聶守民，羅波艷，孫養(yǎng)信，范鎖平，常文輝，王宇萌，孫 杰，安翠紅

鼠疫是一種原發(fā)于嚙齒動物之間并能引起人間流行的烈性傳染病，其發(fā)病急、傳染性強、病死率高，在我國是法定的甲類傳染病[1]。在人類歷史上，曾發(fā)生過3次世界大流行，導(dǎo)致數(shù)億人的死亡。在我國歷史上，也曾發(fā)生過數(shù)次流行，嚴(yán)重危害了人民生命及經(jīng)濟發(fā)展。鼠疫也是一種自然疫源性疾病，能夠長期在自然界循環(huán)傳播。按照地理景觀、宿主、媒介、鼠疫菌生態(tài)型等特點，將我國的鼠疫自然疫源地劃分為12種類型[2-3]。榆林市定邊縣位于陜西省西北部，是陜西、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古四省(自治區(qū))的交界處。1987年首次被判定為鼠疫自然疫源地，屬于內(nèi)蒙古鄂爾多斯高原長爪沙鼠鼠疫疫源地的一部分。1987-1988年、2000-2001年、2006年分別發(fā)生過3次鼠間鼠疫流行，共分離獲得66株鼠疫耶爾森菌。

鼠疫耶爾森菌是一種多宿主、多媒介的病原體[4]。鼠疫耶爾森菌的分型包括生物型、生態(tài)型及基因型。生物型與生態(tài)型由基因型決定，鼠疫耶爾森菌的分型工作對鼠疫預(yù)防控制策略的制定及流行病學(xué)研究具有重要的指導(dǎo)意義。目前，常用于鼠疫耶爾森菌基因分型的技術(shù)主要有差異區(qū)段分析(DFR)、規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列分析(CRISPR)、多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)[5-6]。可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)是廣泛存在于微生物基因組中的以相同或相似的核苷酸序列為重復(fù)單位的首尾相連序列[7]，同一物種不同個體的VNTR位點重復(fù)數(shù)可能不同，這就造成了種內(nèi)的遺傳多態(tài)性。MLVA就是通過組合多個位點的VNTR重復(fù)數(shù)來進行個體鑒定的方法[8]，以PCR為技術(shù)基礎(chǔ)，結(jié)合其他分子生物學(xué)研究方法來確定VNTR重復(fù)數(shù)，從而確定個體的基因型。MLVA主要有分辨能力高、重復(fù)性好、操作簡便等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于鼠疫疫情暴發(fā)溯源、鼠疫耶爾森菌種群關(guān)系分析。MLVA14+12是最常用的分子分型策略[9]，本研究通過該分型技術(shù)對分離自陜西省鼠疫疫源地的66株鼠疫耶爾森菌進行基因分型研究，建立陜西省鼠疫耶爾森菌的多位點VNTR重復(fù)數(shù)數(shù)據(jù)庫，為今后陜西省鼠疫的監(jiān)測防治工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株信息 本研究所用的66株鼠疫耶爾森菌均分離自陜西省鼠疫疫源地——榆林市定邊縣。該疫源地分別于1987—1988年、2000—2001年、2006年發(fā)生過3次動物間鼠疫流行。見表1。

表1 陜西省鼠疫耶爾森菌分離株信息Tab.1 Yersinia pestis isolates in Shaanxi Province

1.2 儀器設(shè)備 生物安全柜、生化培養(yǎng)箱、PCR擴增儀、高速離心機、瞬時離心機、水平電泳儀、凝膠成像儀、ABI3730測序儀和移液器。

1.3 試劑耗材 核酸提取試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司)；超純水；2×PCR擴增混合液(2×TSINGKE Master Mix，北京擎科生物科技有限公司西安分公司)；瓊脂糖；5×TBE電泳緩沖液；上樣緩沖液loading buffer；DNA染料；DNA Marker(100 bp Plus DNA Ladder Marker，全式金生物技術(shù)有限公司)；96孔PCR板；EP管；不同規(guī)格槍頭。

1.4 合成引物 參照文獻[9]設(shè)計MLVA(14+12)引物，合成由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成，熒光標(biāo)記的引物注意避光保存，見表2。

表2 26對引物名稱及序列信息Tab.2 Primer names and sequence information

表2(續(xù))引物上游引物5′端標(biāo)記熒光序列(5′-3′)目標(biāo)長度/bpM22-FFAMGCGTGATACCAAAGGCTGGCTCACC235M22-RGGCACTTTGGGTACGGAACGTCATCACM43-FHEXGAGTGCGCGACGGTATGGTGC269M43-RGCCGCGCATTTATTGATGGTGTCM25-FFAMGTTTAGCTGTAAATAGATTTAGAAGCCTCGTCTTTTGAC335M25-RGATATAAATGAGTTGATTCAGGTGTTCATATTTAACGAAACM23-FHEXGTTAAAACTTAATTAACCAACTTAAGAGTCGCCATATC169M23-RGTTATCAGATTTCGCTTGAAGTAGGTTTAACGATGACM28-FFAMGTTTGGCGGTTGGGCGTACCTTGGTA212M28-RAGCGCCCGTAGACGCTTTCGAAATAGCM29-FHEXGAGCGGCGGGTTCTCATGCTGAT233M29-RGTTTAAGCAGTAGATCTAAAGCGTTATGAATATTGGTGTTA

