黃貝，王鵬,2*，溫明霞，吳韶輝，徐建國(guó),2

（1.浙江省柑橘研究所，浙江臺(tái)州 318026；2.國(guó)家柑橘品種改良中心浙江分中心，浙江臺(tái)州 318026）

柑橘花芽形成是營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的重要標(biāo)志[1]，這一過程包含形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、遺傳表達(dá)等多方面的復(fù)雜變化。柑橘實(shí)生苗童期長(zhǎng)達(dá)3～8年，其間花芽分化受阻，只進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，但嫁接的枝條經(jīng)過誘導(dǎo)，次年便可形成花芽，進(jìn)入生殖生長(zhǎng)[2]?；ㄑ渴欠癯晒Ψ只苯佑绊懜涕俚膾旃亢秃笃诠麑?shí)品質(zhì)，對(duì)果樹大小年的控制有極大的意義。充足的養(yǎng)分積累有利于樹勢(shì)的保持，水分供應(yīng)是植物生長(zhǎng)代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)，花芽分化期間需要適當(dāng)?shù)乃使?yīng)。生產(chǎn)上通過控制水分對(duì)果樹的發(fā)育周期進(jìn)行調(diào)節(jié)，檸檬[3-4]、金柑和四季橘[5]在水分調(diào)控作用下實(shí)現(xiàn)全年多次集中開花，具有可觀的經(jīng)濟(jì)效益。李文慶等[6]曾在干旱條件下研究砂糖橘花芽分化與形成，發(fā)現(xiàn)干旱可以誘導(dǎo)砂糖橘花芽分化提前，且在不同強(qiáng)度干旱處理下花芽萌發(fā)率皆高于對(duì)照組，開花樹比例及成花數(shù)量均隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而增加。柑橘花芽生理分化過程伴隨著一系列成花相關(guān)基因的表達(dá)，并受轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄水平和表觀調(diào)控的影響。同源FLOWERING LOCUS T（FT）基因產(chǎn)物在多數(shù)植物體內(nèi)被認(rèn)定為“成花素”，NISHIKAWA等克隆了溫州蜜柑成花同源基因FT，并在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了FT基因轉(zhuǎn)錄水平的高低可以作為評(píng)估柑橘花芽分化是否形成和完全的指標(biāo)[7-8]。PILLITTERI等[9]曾報(bào)道甜橙花芽形成末期APETALA1（AP1）轉(zhuǎn)錄水平增加明顯，并認(rèn)為AP1蛋白參與甜橙開花器官的發(fā)育，因而推測(cè)溫州蜜柑在花芽形態(tài)學(xué)形成期間AP1基因轉(zhuǎn)錄水平會(huì)顯著性增加。目前，柑橘干旱脅迫方面的研究大多集中于處理后對(duì)樹勢(shì)生理和果實(shí)品質(zhì)的影響，而干旱促進(jìn)柑橘成花方面的研究還比較少。本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)置多種干旱處理，追蹤處理后植株成花狀態(tài)，檢測(cè)樹體生理參數(shù)和成花相關(guān)基因FT和AP1的表達(dá)量，明確何種處理對(duì)溫州蜜柑兩年生嫁接苗成花誘導(dǎo)效果最好。該研究結(jié)果可對(duì)干旱調(diào)控成花技術(shù)的開發(fā)及其在柑橘設(shè)施生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與生長(zhǎng)環(huán)境

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的兩年生溫州蜜柑‘由良’（Citrus unshiu‘Yura’）嫁接容器苗植株并帶土移栽入44 cm×33 cm×25 cm 的塑料盆中，于2019 年4 月置于浙江省柑橘研究所實(shí)驗(yàn)基地避雨棚內(nèi)生長(zhǎng)，樣品隨機(jī)區(qū)組排列。2019 年9 月20 日開始進(jìn)行干旱脅迫，除水分外，其他栽培管理措施均保持一致。制作切片的腋芽采集時(shí)間為2020 年3 月9 日，每個(gè)處理組重復(fù)取樣2 次；用作基因檢測(cè)和生理指標(biāo)測(cè)定的新梢葉片和莖的采集統(tǒng)一在干旱設(shè)定時(shí)間結(jié)束后上午10：00左右，每組樣品重復(fù)取樣3次，擦凈表面污物，立即投入液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室于－80 ℃條件下保存，備用。

