唐標，郝運，林家輝，王靜鴿，吉小鳳，錢鳴蓉，楊華*

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室，杭州 310021；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，杭州 310021；3.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，杭州 310018；4.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016）

大腸埃希菌（Escherichia coli）[1]和腸球菌（Enterococcus）[2-3]是動物源和食品源最常見的2 種細菌，不僅是引起尿路感染、菌血癥等多種細菌性感染疾病的重要條件致病菌，也分別是革蘭氏陰性菌和陽性菌的耐藥性水平指示菌[4-5]。近年來，抗生素因在細菌性疾病的預(yù)防和治療方面作用突出而被大量使用，導(dǎo)致動物源細菌耐藥性問題日益嚴重[6]。耐藥菌可以通過養(yǎng)殖人員的動物飼養(yǎng)過程或通過食物鏈直接傳播給人，也可以通過污染土壤、水源等環(huán)境間接傳播給人，這使得細菌耐藥性問題嚴重威脅著公共衛(wèi)生安全[7]。除此之外，大腸埃希菌和腸球菌是重要的耐藥基因儲存庫[8-9]，可通過攜帶耐藥基因的質(zhì)粒和可移動遺傳元件的轉(zhuǎn)移進行水平傳播[10-11]，導(dǎo)致細菌耐藥率不斷增加。盡管我國開展了動物源細菌耐藥性監(jiān)測[12]，但是僅在省級層面從個別養(yǎng)殖場采集了代表性菌株，對于反映市級水平的細菌耐藥性水平研究仍存在空缺。

本研究對浙江省金華和臺州2市各7個畜禽養(yǎng)殖場的動物進行肛拭子采樣，通過對大腸埃希菌和腸球菌分離培養(yǎng)后再進行藥物敏感性試驗，獲得了2 市的細菌耐藥性水平并進行了比較，旨在為動物源細菌耐藥性監(jiān)測和控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2020年5月分別從浙江省臺州市7個養(yǎng)殖場（2個肉雞場、5個規(guī)模豬場）采集健康動物的肛拭子樣品140份，從浙江省金華市7個養(yǎng)殖場（2個肉雞場、5 個規(guī)模豬場）采集健康動物的肛拭子樣品144 份。樣品采集后置于低溫（2～8 ℃）樣品箱中，并在當日運回實驗室進行大腸埃希菌和腸球菌分離前處理工作。

1.2 主要試劑

LB（Luria-Bertani）瓊脂培養(yǎng)基、緩沖蛋白胨水（buffered peptone water, BPW）、伊紅美蘭（eosin methylene blue,EMB）瓊脂培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；腸球菌顯色培養(yǎng)基購自山東省青島海博生物技術(shù)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；GelRed核酸染料、DL5000 分子標志物購自杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司；藥敏檢測板購自上海星佰生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大腸埃希菌和腸球菌的分離培養(yǎng)

將肛拭子接種于已滅菌的BPW 溶液中，在37 ℃條件下增菌12 h，用接種環(huán)取混濁的菌液分別劃線于EMB 平板和腸球菌顯色平板上，并置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h；從2 種選擇性培養(yǎng)基上挑取可疑單菌落，再次劃線于相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后挑取可疑菌落劃線于LB 平板上。在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h，再挑取單菌落純化培養(yǎng)一次，最后刮取適當LB 平板上的菌落保存于裝有20%丙三醇的凍存管中，于－80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 細菌鑒定

將保存的細菌接種于LB 培養(yǎng)基上，并在37 ℃條件下培養(yǎng)16～24 h。使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDITOF-MS）鑒定大腸埃希菌和腸球菌。先使用無菌牙簽挑取單個菌落于靶板孔中，并涂抹均勻，隨后在孔里滴加1 μL 70%甲酸，室溫下靜置至風(fēng)干，再滴加1 μLα-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA），室溫條件下靜置直至完全干燥，最后使用布魯克高通量生物鑒定系統(tǒng)（Autoflex Speed）儀器中的MALDI Biotyper RTC 軟件[13]進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集與分析。將鑒定的結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的細菌圖譜進行比較，得出的分數(shù)若大于2.0，代表鑒定結(jié)果可靠。

