夏冰芝

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)屬革蘭氏陰性菌，該病原可感染多種經(jīng)濟動物，其中包括豬、牛、羊和禽等，也可感染人，是重要的人獸共患性致病菌。不同動物感染該病所出現(xiàn)的臨床癥狀差異較大，其中豬感染該病出現(xiàn)豬肺疫或萎縮性鼻炎、牛為敗血癥、禽為霍亂，而羊則表現(xiàn)為流行性肺炎[1]。多殺性巴氏桿菌屬于機會致病菌，其主要寄生在宿主呼吸道和泌尿道粘膜，一般不會導(dǎo)致宿主發(fā)病，若外界環(huán)境導(dǎo)致宿主免疫力下降，多殺性巴氏桿菌則可導(dǎo)致其出現(xiàn)嚴重的臨床癥狀。人感染巴氏桿菌病案例較少見，多由帶病動物咬傷、抓傷或粘膜傷口接觸病原污染物引起，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)局部化膿，甚至腦膜炎等。

多殺性巴氏桿菌具有多個血清型，根據(jù)莢膜抗原差異可將其分為5個血清型，分別為A、B、D、E和F；根據(jù)脂多糖抗原差異則可將其分為16種血清型；此外，多殺性巴氏桿菌還可被分為產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌和非產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌[2]。甘肅省養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達，近年來甘肅省部分地區(qū)羊群出現(xiàn)多殺性巴氏桿菌疫情，給當?shù)仞B(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[3]。多殺性巴氏桿菌在外界廣泛存在，家畜在飼養(yǎng)、屠宰、運輸和售賣等環(huán)節(jié)均易感染該病原，消費者食用被病原菌污染的肉類后可能導(dǎo)致食源性疾病，繼而影響健康。隨著人們對食源性疾病防控的重視，對市售肉類食源性病原污染情況調(diào)查的研究較多，但大部分研究是針對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等病原，對多殺性巴氏桿菌的研究相對較少[2，4]。

本文從酒泉市部分地區(qū)收集市售羊肉樣品共257份，對樣品中多殺性巴氏桿菌污染情況進行檢測，同時對分離的菌株進行莢膜血清型鑒定及耐藥性監(jiān)測，旨在為該病的防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 于2019年3-9月和2020年5-9月從酒泉市部分地區(qū)(肅州區(qū)、金塔縣、玉門市和敦煌市)農(nóng)貿(mào)市場、屠宰場和超市采集新鮮市售羊肉樣品257份，其中農(nóng)貿(mào)市場、屠宰場和超市來源樣品數(shù)量分別為93份、132份和32份。按照隨機采樣原則，每月中旬左右從各采樣點采集樣品，無菌采集樣品后低溫送至酒泉職業(yè)技術(shù)學院食品病原檢測實驗室進行檢測。

1.1.2 主要試劑 本研究所需培養(yǎng)基均購自于北京陸橋技術(shù)有限公司；PCR反應(yīng)及凝膠電泳等所需試劑均購自于寶生物工程(大連)有限公司；藥敏紙片均購自于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離及鑒定 取1.0 g左右新鮮羊肉樣品與適量生理鹽水進行研磨，用滅菌接種環(huán)蘸取少量上清在含5%馬血清的胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上進行劃線，將培養(yǎng)基放在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，挑取單一、疑似多殺性巴氏桿菌菌株進行革蘭氏染色鑒定，并將其置于含5%馬血清胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中進行增菌。

