余偉，丁立，陳玉倩，吳向鋒，陳俊

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）作為一種神經(jīng)退行性疾病，可導(dǎo)致患者記憶力和認(rèn)知功能的逐漸下降，也可產(chǎn)生明顯的神經(jīng)精神障礙癥狀，其中以抑郁和焦慮較常見(jiàn)[1,2]。抑郁和焦慮會(huì)嚴(yán)重影響AD患者的生活質(zhì)量[2]。小檗堿來(lái)源于傳統(tǒng)中草藥黃連，具有抗炎、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用[3]。越來(lái)越多的研究表明，小檗堿可作為治療AD 的潛在藥物[4,5]。本研究通過(guò)小檗堿干預(yù)5XFAD 轉(zhuǎn)基因小鼠，并利用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小檗堿對(duì)小鼠抑郁和焦慮的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠（28～32g）48 只，3 月齡，購(gòu)于美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室。所有小鼠飼養(yǎng)在恒溫（21 ℃～22 ℃）和具備空氣過(guò)濾的SPF 級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi),每隔12 h 光暗循環(huán)，自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)鼠糧和飲水。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，并根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生研究院指南進(jìn)行護(hù)理和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。48只小鼠隨機(jī)分為4 組：對(duì)照組、小檗堿低劑量組、小檗堿中劑量組、小檗堿高劑量組，每組12只，分別給予小檗堿灌胃，小檗堿低劑量組給予小檗堿50 mg/(kg·d)，小檗堿中劑量組給予小檗堿100 mg/(kg·d)，小檗堿高劑量組給予小檗堿150 mg/(kg·d)，對(duì)照組用等容量生理鹽水灌胃，灌胃容積均為0.1 mL/30 g，每天灌胃1次，共90 d。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備 小檗堿（購(gòu)于Sigma 公司）；生理鹽水購(gòu)自四川科倫藥業(yè)公司；曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、懸尾實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)由上海欣軟信息科技有限公司提供。

1.2 方法

由于小鼠連續(xù)進(jìn)行不同的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，不同的行為學(xué)測(cè)試之間可能會(huì)相互影響，為了減少行為學(xué)實(shí)驗(yàn)之間的相互影響可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的干擾，所有小鼠統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)順序如下：在灌胃滿(mǎn)90 d后，行為學(xué)測(cè)試第1 天行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，第2 天行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)，第3天行懸尾實(shí)驗(yàn)，第4天行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，行為學(xué)測(cè)試均在上午08∶00~12∶00之間進(jìn)行，見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間表

1.2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 提前30 min將小鼠放入實(shí)驗(yàn)房間使小鼠適應(yīng)環(huán)境，減少新環(huán)境對(duì)小鼠活動(dòng)的影響。實(shí)驗(yàn)裝置主要由規(guī)格為50×50×50 cm3的敞箱組成。敞箱底部被劃分為25 個(gè)方格，中間9 個(gè)方格區(qū)域被設(shè)定為中央?yún)^(qū)，外周16 個(gè)方格區(qū)域被設(shè)定為外周區(qū)。測(cè)試時(shí)將小鼠放入敞箱內(nèi)自由活動(dòng)10 min，最后計(jì)算小鼠在中央?yún)^(qū)的停留時(shí)間、中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)路程和外周區(qū)運(yùn)動(dòng)路程[6]。小鼠在中央?yún)^(qū)的停留時(shí)間和運(yùn)動(dòng)路程越長(zhǎng)表明小鼠焦慮程度越低，反之焦慮程度越高。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，清除小鼠排泄物，并用乙醇棉對(duì)實(shí)驗(yàn)箱進(jìn)行擦拭以消除上一只小鼠的氣味。

1.2.2 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 提前30 min將小鼠放入實(shí)驗(yàn)房間使小鼠適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)裝置主要由2條開(kāi)放臂（30×5 cm2）和2 條閉合臂（30×5×15 cm3）及中央?yún)^(qū)（5×5 cm2）組成。測(cè)試時(shí)首先將小鼠放置于中央?yún)^(qū)，面向開(kāi)放臂，讓其在安靜環(huán)境下自由活動(dòng)5 min，最后統(tǒng)計(jì)小鼠開(kāi)放臂和閉合臂的停留時(shí)間、開(kāi)放臂和閉合臂的進(jìn)入次數(shù)以及運(yùn)動(dòng)總路程[6]。小鼠在開(kāi)放臂的停留時(shí)間越長(zhǎng)、進(jìn)入次數(shù)越多和運(yùn)動(dòng)總路程越長(zhǎng)表明小鼠焦慮程度越低，反之焦慮程度越高。

1.2.3 懸尾實(shí)驗(yàn) 提前30 min將小鼠放入實(shí)驗(yàn)房間使小鼠適應(yīng)環(huán)境。測(cè)試時(shí)將小鼠尾端懸吊于鐵架上，同時(shí)使其頭部距離地面20 cm，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中全程保持安靜，最后統(tǒng)計(jì)小鼠6 min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間。小鼠的不動(dòng)狀態(tài)定義為：四肢不動(dòng)并保持10 s即視為不動(dòng)[7]。小鼠的不動(dòng)時(shí)間越長(zhǎng)表明小鼠的抑郁程度越高，反之抑郁程度越低。