1.5 核酸提取 本研究所用菌株的核酸提取均在青海省地方病預(yù)防控制所完成，采用試劑盒法在P3實驗室內(nèi)進行操作。

1.6 擴增體系及參數(shù) 26對引物分成14個反應(yīng)體系，采用雙重或單重PCR方法。單重反應(yīng)體系總體積為25 μL： 2×PCR擴增混合液12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各2 μL，超純水7.5 μL，DNA模板1 μL。雙重PCR反應(yīng)體系總體積25 μL：10 μmol/L上、下游引物各1 μL，其他用量不變。擴增參數(shù)：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min；60 ℃(退火溫度根據(jù)體系有所不同，需要注意)1 min；72 ℃ 1 min；30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。具體退火溫度見表3。

表3 反應(yīng)體系及各自的退火溫度Tab.3 Reaction system and respective annealing temperatures

1.7 PCR結(jié)果分析 PCR結(jié)束后經(jīng)水平凝膠電泳確定有無產(chǎn)物及非特異性擴增，通過Marker初步確定PCR產(chǎn)物大小。將PCR產(chǎn)物送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司使用ABI3730測序儀進行毛細(xì)管電泳，根據(jù)電泳得到的產(chǎn)物分子量大小來確定各位點重復(fù)數(shù)。

1.8 聚類分析 利用BioNumerics(Version7.6)軟件，將前14個位點的權(quán)重設(shè)為2，后12個位點的權(quán)重設(shè)為1。采用非加權(quán)組平均法(UPGMA)進行聚類分析并采用最小生成樹(MST)進行高級聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1 26位點VNTR重復(fù)數(shù) 陜西省66株鼠疫耶爾森菌分離株基因組中VNTR重復(fù)數(shù)結(jié)果見表4。12個位點(MS56、M15、N2117、N2577、N3773、M33、M34、M22、M43、M23、M25、M28)具有2種及以上的重復(fù)數(shù)，其他位點只具有1種重復(fù)數(shù)。M22位點的分辨力最強，重復(fù)種數(shù)最多(7種)。M22、M34、M28、M15、N3773、N2577、M43位點具有較高的遺傳多態(tài)性，MS56、M33、M23、M25、N2117位點遺傳多態(tài)性較低，其他14個位點未出現(xiàn)遺傳變異。

表4 陜西省鼠疫耶爾森菌分離菌株的VNTR位點重復(fù)結(jié)果Tab.4 VNTR site repeat results for Yersinia pestis isolates in Shaanxi Province

2.2 MLVA分群結(jié)果 M58、MS56、MS38、M21、M15、M61、MS09、N2486、MS73、MS41、N3779、N2896、N0865、N2976這14個位點是鼠疫耶爾森菌的一級分群指標(biāo)。陜西省66株鼠疫耶爾森菌分離株經(jīng)BioNumerics聚類分析后被分成3群：A、B、C群，在MS56位點上有8和9兩個重復(fù)數(shù)，在M15位點上有6、7和8三個重復(fù)數(shù)，其他位點上只有一種重復(fù)數(shù)。A群含42株菌，占63.64%，其中只有3株菌為1988年分離，剩余菌株均為2000-2001年分離；B群含16株菌，占24.24%，其中1株菌為1988年分離，剩余菌株均為2006年分離；C群含8株菌，占12.12%，其中2株菌為2000年分離，剩余菌株均為1987-1988年分離。

2.3 MLVA種內(nèi)分型結(jié)果 N1606、N2577、N3773、M34、M33、M22、M43、M25、M23、M28、M29、N2117這12個位點是鼠疫耶爾森菌種內(nèi)分型指標(biāo)。經(jīng)聚類分析，66株鼠疫耶爾森菌基因型分為19種，命名為1-19型。3型、4型、5型、6型、13型、14型、16型、17型為多菌株基因型，其他型為單菌株基因型。其中4型菌株數(shù)最多，為22株，占菌株總數(shù)的33.33%。1987—1988年分離菌株有7種基因型，2000—2001年分離菌株有12種基因型，2006年分離菌株有2種基因型。有2種基因型(4型、16型)同時出現(xiàn)在1987-1988年、2000-2001年期間。說明鼠疫耶爾森菌基因型發(fā)生了變異，并在流行期間逐漸穩(wěn)定遺傳下來(圖1、圖2)。