1.2 干旱脅迫程度的確立與保持

干旱處理前正常澆水管理4 個(gè)月以恢復(fù)樹勢(shì)，實(shí)驗(yàn)開始前將參試的盆栽苗澆透，待含水量下降到預(yù)設(shè)值時(shí)開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。據(jù)前人測(cè)定，柑橘根系生長(zhǎng)適宜的土壤（絕對(duì)）含水量為17%～18%[10]，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)土壤水分含量不同設(shè)對(duì)照（CK，土壤含水量為15%～20%）、輕度干旱（12%～15%）、中度干旱（8%～10%）和重度干旱（4%～6%）4 個(gè)處理水平，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。每天上午9：00 用農(nóng)業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)儀（浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司）測(cè)定柑橘根圍3個(gè)不同位置的土壤含水量，并根據(jù)每日測(cè)定數(shù)據(jù)和耗水量，定時(shí)定量澆水，使之維持在設(shè)定的土壤水分波動(dòng)范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)處理時(shí)間為20、30 和40 d，每個(gè)處理組設(shè)3 個(gè)生物學(xué)平行實(shí)驗(yàn)。不同的干旱處理結(jié)束之后，皆對(duì)盆栽進(jìn)行正常的水分管理，使之恢復(fù)樹勢(shì)。

1.3 干旱處理結(jié)束后對(duì)溫州蜜柑花芽形態(tài)分化、開花及坐果的追蹤

2020 年花芽形態(tài)學(xué)觀察從現(xiàn)蕾期持續(xù)到盛花期結(jié)束，并統(tǒng)計(jì)坐果率。

1.4 石蠟切片的制作

經(jīng)甲醛-乙酸-乙醇（formaldehyde-acetic acidethanol, FAA）固定之后的腋芽用于植物切片的制作[11]，染色液為愛氏蘇木精染液，切片完成后直接脫蠟、封片，最后用BX43顯微攝影機(jī)（日本OLYMPUS株式會(huì)社）進(jìn)行觀察攝影。

1.5 溫州蜜柑生理指標(biāo)的檢測(cè)

葉綠素a和葉綠素b的含量用分光光度法測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為645和663 nm，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式可計(jì)算得葉綠素a和葉綠素b以及總?cè)~綠素含量[12]；可溶性糖含量的測(cè)定采用蒽酮法[13]，檢測(cè)波長(zhǎng)為625 nm；可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉（bicinchoninic acid hydrate disodium salt,BCA）法[14]，檢測(cè)波長(zhǎng)為562 nm。以上檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自江蘇科銘生物技術(shù)有限公司。

1.6 溫州蜜柑FT 及AP1 基因轉(zhuǎn)錄水平定量分析

以NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上登錄的柑橘屬甜橙（Citrus sinensis）、溫州蜜柑、枳（Poncirus trifoliata）的同源cDNA 為模板，結(jié)合甜橙基因組數(shù)據(jù)庫(kù)序列信息克隆FT和AP1基因的保守區(qū)域序列，序列信息見附圖1（http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2020.12.251）。再用Premier Primer 軟件設(shè)計(jì)特異性定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）引物，引物序列信息為：Actin-F，TTCTTTCCTTGTATGCGAGTG；Actin-R，ATAGTCAAGAGCGATGTAAGC。FT-F，CGGCAACTTGGAAGGCAGAC；FT-R，GGAGGT CCCAGATTGTAAAG。AP1-F，TTTCTACTTCCA CAGCCACCTC；AP1-R，CAAAGCATCCAAGGCT ACAC。RNA的提取采用TransZol Up Plus RNA試劑盒，模板反轉(zhuǎn)錄采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒進(jìn)行，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）檢測(cè)試劑盒Perfect Start Green qPCR SuperMix 進(jìn)行定量檢測(cè)，以上試劑盒均購(gòu)自北京全氏金生物技術(shù)有限公司；選用β-actin作為內(nèi)參基因；目的基因的相對(duì)表達(dá)水平用2－ΔΔCT的方法進(jìn)行分析[15]。qRT-PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，39 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后于65～95 ℃之間做熔解曲線分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2016 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，利用GraphPad Prism 8.0.2 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤水分的維持

干旱期間土壤水分記錄如圖1 所示。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，對(duì)照組保持設(shè)定水分39 d，輕度干旱組保持設(shè)定水分36 d，中度干旱組保持設(shè)定水分38 d，重度干旱組保持設(shè)定水分39 d，基本滿足土壤干旱設(shè)定條件。

