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不同來(lái)源的巨噬細(xì)胞在小鼠腎臟纖維化中的作用*

2021-11-03 13:19:42姜亞麗
重慶醫(yī)學(xué) 2021年19期
關(guān)鍵詞:骨髓纖維化炎性

姜亞麗,何 娟

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科,西安 710032)

全球13%~15%的成年人患有慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD),腎臟纖維化是慢性腎臟病進(jìn)展至終末期腎病的共同病理過(guò)程,其主要病理改變是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白)的大量產(chǎn)生和堆積[1]。單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)模型是小管間質(zhì)纖維化常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)?zāi)P汀DI纖維化是炎癥損傷修復(fù)過(guò)程,腎臟損傷的實(shí)質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放一系列炎性介質(zhì)、趨化因子,招募炎性細(xì)胞到腎間質(zhì),募集的炎性細(xì)胞和腎臟原位活化的免疫細(xì)胞共同參與腎纖維化的發(fā)生發(fā)展[2-3],其中單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)是小管間質(zhì)主要病變特征。

大量研究證實(shí)巨噬細(xì)胞可通過(guò)多種方式參與腎纖維化,由于巨噬細(xì)胞異質(zhì)性及腎纖維化機(jī)制復(fù)雜性[4-5],因而研究腎纖維化發(fā)病的細(xì)胞學(xué)和分子機(jī)制具有重要的臨床意義。以往的研究顯示,骨髓來(lái)源的炎性巨噬細(xì)胞及其增殖主要貢獻(xiàn)了腎纖維化形成[6]。而近年研究發(fā)現(xiàn),腎臟組織定居型巨噬細(xì)胞也參與了腎臟纖維化的形成[7]。但腎臟組織定居型巨噬細(xì)胞和骨髓來(lái)源的炎性巨噬細(xì)胞在腎臟纖維化中究竟哪一個(gè)發(fā)揮主要作用,目前尚不清楚。本研究利用巨噬細(xì)胞CX3CR1GFP轉(zhuǎn)基因小鼠建立UUO模型,初步探討腎纖維化過(guò)程中不同來(lái)源巨噬細(xì)胞對(duì)腎纖維化的貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

CX3CR1GFP轉(zhuǎn)基因雄性C57/B6小鼠12只和未轉(zhuǎn)基因C57/B6小鼠6只(WT組,作為對(duì)照),8~10周齡,體重20~25 g,由中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)環(huán)境,恒溫恒濕,24 h自由進(jìn)食和飲水。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組及UUO模型建立

12只8~10周齡大小的CX3CR1GFP轉(zhuǎn)基因雄性C57/B6小鼠分為兩組(每組6只):Sham組和UUO組,其中UUO組又分為UUO(-)和UUO(+),UUO組2周處死動(dòng)物,留取結(jié)扎側(cè)腎臟作為UUO(+)組,對(duì)側(cè)腎臟作為UUO(-)組,同時(shí)Sham組在同一時(shí)間點(diǎn)處死,留取小鼠腎組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);另外6只同樣周齡大小的WT組雄性C57/B6小鼠,不進(jìn)行手術(shù)。

1.2.2UUO

5%的水合氯醛(10 μL/g)腹腔注射麻醉,選擇腹正中切口,依次切開(kāi)皮膚至腹腔,游離腎臟及輸尿管,將左側(cè)輸尿管用組織鉗托起中段部位,止血鉗夾住,兩端用4-0絲線兩次結(jié)扎左側(cè)輸尿管靠近腎盂段,剪斷輸尿管,然后縫合肌肉和皮膚。

1.2.3腎組織病理學(xué)檢查

麻醉后,用PBS從左心室灌注沖走腎臟組織血液,一部分腎組織用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,4 μm厚度切片,用于Masson染色和蘇木素-伊紅(HE)染色,分別評(píng)價(jià)膠原纖維沉積及間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。Masson染色:用帶顯微裝置的數(shù)字照相機(jī)掃描膠原纖維染色區(qū)域,并通過(guò)NIS-Elements Br 3.0 軟件行半定量分析,膠原纖維沉積程度以膠原染色面積占總面積的百分比表示。HE染色:定量統(tǒng)計(jì)每高倍鏡下間質(zhì)炎性細(xì)胞數(shù)量。

1.2.4免疫熒光染色

腎組織用4%多聚甲醛固定,蔗糖脫水,OCT包埋后放入-80 ℃冰箱速凍,在低溫恒溫箱中冰凍切片(5 μm),-80 ℃冰箱貯存。切片用丙酮在室溫下固定10 min,牛血清清蛋白(BSA)封閉。甩掉封閉液后,分別滴加抗KI67抗體和抗α-SMA抗體(美國(guó)eBioscience公司,1∶400,1∶200),4 ℃封閉過(guò)夜,PBS沖洗3次,每次7~8 min。然后Hochest(1∶10 000)染核,50%甘油封片,熒光顯微鏡觀察并照相。每張切片選5個(gè)視野,計(jì)數(shù)CX3CR1GFP+KI67+雙陽(yáng)性細(xì)胞占CX3CR1GFP陽(yáng)性細(xì)胞的百分比及α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(RT-qPCR)

