陳 劍， 鮮 新， 呂 寒， 劉 艷， 任冰如， 李維林

〔江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園) 江蘇省抗糖尿病藥物篩選技術(shù)服務(wù)中心， 江蘇 南京 210014〕

白子菜〔Gynuradivaricata(Linn.) DC.〕又名白背三七，隸屬于菊科(Asteraceae)菊三七屬(GynuraCass.)，為多年生草本[1]。白子菜是中國傳統(tǒng)中草藥，用于治療咳嗽、瘡瘍、跌打損傷以及風(fēng)濕疼痛等[2]，在部分地區(qū)亦基于其保健作用作為蔬菜栽培?，F(xiàn)代藥理研究表明：白子菜具有降血壓、降血糖、降血脂和治療糖尿病等功效[3-6]。白子菜中豐富的酚類成分是其主要的生理活性物質(zhì)，如黃酮類和咖啡?？鼘幩犷惖萚6-8]。藥用植物次生代謝產(chǎn)物含量與氣候和季節(jié)變化等外部因子密切相關(guān)[9]。本研究選擇白子菜中含量較高的10個(gè)代表性酚類成分，利用高效液相色譜法對(duì)同一生長周期4月至11月白子菜葉片中酚類成分含量進(jìn)行測定，以期為確定白子菜的最佳采收時(shí)期提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試白子菜栽種于南京中山植物園苗圃地，經(jīng)江蘇省中國科學(xué)院植物研究所任冰如研究員鑒定。分別于2020年4月至11月每月10日采集白子菜健康生長全葉500 g，然后于40 ℃烘干5 h，粉碎后過50目篩，-20 ℃保存、備用。

主要儀器：Ultimate3000高效液相色譜儀(美國DIONEX公司)；Direct-Q?UV超純水機(jī)(美國Millipore公司)；EL204型電子天平〔梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司〕；FE20型pH計(jì)〔梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司〕；Welchrom?C18E固相萃取柱〔月旭科技(上海)股份有限公司〕；FG-24固相萃取儀(天津市富城達(dá)科技有限公司)。

主要試劑：新綠原酸(批號(hào)X-014-110822)、綠原酸(批號(hào)L-007-160504)、隱綠原酸(批號(hào)Y-067-110825)、3，4-二咖啡?？鼘幩?批號(hào)Y-069-141122)、3，5-二咖啡酰奎寧酸(批號(hào)Y-068-160726)、4，5-二咖啡?？鼘幩?批號(hào)Y-070-161102)、異槲皮苷(批號(hào)Y-076-180517)、煙花苷(批號(hào)S-065-180314)和紫云英苷(批號(hào)Z-020-171205)均購于成都瑞芬思生物科技有限公司，純度大于98%；蘆丁(批號(hào)C2/H30016)購于南京春秋生物工程有限公司，純度大于98%；甲醇(色譜純)和乙腈(色譜純)購于美國Tedia公司；其他常規(guī)試劑為分析純。

1.2 方法

色譜條件：InertSustain C18液相色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm，日本GL Science公司)；以乙腈(A)-磷酸緩沖液(pH 2.0，B)為流動(dòng)相梯度洗脫(0～20 min，體積分?jǐn)?shù)10%A；20～25 min，體積分?jǐn)?shù)10%～18%A；25～65 min，體積分?jǐn)?shù)18%A；65～70 min，體積分?jǐn)?shù)18%～25%A；70～75 min，體積分?jǐn)?shù)25%A；75～80 min，體積分?jǐn)?shù)25%～90%A)，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、3，4-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡?？鼘幩岷?，5-二咖啡?？鼘幩岬臋z測波長為325 nm，蘆丁和異槲皮苷的檢測波長為254 nm，煙花苷和紫云英苷的檢測波長為265 nm。

對(duì)照品溶液制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法和結(jié)果與文獻(xiàn)[10]一致。

分別稱取各樣品2.0 g，精密稱量后加入70.0 mL體積分?jǐn)?shù)90%乙醇，加熱回流提取60 min，過濾，濾液于40 ℃減壓濃縮至無醇，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇復(fù)溶，于室溫、10 000 r·min-1離心10 min，取上清液滴入固相萃取柱，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇洗脫，洗脫液合并后于40 ℃減壓濃縮蒸干后用甲醇溶解并定容至5 mL，用0.45 μm有機(jī)濾頭過濾，濾液為供試品溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣測定并根據(jù)峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中各成分的質(zhì)量濃度，根據(jù)公式“某成分含量=(該成分質(zhì)量濃度×稀釋體積)/樣品質(zhì)量”計(jì)算葉片中各成分含量。每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。樣品中總酚類成分含量為上述10個(gè)酚類成分含量之和。