1.2.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 提前30 min將小鼠放入實(shí)驗(yàn)房間使小鼠適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)裝置主要由高35 cm、直徑15 cm 的透明玻璃杯組成。測(cè)試時(shí)將小鼠緩慢放入水中，強(qiáng)迫小鼠游泳6 min，最后統(tǒng)計(jì)小鼠后4 min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持安靜，并且保持玻璃杯水深10 cm，水溫（25±1）℃。小鼠的不動(dòng)狀態(tài)定義為：四肢處于漂浮、失去掙扎或只做輕微的動(dòng)作[8]。小鼠的不動(dòng)時(shí)間越長(zhǎng)表明小鼠的抑郁程度越高，反之抑郁程度越低。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS23.0 軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布及方差齊性的計(jì)量資料以（）表示；單因素方差分析（ANOVA），LSD-t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小檗堿對(duì)小鼠焦慮的影響

在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，小檗堿中劑量組的中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)路程有增加，有顯著性差異（P<0.01），但低劑量組和高劑量組的中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)路程與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與對(duì)照組相比，小檗堿中劑量組和高劑量組的中央?yún)^(qū)時(shí)間增加（P<0.05 或P<0.01），但低劑量組的中央?yún)^(qū)時(shí)間與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與小檗堿低劑量組相比，中劑量組和高劑量組的中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)路程差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），中劑量組的中央?yún)^(qū)時(shí)間增加（P<0.05），高劑量組的中央?yún)^(qū)時(shí)間與低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與小檗堿中劑量組相比，高劑量組的中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)路程減少（P<0.05），中央?yún)^(qū)時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，小檗堿干預(yù)組的開(kāi)放臂停留時(shí)間均增加（均P<0.01）；小檗堿中劑量組和高劑量組的開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)增加（P<0.01），低劑量組的進(jìn)入次數(shù)與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；小檗堿低劑量組和中劑量組的運(yùn)動(dòng)總路程增加（P<0.05 或P<0.01），但高劑量組的運(yùn)動(dòng)總路程與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與小檗堿低劑量組相比，中劑量組的開(kāi)放臂停留時(shí)間增加（P<0.01），高劑量組的開(kāi)放臂停留時(shí)間減少（P<0.05）；中劑量組的開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)增加（P<0.01），但高劑量組的進(jìn)入次數(shù)與低劑量組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；高劑量組和中劑量組的運(yùn)動(dòng)總路程與低劑量組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與小檗堿中劑量組相比，高劑量組的開(kāi)放臂停留時(shí)間和開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)均減少（P<0.05或P<0.01），運(yùn)動(dòng)總路程與中劑量組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 小檗堿對(duì)小鼠抑郁的影響

在懸尾實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，小檗堿干預(yù)組的不動(dòng)時(shí)間均下降（P<0.01）；與小檗堿低劑量組相比，中劑量組和高劑量組的不動(dòng)時(shí)間均下降（P<0.05 或P<0.01）；小檗堿中劑量組與高劑量組的不動(dòng)時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，小檗堿干預(yù)組的不動(dòng)時(shí)間均下降（P<0.01）；與小檗堿低劑量組相比，中劑量組的不動(dòng)時(shí)間下降（P<0.01），高劑量組的不動(dòng)時(shí)間與低劑量組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；高劑量組的不動(dòng)時(shí)間與中劑量組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

抑郁和焦慮等神經(jīng)精神障礙癥狀是AD患者較常見(jiàn)的精神行為異常，與健康者相比，AD 患者更易表現(xiàn)出抑郁和焦慮[2]。和人類(lèi)一樣，AD模型小鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中也常表現(xiàn)出抑郁和焦慮行為[9]。最新的研究表明，5XFAD人源化AD轉(zhuǎn)基因小鼠可作為研究AD 精神行為癥狀的動(dòng)物模型[10]。在臨床實(shí)踐中，針對(duì)AD 的抑郁和焦慮多采用西藥進(jìn)行治療，常用的藥物有氟西汀、舍曲林、丁螺環(huán)酮等，這些藥在用藥的起始階段副作用比較明顯，少部分患者不能耐受[11]。研究報(bào)道，中草藥黃連主要有效成分小檗堿具有改善抑郁和焦慮等神經(jīng)精神障礙癥狀的功效[12]，而小檗堿耐受性好，價(jià)格相對(duì)便宜，可成為西藥治療的有益補(bǔ)充。