TGF-β和Col-1引物設(shè)計(jì)與合成由日本TaKaRa公司完成。反應(yīng)體系為20 μL,其中SYBR mix 10 μL、熒光定量PCR參比染料 (×50 ) 0.4 μL、上下游引物各為 0.5 μL、cDNA模板1.0 μL、ddH2O 7.6 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性 95 ℃ 30 s;95 ℃ 30 s,60 ℃ 34 s,72 ℃,45個(gè)循環(huán)。每1個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔,以β-actin為內(nèi)參照。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 ABI 7500 自帶軟件進(jìn)行分析。

1.2.6腎臟單細(xì)胞懸液的流式細(xì)胞術(shù)

采用1.2.4方法獲取腎臟組織。制備腎臟細(xì)胞:取一小部分腎組織稱(chēng)重,充分研磨,37 ℃搖床上用膠原酶Ⅳ(2 mg/mL)消化30 min,尼龍膜過(guò)濾,4 ℃離心機(jī)1 200 r/min離心4 min,棄上清液,加入紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞,靜置5 min,流式液終止裂紅,1 200 r/min離心4 min,洗滌2次。腎臟細(xì)胞密度大,加流式液5 mL重懸,冰上靜置30 min,吸取上層2/3上清液,1 200 r/min離心4 min,重懸獲得單細(xì)胞懸液,顯微鏡下計(jì)數(shù)。平均每管6×105個(gè)細(xì)胞,加入10 μL 10%大鼠血清,4 ℃封閉10 min,加APC-ly6c抗體(1∶50稀釋)、PE-F4/80抗體(1∶100稀釋);APC-CD11B抗體(1∶100稀釋)、APC-CD11B(1∶100稀釋)、PE-CCR2(1∶100稀釋),4 ℃孵育25 min。加入2 mL流式液重懸清洗細(xì)胞,4 ℃離心機(jī)1 200 r/min離心4 min。將碘化丙啶(PI)用流式液稀釋(1∶1 000),每管以300~400 μL PI稀釋液重懸細(xì)胞,上機(jī)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 UUO導(dǎo)致腎臟纖維化和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)

轉(zhuǎn)基因小鼠CX3CR1GFP鑒定:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)CX3CR1GFP+F4/80+雙陽(yáng)性巨噬細(xì)胞,而WT組僅有F4/80+陽(yáng)性巨噬細(xì)胞出現(xiàn),見(jiàn)圖1。Masson染色結(jié)果提示:與WT組、UUO(-)組和Sham組比較,UUO(+)組小鼠腎組織膠原纖維沉積增多,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且WT組、Sham組與UUO(-)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HE染色結(jié)果顯示:UUO(+)組間質(zhì)炎性巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯多于WT組、Sham組和UUO(-)組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),且WT組、Sham組與UUO(-)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。α-SAM免疫熒光染色結(jié)果提示:與WT組、UUO(-)組和Sham組比較,UUO(+)組小鼠腎組織α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且WT組、Sham組與UUO(-)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。進(jìn)一步通過(guò)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),UUO(+)組腎組織TGF-β、Col-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯高于WT組、Sham組和UUO(-)組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而WT組與Sham組、UUO(-)組3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因小鼠CX3CR1GFP+F4/80+雙陽(yáng)性巨噬細(xì)胞明顯高于WT小鼠

A:Masson、HE、α-SMA免疫熒光染色(40×)及定量分析;B:RT-qPCR定量分析;a:P<0.05,b:P<0.01。

2.2 UUO后腎臟組織定居型巨噬細(xì)胞和骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞明顯增加

上述結(jié)果已證實(shí)WT組與Sham組在組織學(xué)和炎性細(xì)胞方面無(wú)差異,接下來(lái)將不闡述WT組結(jié)果。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與Sham和UUO(-)組比較,UUO(+)組ly6c-F4/80+CX3CR1GFP+細(xì)胞數(shù)明顯增多。結(jié)果還顯示3組間ly6c+F4/80+CX3CR1GFP+細(xì)胞幾乎為0(提示ly6c+細(xì)胞與募集炎性細(xì)胞有關(guān)),見(jiàn)圖3A;進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析組織定居型巨噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)UUO(+)組中CD11B+F4/80+CX3CR1GFP+細(xì)胞(組織定居型巨噬細(xì)胞)明顯高于Sham組和UUO(-)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且Sham組與UUO(-)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果還顯示UUO(+)組中CD11B+F4/80+CCR2+細(xì)胞(骨髓來(lái)源的炎性巨噬細(xì)胞)同樣高于Sham組和UUO(-)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖3B。但CD11B+F4/80+CX3CR1GFP+細(xì)胞增加數(shù)量明顯多于CD11B+F4/80+CCR2+細(xì)胞,說(shuō)明腎間質(zhì)中組織定居型巨噬細(xì)胞和骨髓來(lái)源的炎性巨噬細(xì)胞均參與腎纖維化進(jìn)展,前者貢獻(xiàn)可能更突出。

