌組織中(TNM Ⅲ+Ⅳ期50例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移74例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移12例)，有42例呈β-catenin核表達(dá)陽(yáng)性，51例呈FOXJ1表達(dá)陽(yáng)性(圖3)，Spearman分析提示，胃癌組織中β-catenin核表達(dá)與FOXJ1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為-0.228，P=0.003，表1)。

表1 FOXJ1和β-catenin在胃癌中的表達(dá)負(fù)相關(guān)

圖3 免疫組化檢測(cè)FOXJ1和β-catenin在胃癌中的表達(dá)負(fù)相關(guān)

2.5 FOXJ1可能參與調(diào)控胃癌細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路

首先通過(guò)免疫熒光染色，檢測(cè)上調(diào)/下調(diào)FOXJ1對(duì)各穩(wěn)轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞系中β-catenin表達(dá)定位的影響，結(jié)果顯示：下調(diào)FOXJ1可促進(jìn)β-catenin在MKN28NM細(xì)胞漿中聚集，并增加細(xì)胞核中β-catenin表達(dá)；而上調(diào)FOXJ1可明顯減少M(fèi)KN28M細(xì)胞漿中β-catenin聚集，并抑制細(xì)胞核中β-catenin表達(dá)(圖4A)。進(jìn)一步檢測(cè)β-catenin在胞核/胞漿中的分布，如圖4B和圖4C所示，F(xiàn)OXJ1對(duì)各亞系細(xì)胞總蛋白中β-catenin的量影響不大，但是下調(diào)FOXJ1可以增加MKN28NM細(xì)胞核蛋白中β-catenin的表達(dá)量，而上調(diào)FOXJ1可降低MKN28M細(xì)胞核蛋白中β-catenin的表達(dá)量。提示FOXJ1可能抑制β-catenin由細(xì)胞漿向細(xì)胞核移動(dòng)。同時(shí)，我們還檢測(cè)了FOXJ1對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路重要下游基因c-Myc、N-cadherin的表達(dá)量(圖4D)和胃癌細(xì)胞中內(nèi)源性T細(xì)胞因子(T cell factor，TCF)轉(zhuǎn)錄活性(圖4e)的影響，發(fā)現(xiàn)下調(diào)FOXJ1可以顯著升高M(jìn)KN28NM細(xì)胞中c-Myc、N-cadherin表達(dá)量和TCF轉(zhuǎn)錄活性，而上調(diào)FOXJ1可降低MKN28M細(xì)胞中c-Myc、N-cadherin表達(dá)量和TCF轉(zhuǎn)錄活性。以上結(jié)果均提示FOXJ1部分抑制胃癌細(xì)胞Wnt/β-catenin通路活性。

圖4 FOXJ1可能抑制胃癌細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路

3 討 論

侵襲與轉(zhuǎn)移是影響胃癌轉(zhuǎn)歸的最重要因素。但我們對(duì)胃癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍知之有限，其中涉及多個(gè)基因、多條信號(hào)通路的交互作用,發(fā)現(xiàn)調(diào)控、連接胃癌轉(zhuǎn)移的多條信號(hào)通路的關(guān)節(jié)點(diǎn)，對(duì)理解胃癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，開(kāi)發(fā)治療胃癌的靶向藥物具有重要意義。

FOX家族是一類(lèi)新的參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要轉(zhuǎn)錄分子。FOX家族成員在胃癌中的作用也受到廣泛關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，一方面，F(xiàn)OXCs[10-12]、FOXM1[13-14]、FOXK1[15-16]、FOXQ1[17]可能在胃癌中發(fā)揮促癌作用；另一方面，F(xiàn)OXD3[18]、FOXOs[19-21]、FOXF2[22]、FOXA1[23]可能抑制胃癌發(fā)生。FOXJ1是FOX家族的成員之一，除了在纖毛形成、胚胎發(fā)育分化、抑制自身免疫等生物學(xué)行為中起著重要調(diào)控作用外，近年也發(fā)現(xiàn)FOXJ1在不同腫瘤中發(fā)揮著不同作用。我們前期率先發(fā)現(xiàn)FOXJ1是抑制胃癌增殖和轉(zhuǎn)移的重要轉(zhuǎn)錄因子：FOXJ1在胃癌中的表達(dá)下調(diào)，并與腫瘤浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為影響胃癌患者生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素；FOXJ1陰性表達(dá)的患者多傾向于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；FOXJ1參與抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等多種惡性生物學(xué)行為。那么，F(xiàn)OXJ1抑制胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制是什么呢？目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)研究報(bào)道。