1.3.3 藥物敏感性試驗

將大腸埃希菌和腸球菌分別接種在LB瓊脂培養(yǎng)基上進行純培養(yǎng)，參照美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）的M100-S25文件[14]中推薦的微量肉湯稀釋法，使用革蘭氏陰性需氧菌藥敏檢測板測定大腸埃希菌對16種常見抗生素的藥敏表型[15]，包括氨芐西林（AMP）、奧格門汀（A/C）、慶大霉素（GEM）、大觀霉素（SPT）、四環(huán)素（TET）、氟苯尼考（FFC）、磺胺異噁唑（SF）、復(fù)方新諾明（SXT）、頭孢噻呋（CEF）、頭孢他啶（CAZ）、恩諾沙星（ENR）、氧氟沙星（OFL）、美羅培南（MEM）、安普霉素（APR）、黏菌素（CL）、乙酰甲喹（MEQ）。使用革蘭氏陽性需氧菌藥敏檢測板測定腸球菌對27 種抗生素的藥物敏感性，包括青霉素（PEN）、奧格門?。ˋ/C）、紅霉素（ERY）、克林霉素（CLI）、恩諾沙星（ENR）、氧氟沙星（OFL）、頭孢噻呋（CEF）、頭孢西丁（CFX）、磺胺異噁唑（SF）、苯唑西林（OXA）、萬古霉素（VAN）、復(fù)方新諾明（SXT）、多西環(huán)素（DOX）、氟苯尼考（FFC）、泰妙菌素（TIA）、替米考星（TIL）、慶大霉素（GEN）、利奈唑胺（LZD）、桿菌肽（BAC）、四環(huán)素（TET）、吉他霉素（KIT）、黃霉素（FLA）、恩拉霉素（EDC）、喹烯酮（QCT）、那西肽（NOS）、阿維拉霉素（AVI）、弗吉尼亞霉素（VGM），其中后9種抗生素主要用于促生長。耐藥折點參考CLSI（M100-S26、M45-A2、VET01-A4）制定的值。另外，大腸埃希菌對安普霉素和乙酰甲喹，腸球菌對克林霉素、氧氟沙星、頭孢噻呋、頭孢西丁、苯唑西林、復(fù)方新諾明、慶大霉素、桿菌肽、四環(huán)素、吉他霉素、黃霉素、恩拉霉素、喹烯酮、那西肽、阿維拉霉素、弗吉尼亞霉素等16種抗生素沒有定義耐藥折點。對于沒有折點標準的，通過藥物最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration,MIC）的分布圖展示比較，并對計算出來的MIC50和MIC90值進行比較。菌株ATCC 25922和ATCC 29212分別作為大腸埃希菌和腸球菌的質(zhì)控菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸埃希菌和腸球菌的分離結(jié)果

從所有284份肛拭子樣品中均分離出了大腸埃希菌和腸球菌，并通過飛行質(zhì)譜鑒定方法對分離的大腸埃希菌和腸球菌進行了確認。所有的預(yù)測分值大于2.0，代表能夠可靠地鑒定到種。所有分離的細菌經(jīng)過飛行時間質(zhì)譜采集的圖譜與質(zhì)控菌株圖譜比較后發(fā)現(xiàn)一致性較高，結(jié)果可靠（圖1）。

圖1 質(zhì)控菌株的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜鑒定圖譜Fig.1 Identification spectra of quality control strains by MALDI-TOF-MS

2.2 大腸埃希菌的耐藥情況

對金華市144 株大腸埃希菌進行藥敏試驗，結(jié)果如圖2 所示，其中安普霉素和乙酰甲喹沒有定義折點，不統(tǒng)計耐藥率。大腸埃希菌對14 種抗生素的耐藥率從大到小為四環(huán)素（87.5%）＞磺胺異噁唑（81.2%）＞復(fù)方新諾明（69.4%）＞氨芐西林（66.7%）＞氟苯尼考（56.9%）＞大觀霉素（52.8%）＞慶大霉素（19.4%）＞恩諾沙星（13.9%）＞頭孢噻呋（8.3%）=氧氟沙星（8.3%）＞奧格門?。?.3%）＞頭孢他啶（2.1%）＞美羅培南（0.7%）＞黏菌素（0%）。檢測到1 株美羅培南耐藥菌，未檢測到對黏菌素耐藥的大腸埃希菌（圖2）。從MIC分布來看，144株大腸埃希菌的分布較廣，其中磺胺異噁唑的MIC有74%（104/144）高于512，表現(xiàn)出較高的耐藥水平，頭孢他啶、美羅培南的MIC 分布在較低水平，黏菌素的MIC在小于2的范圍內(nèi)呈正態(tài)分布（圖3）。

