李金艷,楊根嶺，錢冠華

(1.重慶市中醫(yī)院產(chǎn)科 400021；2.重慶醫(yī)科大學動物實驗中心 400016；3.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科 400010)

胚胎肺發(fā)育于前腸腹側內(nèi)胚層周圍被間充質細胞包圍，在發(fā)育過程中腹側變成肺上皮細胞，而間充質細胞則變?yōu)榉螌嵸|。胎肺發(fā)育經(jīng)歷3個時期：腺狀期、小管期和原始肺泡形成期[1]。宮內(nèi)環(huán)境影響著胎肺發(fā)育并引起肺組織形態(tài)學改變[2]。肺組織中肺泡Ⅱ型上皮細胞 (alveolar epithelial type Ⅱ cells,AECⅡ)有極其重要的作用。肺泡表面活性物質相關蛋白 (surfactant-associated protein,SP),包括SP-A、SP-B、SP-C和SP-D。其中SP-A最為豐富，其表達水平的減少與哺乳動物的肺疾病密切相關。

干擾胎兒肺發(fā)育的主要因素是妊娠期糖尿病(GDM)和早產(chǎn)[3]。GDM時，胎肺的發(fā)育受到影響，肺成熟延遲，肺泡表面積減少，肺泡表面活性物質減少，肺泡血管通透性增加。GDM母親分娩的新生兒容易出現(xiàn)巨大兒、低血糖、先天畸形、高膽紅素血癥、新生兒呼吸窘迫綜合征，疾病的發(fā)病率和病死率更高[4]。而目前GDM對胎肺發(fā)育的影響尚不清楚。本實驗旨在研究GDM對胎鼠AECⅡ細胞的影響及意義。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級SD雌鼠30只、SD雄鼠10只，體重約250～350 g，約2月齡，于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心無特定病原體(SPF)級環(huán)境中飼養(yǎng)，適應性喂養(yǎng)1周。實驗涉及的操作方案均通過重慶醫(yī)科大學倫理委員會批準。

1.2 主要試劑

鏈脲佐菌素、油紅O粉劑、Ⅰ型膠原酶購自美國Sigma公司；安穩(wěn)免調(diào)血糖儀由三諾生物傳感公司生產(chǎn)；兔抗SP-C多克隆抗體、兔抗SP-A多克隆抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自美國Santa Cruz公司；即用型SABC免疫組織化學染色試劑盒、DAB顯色劑、0.25%胰蛋白酶溶液 (不含EDTA)、DMEM/F12 1∶1液體培養(yǎng)基(常規(guī)) 、DMEM/F12 1∶1液體培養(yǎng)基 (含胎牛血清、青霉素、鏈霉素)、D-Hanks緩沖液 (不含酚紅、不含鈣鎂) 購自武漢博士德公司；DnaseⅠ酶、大鼠IgG購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1動物分組與處理

將發(fā)情的SD雌鼠雌雄3∶1比例合籠，次日8:00取雌鼠陰道分泌物，顯微鏡下發(fā)現(xiàn)精子者記為妊娠第1天 (D1) 。將孕鼠分為對照組和GDM組，每組10只孕鼠。GDM組孕鼠給予1%鏈脲佐菌 (Streptozotozin,STZ) 新鮮溶液 (0.1 mol/L、pH 4.4檸檬酸緩沖液現(xiàn)配) 按40 mg/kg行腹腔注射。給藥72 h后測定尾靜脈血血糖值，血糖值大于15.0 mmol/L表明建模成功。對照組孕鼠腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。每2天檢測SD大鼠血糖及體重變化情況。孕20.5 d后剖宮產(chǎn)。

1.3.2孕鼠和胎鼠血葡萄糖的測定

采集孕鼠眼眶靜脈血，抗凝、離心后取血漿，使用葡萄糖測定試劑盒，采用葡萄糖氧化酶法測定。胎鼠取腹主靜脈血，測定方法同孕鼠。

1.3.3胎鼠AECⅡ的分離純化及原代培養(yǎng)

