張 鵬，張 鑫，朱緒輝，李 濤，韓修武

膀胱癌是常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)腫瘤[1]，每年導(dǎo)致全球約15萬(wàn)人死亡[2]，其發(fā)生于尿路上皮細(xì)胞，因此主要發(fā)病類(lèi)型為膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma, BLCA)，占比超過(guò)90%[3]。盡管目前BLCA有多種治療方法，但效果欠佳，預(yù)后較差[2,4-5]，因此迫切需要研發(fā)有效的藥物治療。

RecQ家族主要參與DNA修復(fù)、重組、復(fù)制及轉(zhuǎn)錄等生理學(xué)過(guò)程[6-7]，其中BLM、WRN及RECQL4基因突變與Bloom、Werner和Rothmund-Thomson(RTS)相關(guān)[8-9]。BLM在同源重組修復(fù)、端粒維持和DNA復(fù)制等生理過(guò)程中起作用[10]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，BLM參與端粒的延長(zhǎng)，使用BLM抑制劑能有效抑制端粒延長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或衰老[11]。在前列腺癌中干擾BLM表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，從而減緩疾病進(jìn)程[12]。但目前關(guān)于BLM在膀胱癌中作用的研究較少，本研究在體外以膀胱癌T24細(xì)胞系為研究對(duì)象，探究敲減BLM對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) 人正常膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1(對(duì)照組)、T24細(xì)胞系(膀胱癌細(xì)胞系)均從ATCC購(gòu)買(mǎi)，于本實(shí)驗(yàn)室傳代、保存。培養(yǎng)基分別選擇Ham's F-12K(10%胎牛血清)和Macoy 5A(10%胎牛血清)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，當(dāng)細(xì)胞匯集率達(dá)到80%～90%時(shí)傳代。

1.2主要試劑和儀器 sh-BLM和sh-NC購(gòu)自中國(guó)上?；蚧瘜W(xué)有限公司；Ham's F-12K、Macoy 5A培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco公司)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Abcam)；兔抗人anti-β-Actin和BLM抗體分別購(gòu)于Santa Cruz和CST公司；蛋白酶抑制劑購(gòu)自Sigma公司；RIPA緩沖液和BCA Kit購(gòu)自Thermo公司；TRIzol?試劑購(gòu)自Invitrogen公司；MTT細(xì)胞增殖試劑盒購(gòu)自Abcam公司；碘化丙啶(PI)購(gòu)自Sigma-Aldrich，USA。流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司；二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱和超潔凈工作臺(tái)購(gòu)自Thermo公司；蛋白電泳系統(tǒng)購(gòu)自Invitrogen公司。

1.3方法

1.3.1GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù):使用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)數(shù)據(jù)庫(kù)分析BLM在BLCA中的轉(zhuǎn)錄水平[13]。進(jìn)入數(shù)據(jù)庫(kù)后在“Gene Expression Profile”中輸入“BLM”；“Cancer name”選擇“BLCA”;“Matched Normal data”選擇“Match TCGA normal and GTEx data”；最后點(diǎn)擊“Plot”，完成BLCA與非BLCA中BLM表達(dá)水平差異對(duì)比。非BLCA組28例，BLCA組404例。為進(jìn)一步分析BLM在膀胱癌不同亞型中表達(dá)情況，比較了乳頭狀BLCA和非乳頭狀BLCA中BLM與非BLCA組的差異。

1.3.2T24細(xì)胞轉(zhuǎn)染:實(shí)驗(yàn)共分為T(mén)24組(未轉(zhuǎn)染)、T24+sh-NC組(轉(zhuǎn)染sh-NC)、T24+shBLM組(轉(zhuǎn)染sh-BLM)。轉(zhuǎn)染過(guò)程如下：將短發(fā)夾RNA靶向BLM(sh-BLM)或非靶向序列對(duì)照(sh-NC)經(jīng)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞。sh-BLM(中國(guó)上?；蚧瘜W(xué)有限公司)基因序列為5'-AAGGAAGTTGTATGCACTA-3'；sh-NC: 5 '-ACGGAGGCTAAGCGTCGCAA-3'。轉(zhuǎn)染效力采用RT-qPCR驗(yàn)證。