圖2 金華市和臺州市大腸埃希菌的耐藥率比較Fig.2 Comparison of antimicrobial resistance rates of E.coli isolated from Jinhua City and Taizhou City

臺州市140 株大腸埃希菌對14 種抗生素的耐藥率從大到小排列為磺胺異噁唑（97.1%）＞四環(huán)素（86.4%）＞氨芐西林（81.4%）＞氟苯尼考（80.7%）＞復(fù)方新諾明（79.3%）＞大觀霉素（65.7%）＞恩諾沙星（35.7%）＞氧氟沙星（29.3%）＞慶大霉素（27.9%）＞頭孢噻呋（17.1%）＞奧格門?。?.4%）＞頭孢他啶（3.6%）＞美羅培南（0%）=黏菌素（0%）。美羅培南、黏菌素的耐藥菌均未被檢出（圖2）。臺州市大腸埃希菌對16 種抗生素的耐藥性和MIC 分布情況與金華市相似，但是相比金華市顯示出了更高的耐藥水平。臺州市大腸埃希菌對14種抗生素中的11種耐藥率比金華市高，金華市大腸埃希菌僅對四環(huán)素和美羅培南的耐藥率稍高于臺州市。另外，從安普霉素和乙酰甲喹的MIC分布趨勢來看，臺州市的耐藥水平稍高于金華市，其中從臺州市分離的大腸埃希菌對安普霉素的MIC90是64，大于金華市的數(shù)值16（圖3）。

圖3 金華市和臺州市16種抗生素對大腸埃希菌的MIC分布Fig.3 MIC distributions of 16 antibiotics to E.coli isolated from Jinhua City and Taizhou City

2.3 腸球菌的耐藥性情況

對金華市144 株腸球菌做了27 種抗生素的藥敏檢測，其中克林霉素、氧氟沙星、頭孢噻呋、頭孢西丁、苯唑西林、復(fù)方新諾明、慶大霉素、桿菌肽、四環(huán)素、吉他霉素、黃霉素、恩拉霉素、喹烯酮、那西肽、阿維拉霉素、弗吉尼亞霉素等16 種抗生素沒有定義腸球菌的耐藥折點，不做耐藥率比較。腸球菌對其他11 種藥物的耐藥率從大到小排列為磺胺異噁唑（100.0%）＞泰妙菌素（98.6%）＞替米考星（97.9%）＞紅霉素（83.3%）＞氟苯尼考（69.4%）＞利奈唑胺（34.0%）＞多西環(huán)素（27.1%）＞恩諾沙星（22.9%）＞萬古霉素（0.0%）=青霉素（0.0%）=奧格門?。?.0%）（圖4）。從MIC 來看，多數(shù)抗生素的MIC分布范圍較大，且部分抗生素的MIC已超出檢測范圍，尤其是磺胺異噁唑和喹烯酮；紅霉素、克林霉素、苯唑西林、替米考星等抗生素的MIC 也有超過60%的菌株大于檢測范圍（圖5），從MIC 的分布更能反映出腸球菌的高水平耐藥性。

圖4 金華市和臺州市腸球菌的耐藥率比較Fig.4 Comparison of antimicrobial resistance rates of Enterococcus isolated from Jinhua City and Taizhou City