圖1 陜西省鼠疫耶爾森菌分離株聚類分析Fig.1 Cluster analysis of Yersinia pestis isolates in Shaanxi Province

圖2 陜西省鼠疫耶爾森菌分離株最小生成樹Fig.2 Minimum spanning tree of Yersinia pestis isolates in Shaanxi Province

3 討 論

歷史上鼠疫曾發(fā)生過3次世界大流行，造成數(shù)億人死亡，給全球經(jīng)濟發(fā)展及社會穩(wěn)定造成沉重打擊。鼠疫是一種自然疫源性疾病，鼠疫耶爾森菌的保存和世代延續(xù)需要具備一種特定的自然生態(tài)系統(tǒng)，稱為自然疫源地。我國是世界上鼠疫自然疫源地分布最廣、結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜的國家[3]。榆林市定邊縣是陜西省現(xiàn)存的一塊鼠疫自然疫源地，屬于內(nèi)蒙古鄂爾多斯高原長爪沙鼠鼠疫疫源地的一部分。2020年，陜西省鄰省內(nèi)蒙古曾發(fā)生人間鼠疫，其病例密接者進入我省，我省高度重視并協(xié)助處理。加強鼠疫疫源地動物間鼠疫監(jiān)測，防止鼠疫的遠(yuǎn)距離傳播是當(dāng)今鼠疫防控工作的重點。

對引起鼠疫的病原體—鼠疫耶爾森菌進行基因分型是一項很重要的工作，對鼠疫疫情暴發(fā)溯源、鼠疫防控策略制定等都具有重大意義。傳統(tǒng)的分型技術(shù)只能在生物型及生態(tài)型方面進行區(qū)分，而生物型與生態(tài)型是由基因型決定的，所以傳統(tǒng)分型技術(shù)已經(jīng)很難滿足鼠疫防控工作的需求。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的基因分型技術(shù)應(yīng)用到鼠疫領(lǐng)域。其中應(yīng)用廣泛、效果最好的技術(shù)是MLVA，內(nèi)含多態(tài)性信息，能夠通過組合多個位點的VNTR重復(fù)數(shù)來確定個體的基因型。使用MLVA分型技術(shù)，使在區(qū)域或全球各級追蹤鼠疫耶爾森菌種群的傳播途徑成為可能[10]。Li等[9]利用MLVA分型方法建立了我國鼠疫耶爾森菌的基因分型數(shù)據(jù)庫，進一步提升了我國鼠疫防控水平；Li等[11]用MLVA分型技術(shù)分析了中國、中亞和世界其他地區(qū)鼠疫耶爾森菌的關(guān)系，為鼠疫的進化研究提供了一種新視角；Oliveira等[12]用MLVA分型技術(shù)對巴西的鼠疫耶爾森菌進行了研究，結(jié)果表明菌株間存在種內(nèi)遺傳多樣性，菌株的遺傳種群與菌株的地理和時間來源存在一定的相關(guān)性；河北省、云南省、甘肅省等分別采用MLVA分型方法對鼠疫耶爾森菌分離株進行了基因分型，證明了MLVA分型技術(shù)在鼠疫耶爾森菌基因分型方面的良好前景[13-15]。

通過對陜西省分離的66株鼠疫耶爾森菌進行MLVA分型，發(fā)現(xiàn)3次動物鼠疫流行菌株根據(jù)分離時間聚集成為相應(yīng)群，從最小生成樹也可以看出每一次鼠疫流行都有主導(dǎo)基因型鼠疫菌。1987—1988年第一次動物間鼠疫流行，10株菌中有6株分布于C群，3株菌分布于A群，1株菌分布于B群，說明本次流行以C群為主，還有A、B群菌株流行。2000—2001年是第2次流行，41菌鼠疫菌有39株分布在A群中，2株菌分布于C群中，說明本次流行以A群為主，還有C群菌株的流行。2006年的第3次流行，15株菌均分布于B群，說明本次流行鼠疫菌基因型為B群。1987—1988年分離菌株在A、B、C 3個群都有分布，主要在C群，2000—2001年分離菌株在A、C群有分布，主要在A群，2006年分離菌株僅在B群有分布， 3次流行鼠疫菌主導(dǎo)基因型不同，2000—2001年沒有檢測到B群基因型，但在2006年僅檢測到B群基因型，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因還有待于以后進一步分析。66株鼠疫菌生態(tài)型為鄂爾多斯高原生態(tài)型菌株[16]，MLVA基因分型分為3群，19種基因型，A群包含12個基因型，B群包含3個基因型，C群包含4個基因型，群內(nèi)菌株VNTR位點重復(fù)數(shù)有細(xì)微差別，表明MLVA分型方法分辨率極高，可用于觀察菌株的微遺傳進化。本研究初步建立了陜西省鼠疫耶爾森菌的MLVA基因分型數(shù)據(jù)庫，為今后的鼠疫防控工作提供了科學(xué)依據(jù)。