圖1 控水處理期間盆栽土壤絕對(duì)含水量Fig.1 Soil moisture of pot plants during the period of controlling the watering

2.2 干旱脅迫對(duì)溫州蜜柑花芽形態(tài)分化的影響

柑橘花芽形態(tài)分化時(shí)期分為5個(gè)過程：初期、萼片期（S期）、花瓣期（P期）、雄蕊期和雌蕊期（ST期）。對(duì)不同處理組間腋芽切片顯微觀察發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫30 d組形態(tài)分化較其他干旱脅迫時(shí)間更早，因此，本文只展示干旱脅迫30 d 處理組。如圖2 所示，輕度干旱和重度干旱30 d 的腋芽處于花芽分化初期狀態(tài)，而中度干旱組植株的萼片和花瓣原基顯現(xiàn)。繼續(xù)追蹤植株花芽分化情況，2019年4月3日中度干旱脅迫30 d處理組最先露白，花苞萌發(fā)且開放最早（圖3），花期相比CK組提前9 d，進(jìn)一步直觀證實(shí)中度干旱脅迫30 d處理最有利于溫州蜜柑花芽分化。

圖2 不同程度干旱脅迫30 d組溫州蜜柑花芽分化的形態(tài)特征Fig.2 Flower bud differentiation’s morphological characteristics of the Satsuma mandarin in different degrees of drought stress for 30 d group

圖3 不同程度干旱脅迫30 d組與CK組的溫州蜜柑花序發(fā)育特征Fig.3 Inflorescence developmental characteristics of the Satsuma mandarin in different degrees of drought stress for 30 d and CK groups

2.3 干旱脅迫對(duì)溫州蜜柑花枝類型和坐果率的影響

對(duì)不同程度干旱脅迫30 d 的溫州蜜柑植株在盛花期的花枝類型和二次生理落果后的坐果率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖4所示：干旱處理后溫州蜜柑有葉花枝的比例有所增加，坐果率稍微下降。

圖4 不同程度干旱脅迫30 d組與CK組溫州蜜柑花枝和坐果率的統(tǒng)計(jì)Fig.4 Statistics of flower branches and fruit setting rates of the Satsuma mandarin in different degrees of drought stress for 30 d and CK groups

2.4 干旱脅迫對(duì)溫州蜜柑莖和葉片生理參數(shù)的影響

2.4.1 干旱脅迫對(duì)溫州蜜柑莖和葉片葉綠素含量的影響

隨著干旱脅迫強(qiáng)度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，溫州蜜柑莖和葉的葉綠素含量變化如圖5 所示。其中：輕度和中度干旱脅迫20 d組植株莖中葉綠素a的含量與CK 相比顯著下降，其他組葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量未表現(xiàn)出顯著變化（圖5A1～A3）；所有重度干旱處理組葉片中葉綠素a 含量與CK 相比均有顯著升高，而葉綠素b和總?cè)~綠素含量與CK相比無顯著性差異（圖5B1～B3）。葉綠素a/b的比值可以反映捕光復(fù)合體Ⅱ（light harvesting complexⅡ,LHCⅡ）在所有含葉綠素結(jié)構(gòu)中所占的比值，其值升高表明LHCⅡ含量減少。與對(duì)照組相比，輕度和中度干旱脅迫20 d，莖中葉綠素a/b的比值明顯下降，說明莖中LHCⅡ的占比有所增加，且隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，處理組葉綠素a/b 的值與CK 組持平，無顯著性差異（圖5A4）；葉片中葉綠素a/b的比值在干旱脅迫20 和30 d 組都較CK 組有不同程度的上升，葉片中LHCⅡ的占比減少，說明葉片中葉綠素結(jié)構(gòu)較莖更易受干旱脅迫的破壞（圖5B4）。

圖5 不同程度干旱脅迫下溫州蜜柑莖（A1～A4）和葉片（B1～B4）葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素的含量以及葉綠素a/b的比值Fig.5 Chlorophyll a,chlorophyll b and total chlorophyll contents and ratio of chlorophyll a/b in stems(A1-A4)and leaves(B1-B4)of the Satsuma mandarin under different drought stress treatments

