洪敏，賀明陽,3*，王日葵，周煉，王晶，馮雨

（1.西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712；3.中國科學(xué)院華南植物園植物資源保護(hù)與可持續(xù)利用重點實驗室，廣州 510650）

血橙[Citrus sinensis(L.)Osbeck]屬甜橙類，常見的血橙品種有塔羅科（Tarocco）、桑吉耐洛（Sanguinello）和摩洛（Moro）[1-2]。血橙是唯一含花色苷的柑橘，其果皮和果肉呈現(xiàn)獨(dú)特的紅色是由于花青素與糖結(jié)合形成了苷類化合物[3-4]。花色苷屬黃酮類化合物[5]，是血橙中主要的抗氧化活性成分，能夠清除自由基[6]，在治療和預(yù)防心臟病、癌癥、動脈硬化和抗病毒活性方面也具有重要意義[7]，其含量是評價血橙商業(yè)價值的重要指標(biāo)[5]。

花色苷生物合成受溫度、糖、酸等的影響。PANNITTERI 等[2]、CRIFò 等[8]和RAPISARDA 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，4～10 ℃低溫貯藏可促進(jìn)血橙花色苷積累，延長血橙貨架期，且CRIFò等[8]證實了花色苷生物合成與冷調(diào)控有關(guān)?？扇苄蕴呛陀袡C(jī)酸是評價柑橘果實風(fēng)味和整體品質(zhì)的重要指標(biāo)[10]，也是調(diào)控花色苷合成的重要因素。前人研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)可溶性糖處理后，擬南芥[11-12]、西蘭花[13]花色苷含量積累增加，尤其以蔗糖處理的效果最好[11]，它可以特異調(diào)節(jié)糖依賴的花色苷合成上調(diào)[10]。LO PIERO等[14]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)低溫貯藏后血橙檸檬酸含量降低，檸檬酸裂解酶活性增強(qiáng)，而檸檬酸裂解后的反應(yīng)產(chǎn)物可促進(jìn)黃酮的生物合成，該過程因冷藏而被激活。喻最新等[15]發(fā)現(xiàn)，草酸處理可提高血橙采后花色苷和可溶性糖含量，改善果實貯藏品質(zhì)。但有機(jī)酸調(diào)控花色苷合成的研究較少，而對花色苷的輔色和穩(wěn)態(tài)性研究較多[16-17]。目前，對血橙花色苷調(diào)控研究主要集中在低溫，而在室溫條件下血橙花色苷和糖酸含量變化及其相關(guān)代謝基因表達(dá)水平尚不清楚。

柑橘花色苷[18-19]、糖[20-22]、酸[23-24]代謝途徑已明確。莽草酸途徑通過連接糖代謝與次生代謝生成苯丙氨酸，開啟花色苷代謝途徑[25]。苯丙氨酸經(jīng)苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase, PAL）、肉桂酸4-羥化酶（cinnamate 4-hydroxylase, C4H）、4-香豆酸∶輔酶A連接酶（4-coumarate∶coenzyme A ligase, 4CL）、查耳酮合成酶（chalcone synthase,CHS）、查耳酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase,CHI）、黃酮醇3-羥化酶（flavonone 3-hydroxylase, F3H）、類黃酮3′-羥化酶（flavonoid 3′-hydroxylase, F3′H）、類黃酮3′，5′-羥化酶（flavonoid 3′, 5′-hydroxylase,F3′5′H）、二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase, DFR）、花青素合成酶（anthocyanin synthase, ANS）、糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucoseflavonoid 3-O-glucosyltransferase, UFGT）、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferases,GST）等催化合成花色苷[18-19]。黃酮醇合成酶（flavonol synthase,FLS）負(fù)調(diào)節(jié)花色苷合成[18]。柑橘是蔗糖積累型果實，蔗糖代謝是糖積累的重要過程，蔗糖合成酶（sucrose synthase, SS）可逆調(diào)控其合成與分解[21]，并受蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase,SPS）的合成調(diào)控及酸性轉(zhuǎn)化酶（acid invertase,AI）的分解調(diào)控，且催化反應(yīng)不可逆[26]。檸檬酸是柑橘特有的有機(jī)酸，乙酰輔酶A與草酰乙酸在檸檬酸合成酶（citrate synthase,CS）的催化下合成檸檬酸[23]，檸檬酸的分解主要由烏頭酸酶（aconitase,AC）、異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase, IDH）等催化[24]。