臺州市腸球菌的耐藥率從大到小為磺胺異噁唑（100.0%）＞泰妙菌素（98.6%）＞替米考星（94.3%）＞紅霉素（91.4%）＞氟苯尼考（78.6%）＞多西環(huán)素（64.3%）＞利奈唑胺（53.6%）＞恩諾沙星（36.4%）＞青霉素（0.7%）＞萬古霉素（0.0%）=奧格門汀（0.0%）?；前樊悋f唑和泰妙菌素依然是耐藥水平最高的2種抗生素，除此之外，還發(fā)現(xiàn)了1株青霉素耐藥菌株。相較于金華市，臺州市腸球菌對多西環(huán)素、利奈唑胺和恩諾沙星的耐藥率明顯大于金華市。此次試驗中沒有發(fā)現(xiàn)奧格門汀和萬古霉素耐藥腸球菌（圖4）。臺州市腸球菌對抗生素的MIC分布與金華市比較接近，MIC 的分布都比較廣泛。在耐藥折點及以下，MIC呈正態(tài)分布，比如青霉素、奧格門汀、恩諾沙星、氧氟沙星和萬古霉素。在相同的耐藥率下，通過MIC 的分布可以看出，臺州市的腸球菌對泰妙菌素耐藥水平高。對于沒有折點的抗生素，通過MIC的分布趨勢和MIC50/MIC90可以比較耐藥性水平。臺州市的腸球菌對阿維拉霉素、弗吉尼亞霉素、氧氟沙星、頭孢噻呋、頭孢西丁和慶大霉素耐藥水平高于金華市，而金華市的腸球菌對恩拉霉素的耐藥水平略超過臺州市（圖5）。另外，即使所有菌株對萬古霉素均敏感，通過比較MIC50也能發(fā)現(xiàn)，來源于金華市的菌株對萬古霉素的耐藥水平略高于臺州市。

圖5 金華市和臺州市27種抗生素對腸球菌的MIC分布Fig.5 MIC distributions of 27 antibiotics for Enterococcus isolated from Jinhua City and Taizhou City

2.4 多重耐藥性分析

對金華市大腸埃希菌的耐藥譜分析發(fā)現(xiàn)，有3株大腸埃希菌對11 種抗生素同時耐藥，僅有10 個菌株對全部抗生素敏感，耐藥譜型共有40種（表1）。其中AMP-SPT-TET-FFC-SF-SXT 耐藥譜型占比最高（16.0%），其次是AMP-TET-SF-SXT（7.6%）和AMP-GEM-SPT-TET-FFC-SF-SXT（5.6%）。另外，對臺州分離的大腸埃希菌進行分析發(fā)現(xiàn)，耐藥譜最廣的3 種譜型可對11 種抗生素耐藥，分別是AMPA/C-GEM-SPT-TET-FFC-SF-SXT-CAZ-ENROFL（0.7%）、AMP-A/C-GEM-SPT-TET-FFC-SFSXT-CEF-ENR-OFL（0.7%）、AMP-GEM-SPT-TETFFC-SF-SXT-CEF-CAZ-ENR-OFL（0.7%）。個數(shù)占比最高的耐藥譜型分別是AMP-SPT-TET-FFCSF-SXT（23.6%）、SF（7.1%）和AMP-SPT-TET-FFCSF-SXT-ENR-OFL（6.4%）（表2）。2市的大腸埃希菌多重耐藥情況較為普遍，但是臺州市的耐藥譜型更多（46 個），且未發(fā)現(xiàn)敏感菌株。77.8%金華市來源的大腸埃希菌抗3 類以上抗生素，而臺州市則有84.3%的大腸埃希菌抗3 類以上抗生素。從耐藥譜中可以發(fā)現(xiàn)，氟喹諾酮類藥物恩諾沙星和氧氟沙星的耐藥相關(guān)性較高，表現(xiàn)出同種藥物的交叉耐藥性。

表1 金華市大腸埃希菌的耐藥譜Table 1 Antimicrobial resistance patterns of E.coli isolated from Jinhua City

表2 臺州市大腸埃希菌的耐藥譜Table 2 Antimicrobial resistance patterns of E.coli isolated from Taizhou City

金華市來源的腸球菌共有14種耐藥表型，其中ERY-SF-TIA-TIL 耐藥表型占比最高（31.0%），其次是SF-TIA-TIL 耐藥表型（12.5%）。金華市有9株腸球菌最多同時對7 種藥物耐藥，耐藥譜型為ERY-ENR-SF-DOX-TIA-TIL-LZD（表3）。而臺州市的腸球菌共有17種耐藥譜型，其中ERY-ENRSF-DOX-TIA-TIL-LZD（19.3%）和ERY-SF-DOXTIA-TIL-LZD（19.3%）耐藥譜型個數(shù)占比最高，其次是ERY-SF-DOX-TIA-TIL耐藥譜型（18.6%）（表4）。此次統(tǒng)計腸球菌具有耐藥折點的抗生素共11個，相比大腸埃希菌耐藥譜型較少，但是2市的腸球菌多重耐藥率均達到97%以上，明顯高于大腸埃希菌。