方法學(xué)考察的方法和結(jié)果與文獻(xiàn)[10]一致。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL 2016和Graphpad Prism 7軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和差異顯著性分析(one-way ANOVA)。

2 結(jié)果和分析

不同月份白子菜葉片中酚類成分含量的比較結(jié)果見表1。

由表1可見：不同月份白子菜葉片的咖啡?？鼘幩犷惓煞种校戮G原酸和綠原酸含量在8月份達(dá)到最高值，分別為0.206 9和0.451 6 mg·g-1；隱綠原酸僅在7月份檢出，含量為0.014 8 mg·g-1，其他月份未檢出；3，4-二咖啡?？鼘幩岷?，5-二咖啡?？鼘幩岷吭?0月份最高，分別為0.021 4和0.368 9 mg·g-1；4，5-二咖啡?？鼘幩岷吭?月份最高，為0.041 6 mg·g-1；咖啡酰奎寧酸類成分總含量分別在4月份和8月份有2個(gè)峰值，其中在8月份最高，為0.847 5 mg·g-1。

由表1還可見：不同月份白子菜葉片的黃酮類成分中，蘆丁含量在8月份達(dá)到最高值，為1.017 5 mg·g-1；異槲皮苷、煙花苷和紫云英苷含量在4月份最高，分別為1.763 2、0.256 3和0.066 3 mg·g-1；黃酮類成分總含量在4月份和8月份有2個(gè)峰值，其中在4月份最高，為2.673 5 mg·g-1。

同一月份白子菜葉片中黃酮類成分總含量均高于咖啡?？鼘幩犷惓煞挚偤俊Ｒ钥偡宇惓煞钟?jì)算，白子菜葉片中總酚類成分含量在4月份最高，為3.317 2 mg·g-1，8月份次之，為2.716 0 mg·g-1，且4月份和8月份的總酚類成分含量顯著(P<0.05)高于其他月份。

表1 不同月份白子菜葉片中酚類成分含量的比較

3 討論和結(jié)論

黃酮類和咖啡?？鼘幩犷惖确宇惓煞譃橹参镏谐Ｒ姷拇紊x產(chǎn)物。4月份是白子菜萌發(fā)生長初級(jí)階段，此時(shí)植物體內(nèi)代謝活動(dòng)較強(qiáng)，次生代謝產(chǎn)物含量處于高水平狀態(tài)。開花是植物發(fā)育過程中的重要環(huán)節(jié)，包含一系列極為復(fù)雜的生理生化過程。植物開花階段的代謝活動(dòng)呈明顯的規(guī)律變化[11]。8月份是白子菜花期，白子菜葉片中黃酮類成分總含量和咖啡酰奎寧酸類成分總含量也較高，推測其含量增加可能與植物花期特殊的代謝變化有關(guān)。吳菊蘭等[12]對(duì)來源于中國浙江和南美地區(qū)的白子菜葉片中總黃酮含量進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示：8月初白子菜葉片中總黃酮含量最高。南京地區(qū)的5月份至7月份為梅雨季節(jié)，雨水較多而光照較少，白子菜葉片中黃酮類成分總含量和咖啡酰奎寧酸類成分總含量處于低水平狀態(tài)，可能與該時(shí)期低光照、高降水有關(guān)。9月份和10月份進(jìn)入秋季，氣溫逐漸降低，植物體代謝水平降低；11月份白子菜生長基本進(jìn)入休眠期，這可能是該時(shí)期白子菜葉片中酚類次生代謝產(chǎn)物含量降低的原因。

本研究結(jié)果表明：白子菜葉片中黃酮類成分總含量和咖啡?？鼘幩犷惓煞挚偤烤?月份和8月份有2個(gè)峰值，其中，黃酮類成分總含量在4月份最高，而咖啡?？鼘幩犷惓煞挚偤吭?月份最高。由于4月份氣溫偏低，白子菜生長緩慢，葉生長量較低，而8月份氣溫高、晴好天氣多，白子菜葉生長量高，從實(shí)際生產(chǎn)的角度考慮，8月份為白子菜的最佳采收期。