2.4.2 干旱脅迫對(duì)溫州蜜柑可溶性糖與可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

干旱脅迫期間，葉片中淀粉水解為單糖，可溶性糖的增加有利于植物抵抗逆境。莖中可溶性糖含量隨著干旱強(qiáng)度和時(shí)間的積累有升高趨勢(shì)，重度干旱處理組與其他處理組相比差異顯著（圖6A）；葉片中可溶性糖含量隨著干旱強(qiáng)度和時(shí)間的積累而增加，但相對(duì)于CK組，稍有下降（圖6B）。在干旱脅迫期間，蛋白質(zhì)合成受阻，分解過程加強(qiáng)，莖中可溶性蛋白質(zhì)含量為重度干旱脅迫40 d組比CK組顯著升高（圖6C）；葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量變化沒有表現(xiàn)出顯著性差異（圖6D）。

圖6 不同程度干旱脅迫下溫州蜜柑莖和葉片可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)的含量Fig.6 Contents of soluble sugar and soluble protein in stems and leaves of the Satsuma mandarin under different drought stress treatments

2.5 干旱脅迫對(duì)溫州蜜柑成花相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

NISHIKAWA 等[7-8]在溫州蜜柑體內(nèi)克隆出了“成花素”基因FT的3 個(gè)轉(zhuǎn)錄本，并證實(shí)FT基因的表達(dá)量可以反映柑橘花芽分化進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了不同干旱脅迫下溫州蜜柑莖和葉片中FT基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示：不同干旱條件下莖中FT的表達(dá)量與CK組相比有不同程度上升（圖7A），其中在30 d 處理組中，隨著干旱強(qiáng)度增加，植株莖中FT的表達(dá)量逐步上升，且皆達(dá)到顯著差異水平；葉片中FT的表達(dá)量隨著干旱程度和處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升，處理30 和40 d 組均能夠明顯誘導(dǎo)FT基因的表達(dá)加強(qiáng)，與CK 組相比表達(dá)倍數(shù)差異在2～12之間（圖7B）。但總的來說，植株干旱處理30 d 后，莖中FT基因的表達(dá)量比葉片中高2～3 倍。PILLITTERI 等[9]報(bào)道甜橙在開花誘導(dǎo)末期AP1轉(zhuǎn)錄水平增加明顯，并認(rèn)為AP1參與了開花器官的發(fā)育。對(duì)干旱處理之后溫州蜜柑莖和葉片AP1基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)干旱30 d溫州蜜柑莖和葉片中AP1基因的表達(dá)量明顯高于其他處理組（圖7C～D）。

圖7 不同程度干旱脅迫下溫州蜜柑莖（A、C）和葉片（B、D）FT和AP1基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression levels of FT and AP1 in stems(A and C)and leaves(B and D)of the Satsuma mandarin under different drought stress treatments

3 討論

3.1 干旱脅迫對(duì)溫州蜜柑成花生理的影響

石蠟切片顯微觀察發(fā)現(xiàn)，中度干旱脅迫30 d的花芽形態(tài)分化最早，開放最早，這一結(jié)果與大量研究表明的適度干旱促進(jìn)柑橘花芽生理分化提前的結(jié)果[3]一致。對(duì)有葉花枝統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，中度干旱脅迫30 d組有葉花枝數(shù)比CK組有一定程度的增加，這一結(jié)果與暗柳橙在適度干旱條件下有葉花枝增多的情況相吻合[16]。干旱處理組坐果率沒有顯著下降，仍在溫州蜜柑正常栽培的坐果率范圍內(nèi)。這可能與溫州蜜柑是栽培適應(yīng)性較強(qiáng)的品種有關(guān)，同時(shí)也說明中度干旱（土壤含水量8%～10%）脅迫30 d是一個(gè)促進(jìn)溫州蜜柑花芽提前分化較優(yōu)的處理手段。