1.2.1.1 分離菌株16S rRNA基因分子鑒定 取少量擴增菌液煮沸，以上清為DNA模板，根據(jù)參考文獻[5]合成鑒定多殺性巴氏桿菌16S rRNA基因引物 (表1)，以PCR法對本研究獲得的菌株的16S rRNA基因序列進行擴增。PCR體系(25.0 μL)中包括PCR預(yù)混液12.5 μL、上下游引物各1.0 μL、模板DNA樣品2.0 μL和DPEC處理水8.5 μL。每個PCR反應(yīng)均設(shè)置陽性和陰性對照，其模板分別為已知多殺性巴氏桿菌分離株核酸和去離子水。擴增條件為95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共36個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后取5.0 μL產(chǎn)物進行凝膠電泳，并觀察結(jié)果。將陽性產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)有限公司進行雙向測序，其后將測序結(jié)果拼接后在NCBI網(wǎng)絡(luò)進行核苷酸序列BLAST比對。

1.2.1.2 分離菌株莢膜血清學型分子鑒定 根據(jù)參考文獻[6]合成鑒定多殺性巴氏桿菌和莢膜血清學型的特異性引物 (表1)，通過PCR法鑒定分離菌株的莢膜血清型。PCR體系(25.0 μL)中包括PCR預(yù)混液12.5 μL、上下游引物各1.0 μL、模板DNA樣品2.0 μL和DPEC處理水8.5 μL。擴增條件為95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共36個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后取5.0 μL產(chǎn)物進行凝膠電泳，并觀察結(jié)果。

表1 多殺性巴氏桿菌16S rRNA基因及莢膜血清型鑒定引物序列及目的片段大小信息Tab.1 Information on primer sequences and target fragment sizes for capsular serotype identification of Pasteurella multocida

1.2.2 藥敏試驗 采用Kirby-Bauer法對本研究獲得的菌株分別進行藥敏試驗。將菌液稀釋至濃度為1.0×108cfu/mL，取100 μL稀釋菌液均勻涂布在含5%馬血清的胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基表面，待表面菌液稍干后在每個培養(yǎng)基表面貼上4種不同的藥敏紙片，做好標記后將培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，其后測定菌株對含有不同抗生素藥敏紙片的抑菌圈。參考CLSI標準結(jié)合杭州濱和微生物試劑有限公司提供藥敏判讀標準[7]判定菌株對抗生素是否敏感、中介或耐藥。

1.2.3 小鼠致病性試驗 根據(jù)分子鑒定結(jié)果，從多殺性巴氏桿菌A型、B型和D型中分別選2個分離株進行小鼠致病性試驗。將菌液濃度稀釋為1×107cfu/mL。將42只6周齡雌性昆明小鼠隨機分為7組(6個試驗組和1個對照組)，每組6只。對試驗組小鼠腹腔注射200 μL稀釋菌液，對照組小鼠腹腔注射200 μL生理鹽水。每日觀察各組小鼠臨床癥狀及死亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 羊源多殺性巴氏桿菌細菌分離及鑒定 用滅菌接種環(huán)蘸取少量組織液在平板上進行細菌分離，24 h后發(fā)現(xiàn)部分樣品培養(yǎng)基表面長有針尖狀、(半)透明的菌落；將單一菌落進行革蘭氏染色并鏡檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有1種兩端鈍圓、中間稍微突起的短桿菌，且為革蘭氏陰性菌，可將其初步鑒定為多殺性巴氏桿菌。為進一步對其進行分子鑒定，我們以PCR法對隨機挑選的12份陽性樣品(多殺性巴氏桿菌分離株)基因組中16S rRNA基因序列進行擴增與測序分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12個分離株16S rRNA基因片段擴增產(chǎn)物大小為1 502～1 509 bp，進一步同源性分析發(fā)現(xiàn)以上分離株均為多殺性巴氏桿菌。