MMPs與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。其中，MMP-2和MMP-9直接參與腫瘤血管發(fā)生、降解ECM、破壞基底膜完整性。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)FOXJ1可顯著降低MKN28M中MMP2、MMP9的表達(dá)，而干擾FOXJ1可明顯增加MKN28NM中MMP2、MMP9的表達(dá)，提示FOXJ1可能通過(guò)抑制MMP2、MMP9抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。這與FOXL1抑制腎癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制相似[24]。另外，MMPs的活性受內(nèi)源性因子組織型金屬蛋白酶抑制物的特異調(diào)節(jié)。我們前期發(fā)現(xiàn)MMPs和TIMPs的表達(dá)失衡促進(jìn)胃癌的發(fā)展過(guò)程[25]。因此，我們通過(guò)檢測(cè)上調(diào)/下調(diào)FOXJ1的穩(wěn)轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞系中TIMP1、TIMP2的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)MKN28M-FOXJ1細(xì)胞中TIMP2表達(dá)明顯增強(qiáng)，而MKN28NM-shFOXJ1細(xì)胞中TIMP1、TIMP2表達(dá)明顯降低，提示FOXJ1可能通過(guò)TIMP1、TIMP2抑制MMP9和MMP2的活性，進(jìn)而減少胃癌ECM降解，抑制侵襲和轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

Wnt/β-catenin通路的異常活化是調(diào)控胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)中，我們首先通過(guò)Pearson相關(guān)性分析FOXJ1和β-catenin在胃癌中的共定位情況，發(fā)現(xiàn)二者的核表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步免疫熒光染色和核蛋白測(cè)定發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXJ1可抑制β-catenin在胃癌細(xì)胞漿中聚集及核轉(zhuǎn)位的發(fā)生。而β-catenin由胞漿進(jìn)入胞核是Wnt/β-catenin激活的重要標(biāo)志，β-catenin從細(xì)胞膜脫離，且胞漿內(nèi)降解復(fù)合體形成受到抑制，導(dǎo)致β-catenin在胞漿中不斷積聚，繼而向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，與TCF/LEF結(jié)合，啟動(dòng)MMP2、c-Myc等經(jīng)典下游靶基因轉(zhuǎn)錄活化，促進(jìn)細(xì)胞異常增殖分化、侵襲轉(zhuǎn)移[26]。同時(shí)，Wnt/β-catenin通路還參與胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin作為β-catenin的下游分子參與EMT，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[27]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了FOXJ1是否通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控胃癌進(jìn)程，結(jié)果顯示FOXJ1能夠明顯抑制β-catenin/TCF的轉(zhuǎn)錄活性以及Wnt/β-catenin通路下游靶蛋白c-Myc、N-cadherin的表達(dá)。因此，F(xiàn)OXJ1可能部分通過(guò)阻斷Wnt/β-catenin激活，抑制胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移。而FOXJ1如何抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路尚有待深入探討。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在課題組前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗(yàn)證了FOXJ1抑制胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移；FOXJ1通過(guò)TIMP1、TIMP2的內(nèi)源性調(diào)節(jié)作用抑制MMP9和MMP2的活性，減少胃癌ECM降解；部分通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路的異常激活，進(jìn)而抑制胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移。為揭示胃癌進(jìn)展的機(jī)制網(wǎng)絡(luò)、探尋胃癌預(yù)后靶點(diǎn)提供新的科學(xué)依據(jù)。

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