塔羅科血橙屬晚熟柑橘[2]，采收時溫度偏高，果實采后呼吸作用比較強(qiáng)烈，且隨著采收期推遲，其耐貯性降低，嚴(yán)重影響物流過程中血橙的商品性[27-28]。由于我國冷鏈物流體系尚不完善，所以本研究選用高效液相色譜（high performance liquid chromatography,HPLC）和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)分析室溫條件下血橙采后花色苷和糖酸含量變化及相關(guān)代謝基因表達(dá)特征，以期為血橙物流和貨架期品質(zhì)保持研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

本研究選用種植于重慶市璧山區(qū)綠躍血橙種植園的塔羅科血橙為試驗材料。采收大小和色澤均勻、無機(jī)械損傷和病蟲害、九成熟的果實，用配置的500 mg/L 咪鮮胺浸泡30 s，撈出后自然風(fēng)干。將處理后的果實置于（20±5）℃室溫條件下貯藏20 d。每次試驗重復(fù)3 次，每次重復(fù)取10 個果實，每隔5 d測定一次相關(guān)指標(biāo)。每次試驗采集血橙果肉樣品，經(jīng)液氮速凍后于－80 ℃冰箱中保存，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901 紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；RE52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；高效液相色譜（HPLC）儀，美國安捷倫公司；H1850R 臺式高速冷凍離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；CFX96TM實時熒光定量PCR儀，美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 總花色苷含量的測定

血橙果肉總花色苷含量的測定參考曹少謙等[3]的pH示差法。每個樣品重復(fù)3次。

1.3.2 有機(jī)酸和可溶性糖的提取與測定

有機(jī)酸和可溶性糖的提取參考ZHANG 等[29]的方法。稱取3 g 研磨后的血橙果肉，加入5 mL 80%冰乙醇，35 ℃水浴浸提20 min 后，在室溫、5 000 r/min 條件下離心5 min，然后取上清液，重復(fù)抽提3次，合并上清液并定容至20 mL。取5 mL提取液，在室溫、5 000 r/min條件下離心5 min，取3 mL上清液在35 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸干，然后用1.5 mL 雙蒸水溶解，最后用直徑13 mm、孔徑0.22 μm 的水膜過濾純化。提取的濾液用于測定可溶性糖和有機(jī)酸含量。HPLC 色譜條件參考喻最新等[5]的方法。每個樣品重復(fù)3次。

總糖為蔗糖、葡萄糖、果糖含量之和，總酸為檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸含量之和。

1.3.3 血橙果肉總RNA 提取及cDNA 合成

血橙果肉總RNA 提取參照天根DP441 型試劑盒的操作說明，然后參照寶生物RR047A 型試劑盒操作說明反轉(zhuǎn)錄成cDNA，－20 ℃保存，備用。

1.3.4 表達(dá)分析

血橙內(nèi)參基因選用EF-1α[8]（GenBank登錄號為XM_015533332），花色苷及糖酸代謝相關(guān)基因引物序列分別參考CARMONA 等[18]和LIU 等[30]的研究。參照寶生物SYBR?Premix ExTaqTMⅡ試劑盒的操作說明，在實時熒光定量PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：10 μL SYBR Green Ⅰ混合物，正向和反向引物各0.8 μL，1.5 μL cDNA 模板，6.9 μL ddH2O。擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，40 個循環(huán)。熔解曲線繪制：95 ℃變性10 s，降溫到65 ℃后開始以0.5 ℃/s 逐步升溫，每5 s 采集一次熒光信號，反應(yīng)至95 ℃時結(jié)束。每個樣品重復(fù)3 次。采用2－ΔΔCT法進(jìn)行相對定量分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用SPSS 20.0進(jìn)行差異顯著性分析和皮爾遜相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 室溫貯藏期間血橙總花色苷含量變化

如圖1所示，室溫貯藏期間果肉總花色苷含量呈上升趨勢。貯藏至第5 天，果實花色苷含量從2.86 mg/L 顯著增加至8.26 mg/L，之后果實花色苷含量緩慢增加，到第20 天時其含量達(dá)到最大，為9.21 mg/L。整個貯藏期間花色苷含量提高了222%。

圖1 室溫貯藏期間血橙總花色苷含量的變化Fig.1 Changes of total anthocyanin content in blood oranges during room temperature storage

2.2 室溫貯藏期間血橙花色苷代謝相關(guān)基因表達(dá)水平變化

如圖2所示：PAL、4CL、CHS、CHI、F3H、F3′5′H、DFR、ANS、UFGT、GST表達(dá)水平基本呈上升趨勢；FLS表達(dá)水平呈下調(diào)趨勢；C4H表達(dá)水平呈波動變化。前人在血橙低溫貯藏過程中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果[15]。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：血橙花色苷含量與PAL、4CL、CHS、CHI、F3H、F3′5′H、DFR、ANS、UFGT、GST表達(dá)水平呈正相關(guān)，且與4CL、CHI、ANS的相關(guān)性顯著，相關(guān)系數(shù)分別為0.691、0.683、0.662；與C4H、FLS表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性不顯著。