2.2 酒泉市部分地區(qū)市售羊肉多殺性巴氏桿菌污染情況調(diào)查結(jié)果 通過對257份市售羊肉樣品進行細菌分離與鑒定，發(fā)現(xiàn)樣品中多殺性巴氏桿菌檢出率為6.22%(16/257)。進一步統(tǒng)計結(jié)果如表2，被調(diào)查的4個地區(qū)中以金塔縣來源樣品多殺性巴氏桿菌檢出率最高，為9.3%(4/43)，其次為肅州區(qū)(7.62%)，而玉門市和敦煌市相對較低，分別為3.45%(2/58)和4.62%(3/65)；2019年采集的羊肉樣品多殺性巴氏桿菌檢出率較2020年高出近1.5倍，分別為9.17%(11/120)和3.65%(5/137)；此外，農(nóng)貿(mào)市場/超市和屠宰場來源樣品中病原檢出率存在差異，分別為8.49%(9/93)、4.55%(6/132)和3.13%(1/32)。以上調(diào)查結(jié)果表明，酒泉市市售羊肉樣品中存在多殺性巴氏桿菌污染情況，這無疑對消費者健康造成較大的威脅。

表2 酒泉市部分地區(qū)市售羊肉多殺性巴氏桿菌污染情況調(diào)查結(jié)果Tab.2 Investigation results of Pasteurella multocida contamination in mutton sold in several areas of Jiuquan City

2.3 多殺性巴氏桿菌血清型鑒定結(jié)果 以煮沸菌液上清DNA為模板，分別用多殺性巴氏桿菌莢膜血清型特異性引物以PCR法進行擴增，將PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳。結(jié)果如表3，16個多殺性巴氏桿菌分離株中含有血清A、B和D型，未鑒定出E型和F型，對應(yīng)菌株數(shù)量分別為9、5和2株，所占比例分別為56.25%、31.25%和12.50%。由此可見，該地區(qū)市售羊肉中多殺性巴氏桿菌血清型較為復(fù)雜，且A型為主要優(yōu)勢種。

表3 多殺性巴氏桿菌血清型鑒定結(jié)果Tab.3 Serotype identification results for Pasteurella multocida

2.4 多殺性巴氏桿菌分離株耐藥性檢測結(jié)果 對本文獲得的16個多殺性巴氏桿菌分離株進行耐藥性檢測與統(tǒng)計。其結(jié)果如表4，分離株對14種常見抗生素耐藥率為0%～100%，其中對林可霉素和磺胺甲氧嘧啶耐藥率最高，分別為100%(16/16)和81.25%(13/16)；對氟苯尼考、氯霉素、頭孢唑林和頭孢他啶相對敏感，其耐藥率分別為0.0%(0/16)、12.5%(2/16)、0.0%(0/16)和6.25%(1/16)。

表4 多殺性巴氏桿菌分離株耐藥性檢測結(jié)果Tab.4 Drug resistance test results for Pasteurella multocida isolates

2.5 不同血清型多殺性巴氏桿菌小鼠致病性試驗結(jié)果 與對照組相比，部分試驗組小鼠在接種對于菌株3 h后出現(xiàn)明顯臨床癥狀，主要表現(xiàn)為精神萎靡、不好動。血清型B多殺性巴氏桿菌-2(B-2)組小鼠在接種6 h后死亡1只，其后不同組部分小鼠均出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，截至接種后30 h，A-1、A-2、B-1和B-2組小鼠全部死亡，而D-1和D-2組小鼠死亡率分別為50.0%和66.7%。對死亡小鼠進行解剖，發(fā)現(xiàn)小鼠心包周圍有纖維性滲出，同時有肺出血，對血液樣品進行涂片鏡檢，發(fā)現(xiàn)有類似多殺性巴氏桿菌形態(tài)學特征的菌株。以上結(jié)果說明，A-1、A-2、B-1和B-2分離株較D-1和D-2分離株對小鼠的致病性強。

3 討 論

多殺性巴氏桿菌為重要人獸共患性病原，該病原感染人可導(dǎo)致病患出現(xiàn)發(fā)熱、痙攣和出汗等癥狀，給患者健康造成一定威脅。人主要因動物咬傷而感染多殺性巴氏桿菌病，但食用被病原污染的肉類也具有感染風險。多殺性巴氏桿菌可感染多種宿主，且該病原在環(huán)境中廣泛存在，而肉類在屠宰、運輸和售賣過程中易受到病原污染，食用被該病原污染的肉類對消費者健康具有潛在威脅。已有報道表明我國市售肉類食源性細菌污染情況較為嚴重[2，4，7-9]，但針對市售肉類多殺性巴氏桿菌污染情況的調(diào)查較為少見。