本研究采用國(guó)際上最常用的5XFAD人源化AD轉(zhuǎn)基因小鼠作為AD 小鼠模型，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在給予不同劑量的小檗堿干預(yù)后，小鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間均減少，這就提示小檗堿可改善5XFAD 小鼠的抑郁；在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，開(kāi)放臂停留時(shí)間、開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)、運(yùn)動(dòng)總路程均增加（低劑量組的進(jìn)入次數(shù)與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；高劑量組的運(yùn)動(dòng)總路程與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)動(dòng)路程和中央?yún)^(qū)時(shí)間也同樣增加（低劑量組和高劑量組的運(yùn)動(dòng)路程與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；低劑量組的中央?yún)^(qū)時(shí)間與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），提示小檗堿能改善5XFAD 小鼠的焦慮。此外，在三個(gè)干預(yù)組中，中劑量組的改善效果最好，高劑量其次，這提示小檗堿在治療5XFAD小鼠時(shí)存在一個(gè)最適劑量，劑量低了達(dá)不到最佳效果，劑量過(guò)高療效非但不增加，反而會(huì)增加用藥的風(fēng)險(xiǎn)。

小檗堿具有多種生化和藥理作用，比如抗炎和抗氧化應(yīng)激，同時(shí)它也能抑制介導(dǎo)AD 發(fā)病的兩種關(guān)鍵酶（β-分泌酶和γ-分泌酶）的活性[13,14]。在AD患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)可發(fā)現(xiàn)較明顯的炎癥反應(yīng)，這種神經(jīng)炎癥反應(yīng)可能是AD 較顯著的病理特征[15]。炎癥反應(yīng)中的炎性細(xì)胞因子具有神經(jīng)毒性作用，這種神經(jīng)毒性作用會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[16,17]。而小檗堿可通過(guò)降低炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子（IL-6、MCP-1、iNOS 和COX-2）來(lái)抑制炎癥反應(yīng)[18]。小檗堿的這種抗炎作用可能降低了炎癥反應(yīng)所致的神經(jīng)毒性，進(jìn)而延緩AD的進(jìn)展。同時(shí)，在AD患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)可檢測(cè)到氧化應(yīng)激標(biāo)志物[15,19]。氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)Aβ沉積和神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFT）形成[20,21]。而小檗堿可通過(guò)提高AD 小鼠大腦中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶-1/2 和谷胱甘肽合成酶的水平以及增強(qiáng)谷胱甘肽還原酶的生物活性和降低γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的生物活性來(lái)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用[22]。此外，神經(jīng)炎癥與氧化應(yīng)激之間的惡性循環(huán)可能導(dǎo)致部分神經(jīng)功能失調(diào)[23]，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)之間的這種惡性循環(huán)與NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)[24]?；贜F-κB 信號(hào)通路這一重要切入點(diǎn)，有研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和抗炎的作用，進(jìn)而降低Tau 蛋白異常過(guò)度磷酸化，改善 AD 小鼠的癥狀[5,22]。另外，β-分泌酶和γ-分泌酶依次水解淀粉樣蛋白前體蛋白將會(huì)導(dǎo)致Aβ的生成和積累。小檗堿可抑制β-分泌酶和γ-分泌酶的活性，導(dǎo)致β-分泌酶和γ-分泌酶剪切淀粉樣蛋白前體蛋白的作用減弱，進(jìn)而減少Aβ沉積，延緩老年斑的形成[14]。有研究表明，自噬與Aβ的清除有關(guān)，自噬活性增強(qiáng)有助于清除AD 小鼠腦中沉積的Aβ，若自噬活性降低將導(dǎo)致Aβ沉積的增加。小檗堿可通過(guò)增加AD 小鼠腦中LC3-II、beclin-1、hVps34 和組織蛋白酶 D 的水平以及降低P62 和Bcl-2 的水平來(lái)增強(qiáng)自噬活性，進(jìn)而促進(jìn)AD小鼠海馬中Aβ的清除，改善AD小鼠的癥狀[25]。

本研究證實(shí)小檗堿可改善5XFAD 小鼠的抑郁和焦慮，可作為AD 西藥治療的有益補(bǔ)充，可為AD 患者抑郁和焦慮的治療提供一種新的策略，也為抗AD 的中藥臨床應(yīng)用提供了重要信息。但本研究也有部分局限性，本研究發(fā)現(xiàn)小檗堿50 mg/kg 和150 mg/kg 對(duì)5XFAD 小鼠抑郁和焦慮的改善效果并不優(yōu)于小檗堿100 mg/kg。導(dǎo)致這種結(jié)果的原因可能是小檗堿50 mg/kg 低于最適宜劑量，而小檗堿150 mg/kg 相對(duì)于臨床有效劑量來(lái)說(shuō)可能過(guò)大而致小檗堿改善效果降低。因此，改善5XFAD小鼠抑郁和焦慮最適宜的小檗堿劑量還需進(jìn)一步探究。此外，有關(guān)小檗堿改善5XFAD 小鼠抑郁和焦慮的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探討，這也是本研究下一步的研究方向。綜上所述，小檗堿能改善5XFAD小鼠的抑郁和焦慮，為進(jìn)一步探究小檗堿改善5XFAD 小鼠抑郁和焦慮的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為未來(lái)小檗堿在AD 患者中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。