圖2 室溫貯藏期間血橙花色苷代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的變化Fig.2 Changes of expression levels of anthocyanin metabolism related genes in blood oranges during room temperature storage

2.3 室溫貯藏期間血橙可溶性糖和有機(jī)酸含量變化

如圖3 所示：貯藏0～15 d，果實總糖、蔗糖、果糖和葡萄糖含量均顯著增加至最大值，分別為76.28、36.43、20.55、19.29 mg/g，分別提高了16.4%、11.9%、23.8%、17.7%。貯藏15～20 d，果實總糖、蔗糖、果糖和葡萄糖含量均顯著降低，分別下降了3.8%、3.8%、3.3%、4.3%。整個貯藏期間，果實總糖、蔗糖、果糖和葡萄糖含量分別提高了12.0%、7.7%、19.7%、12.7%。柑橘中檸檬酸是主要的有機(jī)酸，含量明顯高于微量積累的蘋果酸和抗壞血酸。總酸、檸檬酸和蘋果酸含量呈顯著波動變化?？箟难岷繌?.61 mg/g 顯著降低到0.41 mg/g，隨后顯著增加至0.50 mg/g，這與前人在‘愛媛38號’中的研究結(jié)果[31]類似。

圖3 室溫貯藏期間血橙可溶性糖和有機(jī)酸含量的變化Fig.3 Changes of soluble sugar and organic acid contents in blood oranges during room temperature storage

2.4 室溫貯藏期間血橙糖、酸代謝相關(guān)基因表達(dá)水平變化

如圖4所示：SS1、SS2表達(dá)水平呈先下調(diào)后上調(diào)趨勢；SPS1、SPS2、SPS3、AI表達(dá)水平呈下調(diào)趨勢。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：蔗糖含量與SS1表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.547，與SS2無顯著相關(guān)；與SPS1、SPS2表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為－0.591、－0.573；與SPS3、AI表達(dá)水平呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為－0.893、－0.913。

由圖4可見：CS表達(dá)水平先顯著下降后顯著上升；AC表達(dá)水平先顯著下調(diào)后趨于穩(wěn)定；IDH表達(dá)水平呈波動變化。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：檸檬酸含量與IDH表達(dá)水平呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為－0.661；與CS、AC表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性不顯著。

圖4 室溫貯藏期間血橙糖、酸代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的變化Fig.4 Changes of expression levels of sugar and acid metabolism related genes in blood oranges during room temperature storage

2.5 室溫貯藏期間血橙花色苷積累與糖酸含量的相關(guān)性分析

由表1 可見：室溫貯藏期間血橙花色苷含量與總糖、蔗糖、果糖和葡萄糖含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.688、0.748、0.606、0.687，其中與蔗糖的相關(guān)性最高；與抗壞血酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為－0.852。

表1 皮爾遜相關(guān)系數(shù)Table 1 Pearson correlation coefficients

3 討論

3.1 室溫貯藏期間血橙可溶性糖積累及表達(dá)分析

本研究結(jié)果表明，血橙果實中主要積累蔗糖、果糖和葡萄糖等可溶性糖，在整個貯藏期間果實中蔗糖、果糖和葡萄糖含量比例約為2∶1∶1；龔榮高等[21]在甜橙果實膨大后期也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。室溫貯藏期間果實果糖和葡萄糖含量變化高于蔗糖，表明蔗糖在合成的同時也在分解[26]。此外，果實中可溶性糖含量呈先顯著上升后顯著下降的趨勢。產(chǎn)生該趨勢的原因可能是柑橘中酸類物質(zhì)向糖類轉(zhuǎn)換[32]或是果實衰老進(jìn)程中細(xì)胞壁成分分解使糖積累暫時增加[15]。而貯藏后期糖積累下調(diào)可能是蔗糖降解為葡萄糖和果糖后進(jìn)入糖酵解途徑被消耗或是果肉將能量物質(zhì)運(yùn)輸給果皮所致[32-33]。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，蔗糖含量與SS1表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，與SS2無顯著相關(guān)性，與SPS1、SPS2、SPS3呈顯著負(fù)相關(guān)，認(rèn)為蔗糖合成主要由SS1調(diào)控，而SPS在調(diào)控蔗糖合成方面不起主導(dǎo)作用。蔗糖含量與AI表達(dá)水平呈極顯著負(fù)相關(guān)，表明蔗糖的分解主要由AI調(diào)控；趙智中等[20]在溫州蜜柑中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。綜合分析認(rèn)為，血橙在室溫貯藏期間主要由SS1、AI來調(diào)控蔗糖的合成與分解。劉永忠等[34]也發(fā)現(xiàn)，蔗糖合成酶（SS）和轉(zhuǎn)化酶在柑橘汁胞糖代謝中起重要作用。