1.3.3RT-qPCR檢測(cè):用TRIzol?試劑從組織或細(xì)胞中提取總RNA，采用STBR Green法檢測(cè)BLM基因表達(dá)。PCR引物如下：BLM正向5'-GGATCCTGGTCCGC-3'，反向5'-CCTCAGTCAAATTT GCTCG-3'；β-actin正向5'-TGACGTGGACATCCGAAG-3'，反向5'-TCTTCATTGCTGGTGCC-3'。PCR循環(huán)條件如下：在95 ℃處初始變性15 min，然后采用兩步PCR程序，在95 ℃處變性10 s，在60 ℃處退火/延伸32 s，共40個(gè)循環(huán)。所有樣本以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.3.4Western blot檢測(cè)： 細(xì)胞中加入RIPA緩沖液，震蕩后室溫靜置10 min，離心取上清即為粗體蛋白溶液。BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取30 μg蛋白在12.5% SDS-PAGE凝膠上跑膠，并將分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC)上。隨后將膜放入一抗[BLM(1∶1000)、β-actin(1∶2500)]中孵育過(guò)夜，清洗后加入二抗(1∶2000)孵育1 h，再次清洗后加入顯色液，掃膠儀中掃描拍照，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算BLM表達(dá)量。

1.3.5MTT比色法: 在96孔板中每孔分別接種3×103個(gè)T24膀胱癌細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，經(jīng)MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率。在實(shí)驗(yàn)終止前4 h加入5 mg/ml MTT溶液10 μl，孵育4 h后，在每孔中沿孔壁加入150 μl DMSO，震蕩或吹打混勻后檢測(cè)OD 490吸光度。

1.3.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)：細(xì)胞用0.05%胰蛋白酶進(jìn)行消化，PBS充分清洗3次，每次2 min。然后用結(jié)合緩沖液重懸浮1×106個(gè)細(xì)胞，并在室溫下與5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI 一起避光孵育15 min，隨后上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1BLCA腫瘤組織中BLM表達(dá)水平比較 與非BLCA組比較，BLCA組腫瘤組織中BLM表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01)，其轉(zhuǎn)錄水平是對(duì)照組的2.4倍。按照BLCA分型進(jìn)一步分析，乳頭狀BLCA和非乳頭狀BLCA BLM mRNA表達(dá)水平均高于非BLCA組(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 BLCA與非BLCA患者BLM表達(dá)水平比較紅色為BLCA組；灰色為非BLCA組；A.BLCA與非BLCA BLM轉(zhuǎn)錄水平;B.非乳頭狀BLCA與非BLCA轉(zhuǎn)錄水平;C.乳頭狀BLCA與非BLCA BLM轉(zhuǎn)錄水平;BLCA為膀胱尿路上皮癌,BLM為Bloom綜合征解旋酶；與非BLCA組比較，aP<0.01

2.2T24細(xì)胞中BLM轉(zhuǎn)錄水平比較 T24細(xì)胞中BLM mRNA相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 對(duì)照組和膀胱癌細(xì)胞系組BLM表達(dá)水平比較對(duì)照組為SV-HUC-1；SV-HUC-1為人正常膀胱上皮永生化細(xì)胞，BLM為Bloom綜合征解旋酶；與對(duì)照組比較，aP<0.01

2.3敲減BLM對(duì)BLM表達(dá)水平的影響 T24+sh-NC組與T24組BLM mRNA表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；T24+sh-BLM組BLM mRNA表達(dá)水平明顯低于T24組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組T24細(xì)胞系中BLM mRNA表達(dá)水平比較T24+sh-NC組為T(mén)24細(xì)胞轉(zhuǎn)染sh-NC，T24+shBLM組為T(mén)24細(xì)胞轉(zhuǎn)染sh-BLM；BLM為Bloom綜合征解旋酶；與T24組比較，aP<0.01