SD孕鼠行剖宮產(chǎn)術，取出胎鼠肺組織，D-Hanks液洗滌后，將胎肺組織剪至細末，再次洗滌。加入消化液(0.25%胰蛋白酶+0.1%Ⅰ型膠原酶溶液+0.04 g/L DnaseⅠ酶溶液) ，37 ℃消化，不銹鋼網(wǎng)篩過濾，收集細胞，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸后，離心，棄上清液，加入0.1%Ⅰ型膠原酶溶液和0.04 g/L DnaseⅠ酶溶液，37 ℃再次消化，然后接種在大鼠IgG包被的培養(yǎng)皿中貼壁(第一次貼壁)。未貼壁的細胞接種于6孔培養(yǎng)板，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后換液，將貼附于培養(yǎng)皿或6孔培養(yǎng)板生長的細胞(第二次貼壁)采用免疫熒光染色方法進行鑒定。

1.3.4臺盼藍染色

取接種的AECⅡ細胞懸液100 μL，加入培養(yǎng)基稀釋至400 μL，再加入100 μL的0.4%臺盼藍溶液，用血球計數(shù)儀計數(shù)400個細胞，拒染的為活細胞，藍染的細胞為死細胞，計數(shù)活細胞所占百分比。

1.3.5透射電鏡鑒定

分別收集培養(yǎng)皿或6孔培養(yǎng)板的AECⅡ細胞，加入2.5%戊二醛固定液，沉淀2 h，用梯度乙醇脫水，用純丙酮加包埋液(1∶2) 包埋，37 ℃烘箱內(nèi)固化，切片機切片 (50～60 nm)，用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。HITACHI-600透射電鏡觀察細胞結構。

1.3.6蘇木素-伊紅(HE)染色

將胎鼠肺組織切片置烤箱烤至溶蠟，切片于二甲苯脫蠟；先后浸泡在100%、95%、70%梯度乙醇中；蘇木精染色，置于0.5%鹽酸乙醇數(shù)秒后取出，伊紅染色，依次在100%、95%梯度乙醇中脫水，吸干乙醇，二甲苯透明，室溫過夜，中性樹脂封片。

1.3.7油紅O染色

胎鼠肺組織冰凍切片(10 μm)，10%多聚甲醛室溫固定30 min，60%異丙醇浸洗2 min；油紅O工作液染色15 min，60%異丙醇調(diào)色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，中性樹脂封片。

1.3.8免疫熒光技術檢測

第1次貼壁和第2次貼壁細胞爬片后用4%多聚甲醛固定，并固定于載玻片上。加入含0.5% TritonX-100的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌，加入一抗SP-C(1∶50稀釋) ，4 ℃孵育過夜。洗滌后加入FITC標記的羊抗兔IgG(1∶100稀釋)，避光37 ℃下孵育30 min。洗滌后加入DAPI染色細胞核(1∶50稀釋)，避光室溫下孵育30 min。洗滌后在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.9免疫細胞化學檢測

細胞爬后片用4%多聚甲醛固定，并固定于載玻片上。加入0.5% TritonX-100，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌，加入一抗SP-A (1∶50稀釋)，4 ℃過夜。洗滌后加入辣可忍受過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG(1∶100稀釋)，37 ℃下孵育30 min。DAB顯色后，經(jīng)復染、分化、脫水、封片后在顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 動物模型建立成功

對照組、GDM組、GDM組胎鼠、GDM組胎鼠血糖分別為(4.68±0.45)、(21.68±3.51)、(4.26±0.51)、(17.49±2.63)mmol/L，GDM組及GDM組胎鼠血糖較相應的對照組顯著升高(P=0.001)，妊娠期尿病大鼠模型成功建立。

2.2 原代培養(yǎng)胎鼠AECⅡ及鑒定

2.2.1原代培養(yǎng)的胎鼠AECⅡ形態(tài)及純度檢測

AECⅡ形態(tài)為多邊形或立方形，細胞質內(nèi)有較多粗大黑色顆粒，細胞核大，部分細胞核為雙核。細胞開始生長呈島狀分布，后細胞融合為片狀生長 (圖1A) 。每6只20.5 d胎齡的胎鼠肺組織可獲得 (15±3)×106個AECⅡ細胞。通過臺盼藍染色方法檢測到接種細胞活力為(95±3)%，細胞的純度為(98±2)%。透射電鏡觀察原代培養(yǎng)的AECⅡ細胞，細胞質內(nèi)見到同心圓狀、多層的板層小體，板層小體為黑色，在細胞膜上可見較多微絨毛(圖1B)。

