方樂平 董振 樊衛(wèi)飛

肺癌是最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均位居我國惡性腫瘤之首。隨著人口老齡化加劇，老年肺癌病人的數(shù)量和比重亦有所增加，現(xiàn)有超過1/3的新發(fā)肺癌病例年齡≥75歲[1]。肺癌病人預(yù)后差，在大多數(shù)國家，肺癌的5年生存率<15%[2]。很多老年人因無法耐受手術(shù)、化療、放療等抗腫瘤治療，僅接受保守治療，導(dǎo)致該類病人的預(yù)后更差。因此，篩選合適的指標(biāo)來評估老年肺癌病人預(yù)后、指導(dǎo)治療顯得尤為重要。

轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-2(transcription factor activator protein-2，TFAP-2或AP-2)是具有細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子家族，它既調(diào)控正常機(jī)體的生長發(fā)育，又參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3-4]。TFAP-2在哺乳動物中由5個旁系同源物組成：TFAP-2a至TFAP-2e，分別編碼蛋白質(zhì)AP-2a至AP-2e。TFAP-2a在很多類型的腫瘤中表達(dá)異常，被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。但TFAP-2a在肺腺癌中的報道很少見，更未有對老年病人進(jìn)行單獨(dú)研究。本研究著眼于明確TFAP-2a在老年肺腺癌病人中的表達(dá)水平，并研究其與常見臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，為老年肺腺癌個性化治療和預(yù)后評估提供理論支持。

1 資料和方法

1.1 基本資料

1.1.1 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫：本研究選取Gene Expression Profilling Interactive Analysis(GEPIA)數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)和Kaplan Meier-plotter(KMplot)數(shù)據(jù)庫(https://www.kmplot.com/analysis/)。

1.1.2 組織標(biāo)本：取自2015年8月至2020年3月連云港市第二人民醫(yī)院手術(shù)切除的人肺組織的石蠟包埋標(biāo)本庫，共64例老年肺腺癌病人和25例老年肺部良性疾病病人(肺部良性疾病病人的肺組織標(biāo)本為因病情需要行手術(shù)取得，為正常肺組織)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病人的原始資料完整；(2)病人術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療；(3)病人均經(jīng)病理學(xué)明確診斷，為原發(fā)的肺腺癌；(4)沒有其他惡性腫瘤病史；(5)年齡≥60歲。排除圍手術(shù)期死亡、手術(shù)前遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病人。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)挖掘：在GEPIA數(shù)據(jù)庫中輸入TFAP-2a，可以得到TFAP-2a在全身諸多組織器官及對應(yīng)腫瘤中的表達(dá)水平概覽。點(diǎn)擊Expression DIY，選擇Box Plot，Datasets Selection (Cancer name)中選擇LUAD，P值設(shè)為0.05，其余默認(rèn)，即可生成TFAP-2a在肺腺癌組織和正常肺組織中的表達(dá)水平的箱式圖。點(diǎn)擊Expression DIY，選擇Stage Plot，Datasets Selection (Cancer name)中選擇LUAD，即可生成TFAP-2a在不同分期肺腺癌組織中的表達(dá)水平的柱狀圖。

登錄KMplot數(shù)據(jù)庫，點(diǎn)擊mRNA RNA-seq模塊中的pan-cancer分析，Gene Symbol中輸入TFAP-2a，勾選Lung adenocarcinoma，Survival分析依次選擇總生存期(OS)和無復(fù)發(fā)生存期(RFS)，點(diǎn)擊下方Draw Kaplan Meier plot，即可生成TFAP-2a與肺腺癌預(yù)后的折線圖。

1.2.2 TFAP-2a表達(dá)測定：采用免疫組化法檢測肺腺癌組織和正常肺組織中TFAP-2a的表達(dá)情況。4μm白片60 ℃烤片4 h，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化。0.01 mol/L檸檬酸鹽(pH 6.0)緩沖液高溫高壓修復(fù)2 min，3%的過氧化氫(H2O2)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。1∶200 TFAP-2a一抗4 ℃過夜，1∶300二抗室溫孵育2 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染。陰性對照用PBS代替一抗。免疫組化試劑盒和DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

評分標(biāo)準(zhǔn)：(1)按陽性細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞數(shù)的百分比計分：①0%～5%，0分；②6%～20%，1分；③21%～50%，2分；④51%～100%，3分。(2)染色強(qiáng)度評分：①無染色，0分；②低度染色(淺黃色)，1分；③中度染色(棕黃色)，2分；④強(qiáng)染色(棕褐色)，3分?？偡e分=染色范圍積分×染色強(qiáng)度積分。結(jié)果判斷：總積分≤4分為陰性，≥6分為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以頻數(shù)和百分比表示，采用卡方檢驗(yàn)分析肺腺癌臨床病理參數(shù)與TFAP-2a表達(dá)的相關(guān)性，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)挖掘結(jié)果

2.1.1 GEPIA數(shù)據(jù)庫中查詢到的TFAP-2a的表達(dá)情況：肺腺癌組織中TFAP-2a的表達(dá)水平顯著高于正常肺組織(P<0.05)，見圖1。TFAP-2a的表達(dá)水平與肺腺癌的TNM分期無明顯相關(guān)性(P>0.05)，但Ⅲ、Ⅳ期肺腺癌組織中TFAP-2a的表達(dá)有增高趨勢，見圖2。