表3 金華市腸球菌的耐藥譜Table 3 Antimicrobial resistance patterns of Enterococcus isolated from Jinhua City

表4 臺州市腸球菌的耐藥譜Table 4 Antimicrobial resistance patterns of Enterococcus isolated from Taizhou City

3 討論與結(jié)論

大腸埃希菌和腸球菌是條件致病菌，一般情況下不致病，但是可以作為耐藥基因的“儲存庫”，是公共衛(wèi)生安全的潛在威脅。本研究從金華市和臺州市的畜禽肛拭子樣本中共分離鑒定了大腸埃希菌和腸球菌各284株，二者的分離率均為100%。據(jù)報道，MALDI-TOF-MS 對細菌的鑒定已成為臨床上新興的、便捷的、準確的方法[13,16]，本研究中對動物源細菌的鑒定采用這一方法是在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中應(yīng)用的有益嘗試，可提高檢測效率。從藥敏檢測結(jié)果看，2 種細菌耐藥水平較高，耐藥譜型較多，且多重耐藥情況嚴重。其中大腸埃希菌最多對11 種抗生素具有耐藥性，腸球菌最多對7 種抗生素具有耐藥性。2市分離的大腸埃希菌均對磺胺異噁唑和四環(huán)素的耐藥率最高，其次是復(fù)方新諾明、氨芐西林和氟苯尼考。腸球菌耐藥率最高的是磺胺異噁唑和泰妙菌素，其次是替米考星和紅霉素。據(jù)報道，中國畜禽養(yǎng)殖中使用量最多的抗生素是四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、酰胺醇類、磺胺及增效劑類等[17-18]，本試驗結(jié)果印證了動物源細菌的耐藥性水平與抗生素使用量呈正相關(guān)的結(jié)論。

在畜禽養(yǎng)殖中禁止使用的藥物，試驗結(jié)果則顯示出對其極低的耐藥水平。美羅培南是一種用于臨床治療的碳青霉烯類抗生素，對產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和AmpC 酶的腸桿菌都具有優(yōu)異的抑制作用[19]。本研究分離到1 株美羅培南耐藥菌株，需要進一步試驗研究其耐藥基因類型及傳播機制。黏菌素（多黏菌素E）屬于多黏菌素類藥物，是治療碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌性疾病的有效抗生素。過去由于動物源細菌對黏菌素的耐藥率持續(xù)上升[20]，農(nóng)業(yè)部于2017年禁止將多黏菌素類藥物用于促生長使用，隨后細菌對其耐藥率不斷下降[21]。FANG等于2019年從浙江省106家屠宰場的豬肉樣本中未分離到黏菌素耐藥大腸埃希菌[22]，而此次試驗也未分離到黏菌素耐藥菌株，符合耐藥率下降預(yù)期。這說明對獸用抗生素的管控，是控制細菌耐藥性的有效方法[23]。

此次試驗對2 市的動物源細菌耐藥性進行監(jiān)測，是在同一時間對相同養(yǎng)殖類型和數(shù)量的養(yǎng)殖場進行采樣，并使用統(tǒng)一的藥物敏感性檢測方法，是對市（縣）級動物源細菌耐藥水平進行評估和差異比較的有益嘗試。本研究從耐藥率、MIC 分布、耐藥譜型等方面進行了細菌耐藥性水平比較，并發(fā)現(xiàn)臺州市的大腸埃希菌和腸球菌分離株菌各方面反映的耐藥水平均高于金華市。在此次試驗中，將MIC分布情況進行量化分析，在沒有耐藥折點國際標準的情況下，可為耐藥性水平的評估提供參考，相比耐藥率數(shù)據(jù)更加準確全面；也可為下一步的耐藥折點制定提供依據(jù)。綜上所述，建議政府部門應(yīng)加強獸用抗生素的管控和細菌耐藥水平的監(jiān)測力度，促使養(yǎng)殖戶規(guī)范使用抗生素，使細菌耐藥性問題得到控制。