A：AECⅡ細胞普通光鏡下形態(tài)(×400)；B：AECⅡ細胞透射電鏡下形態(tài)(×8 000)。

2.2.2免疫熒光檢測SP-C在原代培養(yǎng)的AECⅡ中的表達

因SP-C蛋白在AECⅡ細胞中為特異性表達，當細胞表達SP-C時，可確定該細胞即為AECⅡ。第1次貼壁細胞未見綠色的熒光(圖2A)，細胞核見藍色熒光 (圖2B)，圖像合并后未見表達綠色熒光的細胞 (圖2C)。第2次貼壁細胞細胞質中見綠色的熒光 (圖2D)，細胞核見藍色熒光 (圖2E)，圖像合并后見表達綠色熒光的細胞占全部細胞的98% (圖2F),可見SP-C在該細胞有表達，細胞為AECⅡ細胞。

A～C：為第1次貼壁細胞；D～F：為第2次貼壁細胞。

2.3 對照組和GDM組胎鼠AECⅡ細胞改變

2.3.1透射電鏡觀察胎鼠AECⅡ細胞形態(tài)改變

透射電鏡下可見從對照組胎鼠肺原代培養(yǎng)的AECⅡ表面有豐富微絨毛，細胞內(nèi)有較多板層小體，而GDM組胎鼠肺原代培養(yǎng)的AECⅡ表面微絨毛減少，細胞內(nèi)板層小體明顯減少，見圖3。

A： 對照組(×10 000)；B：GDM組(×5 000)。

2.3.2AECⅡ和AECⅠ細胞數(shù)量變化

油鏡下見AECⅠ細胞是扁平細胞，其細胞核向表面邊緣突起并隔膜。AECⅡ細胞由立方體細胞組成，細胞核大，有血管。GDM組胎鼠肺組織中AECⅡ和AECⅠ細胞數(shù)量較對照組胎鼠肺組織降低。AECⅡ和AECⅠ細胞數(shù)量的比例在對照組胎鼠肺組織和GDM組胎鼠肺組織均約為2∶1，見圖4。

A： 對照組胎鼠；B： GDM組胎鼠；C：AECⅡ和AECⅠ數(shù)量;a:與對照組比較。

2.3.3AECⅡ細胞中脂滴變化

油紅O染色AECⅡ細胞，對照組胎鼠肺組織原代培養(yǎng)的AECⅡ細胞中見大量紅色脂滴，部分為團狀堆積；而從GDM組胎鼠肺組織原代培養(yǎng)的AECⅡ細胞中脂滴明顯減少，見圖5。

A：對照組胎鼠；B：GDM組胎鼠；C：AECⅡ脂滴吸光度(A);a:P<0.05,與對照組胎鼠比較。

2.3.4SP-A在AECⅡ中的表達

對照組胎鼠肺組織原代培養(yǎng)的AECⅡ中SP-A表達于細胞質，呈棕黃色，表達水平為0.85±0.11，GDM組胎鼠肺組織原代培養(yǎng)的AECⅡ中SP-A表達于細胞質，著色較淺，表達水平為0.37±0.05(圖6)，對照組胎鼠高于GDM組胎鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

3 討 論

本研究改進了AECⅡ細胞的原代培養(yǎng)方法，采用了兩步消化法消化細胞：第1次消化時，采用胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、DnaseⅠ酶對胎肺組織進行消化[5-6]。第2次消化時，僅僅采用Ⅰ型膠原酶和DnaseⅠ酶對已收集到的細胞進行再次消化[7]。該方法減少了對細胞損傷的同時又提高了細胞的產(chǎn)量。純化過程中，采用IgG免疫黏附純化法的同時，對細胞進行反復貼壁，得到了高產(chǎn)量、高純度的AECⅡ細胞[8-9]。