注：*P<0.05

圖2 GEPIA數(shù)據(jù)庫中TFAP-2a在肺腺癌各分期中的表達(dá)情況

2.1.2 KMplot數(shù)據(jù)庫分析TFAP-2a與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系：KMplot數(shù)據(jù)庫可以提取TFAP-2a的mRNA水平與肺腺癌預(yù)后的相關(guān)數(shù)據(jù)，對生存數(shù)據(jù)進(jìn)行Kaplan-Meier分析。結(jié)果顯示，TFAP-2a低表達(dá)的肺腺癌病人的RFS和OS相較于高表達(dá)病人明顯獲益，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 TFAP-2a mRNA表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系

2.2 TFAP-2a在老年正常肺組織和老年肺腺癌組織中的表達(dá)情況 25份正常肺組織標(biāo)本中，有6份TFAP-2a表達(dá)呈陽性，陽性率為24.0%；64份肺腺癌標(biāo)本中，有44份TFAP-2a表達(dá)呈陽性，陽性率為68.8%。二者陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.62，P<0.01)。

2.3 TFAP-2a的表達(dá)與肺腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 TFAP-2a的表達(dá)與老年肺腺癌病人的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有相關(guān)性(P<0.05)，而與性別、吸煙情況、年齡、腫瘤大小及TNM分期無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 TFAP-2a的表達(dá)與肺腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

3 討論

近年來，肺腺癌發(fā)病率已超過肺鱗癌，成為發(fā)病率最高的肺癌，其總發(fā)病率約占原發(fā)性肺癌的50%，治療手段主要包括手術(shù)治療、放療、化療、靶向治療、免疫治療等，臨床多以綜合治療來提高治療效果。TFAP-2a基因位于6號染色體短臂，編碼合成含437個氨基酸的蛋白質(zhì)，可通過與靶基因特定序列結(jié)合而調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，從而參與細(xì)胞的生長分化及發(fā)育。TFAP-2a基因在腫瘤信號傳導(dǎo)中具有重要的調(diào)節(jié)作用，其在肺腺癌中的表達(dá)水平以及在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中是具有正性調(diào)節(jié)作用還是負(fù)性調(diào)節(jié)作用目前還存在較大爭議。曾有研究發(fā)現(xiàn)，TFAP-2的過表達(dá)與細(xì)胞周期激活非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的發(fā)生有關(guān)[5-6]，而TFAP-2a可通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)激活上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)來促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生發(fā)展[2, 7]。另一方面，有研究發(fā)現(xiàn)TFAP-2a的下調(diào)可能與煙霧誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生有關(guān)[8]。尼古丁可通過激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和抑制TFAP-2a刺激人肺癌細(xì)胞中過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)β/δ的表達(dá)[9]。在治療方面，TFAP-2a的表達(dá)水平與肺腺癌治療中的化療耐藥性有關(guān)[10]，而且，Zhang等[4]發(fā)現(xiàn)TFAP-2a可通過促進(jìn)腫瘤誘導(dǎo)的血管生成來加速對安羅替尼的抵抗。TFAP-2a也被報道可介導(dǎo)等位基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的DACT2基因來提高晚期肺腺癌中表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)的療效[11]。

本研究首先通過生物信息學(xué)技術(shù)來挖掘TFAP-2a基因和蛋白在肺腺癌中的表達(dá)水平。GEPIA數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果顯示，相較于正常肺組織，肺腺癌組織中TFAP-2a呈高表達(dá)，但與TNM分期無關(guān)；KMplot數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果顯示，高表達(dá)TFAP-2a的肺腺癌病人OS及RFS較低表達(dá)病人明顯縮短。這些結(jié)果表明，TFAP-2a可能在肺腺癌中發(fā)揮促癌作用。分析TFAP-2a在老年肺腺癌組織與老年正常肺組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)TFAP-2a在老年肺腺癌組織中高表達(dá)的比例顯著高于正常肺組織，但不同TNM分期肺腺癌病人的TFAP-2a表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，筆者推測TFAP-2a可能也是誘導(dǎo)老年肺腺癌發(fā)生的一種主要蛋白。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度與疾病進(jìn)展程度和腫瘤的惡性程度均存在密切關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，TFAP-2a高表達(dá)在分化差、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌病人中比例更高。Liu等[2]發(fā)現(xiàn)TFAP-2a可誘導(dǎo)KRT16在肺腺癌中過表達(dá)，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。

綜上所述，TFAP-2a在老年肺腺癌病人中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與病人局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度密切相關(guān)。TFAP-2a的異常表達(dá)在老年肺腺癌的發(fā)生發(fā)展和病人預(yù)后中可能起重要作用，并且有希望成為治療肺癌的新靶點(diǎn)。今后還需要借助大量的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明TFAP-2a在肺癌發(fā)生中的作用機(jī)制，為老年肺癌早期診斷、基因治療、預(yù)后評估等提供新的思路。