3.2 室溫貯藏期間血橙有機(jī)酸積累及表達(dá)分析

血橙在短期室溫貯藏期間總酸、檸檬酸和蘋果酸含量呈顯著波動變化，表明果實中主要有機(jī)酸一直在合成且不斷被分解。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，檸檬酸含量與IDH表達(dá)水平呈極顯著負(fù)相關(guān)，與AC相關(guān)性不顯著，表明檸檬酸的分解主要由IDH發(fā)揮作用。前人研究發(fā)現(xiàn)，椪柑經(jīng)熱處理后檸檬酸含量降低，該過程中IDH表達(dá)量也顯著升高[23]。本研究中檸檬酸含量與CS表達(dá)水平無顯著相關(guān)，這與CHEN等的研究結(jié)果[24]一致。HUSSAIN等[35]也發(fā)現(xiàn)，檸檬酸合成酶（CS）活性提高也不會使檸檬酸積累增加。但也有抑制CS 活性后檸檬酸含量降低的報道[36]。目前，有機(jī)酸的降解產(chǎn)物主要是作為呼吸作用的底物參與三羧酸循環(huán)，從而為細(xì)胞供能，此外，它還是初生代謝物（如氨基酸和脂肪酸）和次生代謝物（與風(fēng)味和香氣有關(guān)）的重要前體物質(zhì)[22,35]，而對其合成機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3.3 室溫貯藏期間血橙花色苷積累及與糖酸含量的相關(guān)性分析

血橙在短期室溫貯藏期間花色苷含量與4CL、CHI、ANS表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，認(rèn)為4CL、CHI、ANS是花色苷合成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，花色苷與總糖、蔗糖、果糖和葡萄糖含量呈顯著正相關(guān)。前人在血橙[5]、黑穗醋栗[37]、楊梅[38]果實生長發(fā)育過程中也發(fā)現(xiàn)，果實花色苷積累與可溶性糖含量顯著相關(guān)，糖為花色苷積累提供物質(zhì)基礎(chǔ)。糖作為花色苷合成的原料，通過糖代謝途徑和信號機(jī)制影響花色苷合成[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，花色苷與抗壞血酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，但抗壞血酸積累微量，其調(diào)控花色苷合成的關(guān)系還需進(jìn)一步驗證。本研究中，貯藏0～5 d血橙花色苷含量快速上升，之后緩慢上升。前人研究表明，糖酵解產(chǎn)生的磷酸烯醇式丙酮酸可通過莽草酸途徑生成花色苷的直接前體物質(zhì)苯丙氨酸[25]。貯藏初期花色苷含量急劇增加可能是可溶性糖含量顯著增加為花色苷合成提供了原料所致。而在貯藏過程中由于果實間空間小、氧氣稀薄，易進(jìn)行無氧呼吸，糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸作為底物開啟乙醇代謝[28,39]，相對抑制了花色苷合成，致使花色苷積累緩慢。王晶等[31]發(fā)現(xiàn)，低溫貯藏期間‘愛媛38號’柑橘果實乙醇、乙醛含量整體呈上升趨勢。后續(xù)可從血橙采后室溫貯藏過程中乙醇、乙醛等異味物質(zhì)積累及乙醇代謝途徑方面進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

短期內(nèi)室溫貯藏塔羅科血橙促進(jìn)了花色苷和可溶性糖的積累，而檸檬酸含量呈波動變化，處于不斷合成與分解狀態(tài)。4CL、CHI、ANS、SS1、AI、IDH在花色苷和糖酸代謝過程中發(fā)揮重要作用。室溫貯藏期間花色苷含量與總糖、蔗糖、果糖和葡萄糖含量呈顯著正相關(guān)，認(rèn)為可溶性糖含量增加是促進(jìn)血橙花色苷積累的重要因素。本研究結(jié)果闡釋了血橙在室溫貯藏期間花色苷和糖酸積累變化及相關(guān)代謝基因表達(dá)特征，可為血橙物流和貨架期品質(zhì)保持研究提供理論依據(jù)。