AECⅡ是成人干細胞，在慢性炎癥情況下，AECⅡ能分化成AECⅠ[10]。GDM胎鼠肺組織中AECⅠ細胞和AECⅡ細胞的總數(shù)明顯下降，而兩者之間的比例未發(fā)生改變[11]。其原因是高血糖可導致大量的ROS產(chǎn)生，使胚胎和胎兒中大量的細胞受損[12-13]，使肺泡間質組織和 (或) 肺泡組織增殖和凋亡出現(xiàn)異常[14]，增加肺泡成纖維細胞的增殖，減少成纖維細胞凋亡，促進肺纖維化，同時限制AECⅠ和AECⅡ發(fā)育。研究表明高血糖只會增加肺泡間質細胞的存活率，細胞分化處于紊亂狀態(tài)，大多數(shù)細胞處于分化狀態(tài)，不成熟細胞不能形成典型的結構，例如已分化肺泡的囊狀結構[15]。

AECⅡ細胞最重要的功能是產(chǎn)生和分泌肺泡表面活性物質。肺泡表面活性物質是復雜的脂類蛋白混合物，其中甘油磷脂約占80%，膽固醇約占10%，蛋白約占10%[16]。肺泡活性物質主要儲存在板層小體內(nèi)。從GDM組胎鼠肺組織中提取的AECⅡ細胞，可見板層小體體積變小、數(shù)量減少，細胞表面微絨毛減少、消失，該結果表明GDM時胎肺的發(fā)育出現(xiàn)了延遲，其原因可能是肺糖原磷酸化酶A活性在異常增高的血糖環(huán)境中受到抑制，進一步阻礙了糖原的降解，胎肺不能利用糖原，最終導致肺泡表面活性物質生產(chǎn)減少。另一方面，肺泡表面活性物質中磷脂主要是由脂質轉化而來，油紅O染色顯示GDM組胎鼠肺組織AECⅡ中脂滴明顯減少，這表明妊娠期糖尿病能抑制脂質的合成，進而影響肺泡表面活性物質的產(chǎn)生。免疫細胞化學顯示GDM組胎鼠肺組織AECⅡ中SP-A表達明顯低于對照組。表明GDM組胎鼠肺組織AECⅡ因高血糖導致其功能受到抑制，肺泡表面活性物質生成明顯減少，從而進一步導致肺泡表面張力增加，使肺泡不能充分擴張，影響新生兒肺氣體交換功能和肺功能，導致GDM孕婦分娩的新生兒容易出現(xiàn)呼吸窘迫癥。

此研究提示在妊娠期將GDM患者的血糖控制在正常水平能減少新生兒呼吸窘迫癥的發(fā)生，所以在臨床工作中需要全面嚴格開展GDM的篩查工作及GDM的臨床治療指導工作。對孕早期空腹血糖大于或等于6.1 mmol/L的孕婦，因按照GDM進行管理和治療。對確診GDM的患者需要進行規(guī)范化的治療，包括控制體重、糖尿病飲食、進行連續(xù)低強度的運動及使用胰島素將血糖控制在合理范圍，同時在整個孕期加強對胎兒的監(jiān)測[17]。血糖控制滿意且不需要胰島素治療的GDM孕婦，可嚴密監(jiān)測血糖至預產(chǎn)期，未自然臨產(chǎn)者可積極終止妊娠。妊娠期間需要使用胰島素治療并血糖控制滿意的GDM孕婦，建議在妊娠38～39周終止妊娠。血糖控制不滿意的GDM孕婦，結合其他高危因素，適時終止妊娠，同時在分娩前可積極采取措施提早預防新生兒呼吸窘迫綜合征的發(fā)生。在分娩時應密切監(jiān)測胎心的變化情況；在分娩后密切觀察新生兒生命體征并注意是否出現(xiàn)進行性呼吸困難加重。當臨床上一旦確診為新生兒呼吸窘迫綜合征應聯(lián)合機械通氣與肺泡表面活性物質治療，從而減少新生兒并發(fā)癥的發(fā)生[18]。

本研究在細胞水平發(fā)現(xiàn)，GDM胎鼠肺組織AECⅡ形態(tài)發(fā)生改變、功能受到抑制。肺泡表面活性物質生成明顯減少是GDM母親分娩的新生兒容易發(fā)生呼吸窘迫綜合征的重要原因，為臨床工作需要加強對GDM的篩查及規(guī)范化治療和管理，以降低新生兒呼吸窘迫綜合征的發(fā)生率提供了理論依據(jù)。