羊肉因味道鮮美而受到廣大消費者的喜愛，同時羊養(yǎng)殖業(yè)也是酒泉市農(nóng)業(yè)發(fā)展的支柱性產(chǎn)業(yè)。本文旨在初步了解酒泉市市售羊肉多殺性巴氏桿菌污染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該地區(qū)被調(diào)查樣品中巴氏桿菌檢出率為6.22%(16/257)，其結(jié)果提示該地區(qū)市售羊肉中存在多殺性巴氏桿菌污染的情況，而該病原可通過傷口進入患者體內(nèi)，故從事羊肉加工、運輸和售賣的相關(guān)從業(yè)人員在工作時應(yīng)注意自身防護。進一步統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)2019年來源樣品多殺性巴氏桿菌檢測陽性率高于2020年，分別為9.17%和3.65%，筆者猜測由于新冠肺炎導(dǎo)致相關(guān)從業(yè)人員提高了對肉類的衛(wèi)生管理水平，羊在飼養(yǎng)過程中感染多殺性巴氏桿菌的陽性率相對較低，可能其在屠宰、加工、運輸和售賣過程會被該致病菌污染；且農(nóng)貿(mào)市場來源樣品較屠宰場、超市來源樣品陽性率高出許多，這也進一步證實了我們的猜測，因為農(nóng)貿(mào)市場來源的肉類在運輸和售賣過程環(huán)境中致病菌更多，導(dǎo)致致病菌污染肉類概率也更大，這也提示在肉類運輸和售賣過程中應(yīng)注意衛(wèi)生管理。

多殺性巴氏桿菌含有多個血清型，其中導(dǎo)致牛羊出現(xiàn)肺炎的多殺性巴氏桿菌主要為莢膜A血清型[10]，但其它血清型病原也可感染牛羊。劉海燕等研究中發(fā)現(xiàn)四川山羊多殺性巴氏桿菌莢膜血清型主要為A型和B型[7]，而王巍等首次在呼倫貝爾病羊中分離出莢膜血清型D型多殺性巴氏桿菌[11]。本研究以特異性PCR法對分離的菌株進行莢膜血清型鑒定，發(fā)現(xiàn)16個菌株中有9株為A型，5株為B型，2株為D型，但未檢測到E和F型，提示該地區(qū)羊群流行的多殺性巴氏桿菌血清型較為復(fù)雜，這可能與肉類在運輸和售賣過程環(huán)境污染有關(guān)。此外，進一步動物試驗表明，隨機挑選的血清型A型和B型多殺性巴氏桿菌較D型對小鼠的致病性更高，但其中原因還有待進一步研究。

目前對羊多殺性巴氏桿菌的防制主要依賴于抗生素的大量使用，但這也導(dǎo)致大量耐藥株的出現(xiàn)。劉海燕等研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)四川地區(qū)分離的羊多殺性巴氏桿菌對林可霉素和青霉素耐藥率為100.0%，但其對氟苯尼考和復(fù)方新諾明等較為敏感[5]；井郁金等發(fā)現(xiàn)新疆地區(qū)綿羊源多殺性巴氏桿菌對頭孢拉定、替米考星等敏感，但對林可霉素和阿米卡星高度耐藥[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)酒泉地區(qū)羊源多殺性巴氏桿菌對氟苯尼考、氯霉素等抗生素高度敏感，但對林可霉素耐藥率達100%，這與他人研究基本一致[5,11]，這同時也說明該地區(qū)羊源多殺性巴氏桿菌對不同抗生素耐藥程度較高，應(yīng)引起相關(guān)養(yǎng)殖戶的重視。