3.2 干旱脅迫對(duì)溫州蜜柑樹勢(shì)生理的影響

在不同土壤水分條件下對(duì)植株進(jìn)行干旱脅迫，發(fā)現(xiàn)隨著干旱脅迫強(qiáng)度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，溫州蜜柑莖中葉綠素a 含量與CK 相比都有不同程度的下降。莖是水分和營(yíng)養(yǎng)素的運(yùn)輸器官，對(duì)水分缺失更為敏感，因而莖中葉綠素含量變化較大；葉片葉綠素a含量與CK相比呈上升趨勢(shì)，有可能因?yàn)橹仓暝诟珊禇l件下對(duì)水分的利用更充分[17]。肖玉明等[18]以土壤最大持水量40%對(duì)溫州蜜柑進(jìn)行水分脅迫實(shí)驗(yàn)，處理結(jié)果顯示，在10～40 d之間，隨著時(shí)間的積累，溫州蜜柑葉片葉綠素含量升高，40 d以后葉綠素各成分含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這也說明干旱處理時(shí)間不宜超過40 d，否則對(duì)樹勢(shì)和葉片有較強(qiáng)傷害。葉綠素a/b 的比值在一定程度上與捕光復(fù)合體（LHCⅡ）含量成反比。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比各處理組莖中葉綠素a/b 的比值在干旱早期上升，并最終維持在1.4 左右的水平，與CK 組相當(dāng)，而在不同干旱條件下葉片葉綠素a/b的比值在干旱早中期皆高于對(duì)照組，后期穩(wěn)定于2.0 左右。這說明植株葉片捕光復(fù)合體在減少，通過減少色素和捕光復(fù)合體的含量來降低葉片對(duì)光能的捕獲，降低光合機(jī)構(gòu)受光氧化破壞的風(fēng)險(xiǎn)[19]。由此推斷，干旱脅迫30 d 對(duì)溫州蜜柑的光合生理不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重負(fù)面影響?？扇苄蕴呛涂扇苄缘鞍踪|(zhì)含量上升，能增加越冬植株碳水化合物的積累，利于樹勢(shì)的維持，從而有助于植株花芽分化和滿足翌年植株開花對(duì)養(yǎng)分的需求。溫州蜜柑經(jīng)干旱處理后莖中可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量隨著干旱時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，這一結(jié)論與大量干旱抗性生理研究報(bào)道的結(jié)果[20-21]一致。葉片中可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量在干旱初期表現(xiàn)為不同程度的下降，可能是因?yàn)槿~片作為光合器官，且所受的蒸騰拉力較強(qiáng)，葉片變化更為敏銳，但隨著干旱處理時(shí)間延長(zhǎng)和強(qiáng)度增加，植株對(duì)干旱脅迫表現(xiàn)出一定的適應(yīng)性，葉片可以通過內(nèi)部生理機(jī)制調(diào)節(jié)可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量，以維持中長(zhǎng)期干旱條件下的生命活動(dòng)。總的來說，除了重度干旱條件下莖中葉綠素含量出現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)外，輕度和中度干旱處理對(duì)植株的生理代謝并未造成嚴(yán)重影響，植株能夠通過抗逆調(diào)節(jié)機(jī)制充分應(yīng)對(duì)。

3.3 成花相關(guān)基因響應(yīng)干旱對(duì)花芽的誘導(dǎo)

干旱脅迫可誘導(dǎo)柑橘花芽生理分化提前，成花基因FT和AP1轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量增加。FT的3 條不同轉(zhuǎn)錄本保守區(qū)域高度一致[7]，檢測(cè)FT相對(duì)表達(dá)量的總量顯示干旱脅迫30 d組莖中FT的表達(dá)量最高，這一結(jié)果與前人建議以柑橘莖中FT基因相對(duì)表達(dá)量作為衡量花芽分化程度的結(jié)論[8]一致。AP1是植物花芽分生組織建立的重要基因[9]，中度干旱脅迫30 d 時(shí)其表達(dá)量最高，表明該環(huán)境條件最有利于溫州蜜柑花芽分生組織的建立，從分子水平上進(jìn)一步驗(yàn)證了中度干旱脅迫30 d 是促進(jìn)溫州蜜柑植株成花的合理選擇。

4 結(jié)論

本研究綜合比較了3個(gè)不同干旱脅迫強(qiáng)度與時(shí)間的溫州蜜柑處理組，發(fā)現(xiàn)中度干旱（土壤含水量8%～10%）30 d處理不會(huì)對(duì)植株樹勢(shì)造成不可逆的傷害，且早花現(xiàn)象最明顯；基因表達(dá)分析也表明莖中“成花素”FT相對(duì)表達(dá)量處于較高水平，花芽分生組織特有基因AP1相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值，說明中度干旱脅迫30 d對(duì)溫州蜜柑花芽分生組織的形成具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)效應(yīng)。這一結(jié)果對(duì)溫州蜜柑設(shè)施栽培生產(chǎn)中應(yīng)用控水調(diào)節(jié)開花具有較強(qiáng)的指導(dǎo)意義。