A:UUO后,腎間質(zhì)中組織定居型巨噬細(xì)胞(ly6c-F4/80+CX3CR1GFP+)浸潤(rùn)明顯增多;B:UUO后,腎組織中骨髓來(lái)源炎性巨噬細(xì)胞(CD11B+CX3CR1GFP+CCR2+)浸潤(rùn)明顯增多。a:P<0.05。

2.3 纖維化腎組織定居型巨噬細(xì)胞增殖明顯增加

與Sham組和UUO(-)組比較,UUO(+)組小鼠腎組織CX3CR1GFP+及CX3CR1GFP+KI67+的細(xì)胞明顯增多,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Sham組和UUO(-)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示組織定居型巨噬細(xì)胞及其增殖在腎纖維化中發(fā)揮重要作用。見(jiàn)圖4。

a:P<0.01。

3 討 論

大量研究已經(jīng)證實(shí)巨噬細(xì)胞與腎纖維化密切相關(guān)。由于巨噬細(xì)胞具有高度可塑性、局部組織功能特異性、炎癥因子誘導(dǎo)下分化異常等特點(diǎn),使其在腎纖維化過(guò)程中具有促纖維化形成及促纖維化降解的雙重作用[8-10]。以往研究已證實(shí),骨髓來(lái)源的炎性巨噬細(xì)胞在腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6]。而近年研究發(fā)現(xiàn),腎臟定居型巨噬細(xì)胞也參與了腎臟纖維化的形成[7,11-12]。

在各種腎臟損傷模型中,CX3CR1介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)在腎纖維化中發(fā)揮重要作用,而且是第1個(gè)被證實(shí)的趨化因子受體貢獻(xiàn)了腎纖維化的形成[13-14]。而最近的一項(xiàng)研究顯示,敲除CX3CR1基因的巨噬細(xì)胞腎臟纖維化加重,提示CX3CR1+巨噬細(xì)胞對(duì)腎臟纖維化具有保護(hù)作用[15]??梢?jiàn)腎臟CX3CR1+巨噬細(xì)胞對(duì)腎纖維化作用仍存在爭(zhēng)議,值得進(jìn)一步研究。本研究使用CX3CR1GFP轉(zhuǎn)基因小鼠建立UUO模型,結(jié)果顯示UUO后UUO(+)組腎臟中組織定居型巨噬細(xì)胞(CD11B+F4/80+CX3CR1GFP+)和骨髓來(lái)源的炎性巨噬細(xì)胞(CD11B+F4/80+CCR2+)浸潤(rùn)均增加,且前者明顯多于后者,因此筆者推測(cè)組織定居型巨噬細(xì)胞在腎臟纖維中可能發(fā)揮主要作用。

本研究還發(fā)現(xiàn),UUO(+)組腎臟中CX3CR1GFP+巨噬細(xì)胞明顯高于UUO(-)組和Sham組,因此筆者猜想,CX3CR1GFP+巨噬細(xì)胞在UUO過(guò)程中是否發(fā)生了增殖或表型轉(zhuǎn)化?于是筆者又通過(guò)增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討CX3CR1+巨噬細(xì)胞的增殖對(duì)腎臟纖維化產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示,UUO(+)組腎臟中CX3CR1GFP+巨噬細(xì)胞的增殖明顯高于UUO(-)組和Sham組,提示組織定居型巨噬細(xì)胞的增殖參與了腎纖維化過(guò)程。且已有研究顯示在UUO誘導(dǎo)的腎纖維化模型中,藥理性抑制ERK可以減少腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞的增殖,但巨噬細(xì)胞增殖的減少并沒(méi)有造成腎纖維化的減輕[16]。由此可見(jiàn),腎臟定居型巨噬細(xì)胞的增殖在腎纖維化中發(fā)揮重要作用。

本研究顯示,UUO過(guò)程中腎間質(zhì)中組織定居型巨噬細(xì)胞和炎性巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)均增多,且以前者為主,進(jìn)一步通過(guò)增殖實(shí)驗(yàn)證明組織定居型巨噬細(xì)胞增殖在腎纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。但是否骨髓來(lái)源的炎性巨噬細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化貢獻(xiàn)了組織定居型巨噬細(xì)胞,需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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