2.4敲低BLM對(duì)T24細(xì)胞增殖能力的影響 T24+sh-NC組與T24組細(xì)胞增殖能力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；T24+sh-BLM組細(xì)胞增殖能力明顯低于T24組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

圖4 各組T24細(xì)胞增殖能力比較T24+sh-NC組為T(mén)24細(xì)胞轉(zhuǎn)染sh-NC，T24+shBLM組為T(mén)24細(xì)胞轉(zhuǎn)染sh-BLM；BLM為Bloom綜合征解旋酶；與T24組比較，aP<0.01

2.5敲減BLM對(duì)T24細(xì)胞凋亡的影響 T24+sh-NC組與T24組細(xì)胞凋亡水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； T24+sh-BLM組細(xì)胞凋亡率顯著高于T24組(P<0.01)。見(jiàn)圖5。

圖5 各組T24細(xì)胞凋亡水平比較BT24+sh-NC組為T(mén)24細(xì)胞轉(zhuǎn)染sh-NC，T24+shBLM組為T(mén)24細(xì)胞轉(zhuǎn)染sh-BLM；BLM為Bloom綜合征解旋酶；與T24組比較，aP<0.01

3 討論

既往研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、前列腺癌、肺癌和胃癌等中存在BLM基因高表達(dá)，降低其表達(dá)或生理活性是有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖的手段[14]。在前列腺癌PC3細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)相同的現(xiàn)象，沉默BLM顯著抑制了細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)了細(xì)胞凋亡[12]，還提高了絲裂霉素C的敏感性[15]。

本研究通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，乳頭狀BLCA和非乳頭狀BLCA中BLM轉(zhuǎn)錄水平均顯著性升高；且T24組BLM mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組；在T24細(xì)胞系中，敲低BLM表達(dá)后抑制T24細(xì)胞增殖并促進(jìn)T24細(xì)胞凋亡。上述研究結(jié)果證明BLM高表達(dá)與膀胱癌進(jìn)程明顯相關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)，BLM參與細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控，CRISPR/Cas9成功敲除MDA-MB-231細(xì)胞中BLM后，細(xì)胞增殖被抑制，而凋亡水平升高[16]。文獻(xiàn)報(bào)道，低BLM表達(dá)增加化療藥物的敏感性[17]。ML216是BLM的DNA解鏈活性的有效抑制劑，在體外研究中發(fā)現(xiàn)，它可以靶向結(jié)合BLM，抑制其活性，誘導(dǎo)姐妹染色單體交換，增強(qiáng)細(xì)胞毒性藥物的毒性[18]。甘草次酸處理BGC823胃癌細(xì)胞后BLM活性降低，細(xì)胞阻滯于G1/S期[19]；處理PC3膀胱癌細(xì)胞后BLM蛋白結(jié)構(gòu)被破壞，Caspase3凋亡蛋白水平提高，細(xì)胞凋亡水平升高[20]。因此，推測(cè)經(jīng)shRNA敲減膀胱癌細(xì)胞T24中BLM表達(dá)，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞周期紊亂，干擾細(xì)胞增殖，抑制BLM表達(dá)或活性可能是膀胱癌治療的潛在有效靶點(diǎn)。本研究解析了BLM高表達(dá)在膀胱癌中的作用，但是其深層次作用機(jī)制和分子機(jī)制需進(jìn)一步研究。

綜上所述，BLM在膀胱癌組織和T24細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，敲減其表達(dá)抑制T24細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。BLM在膀胱癌疾病進(jìn)程中可能發(fā)揮促進(jìn)作用，抑制其表達(dá)是膀胱癌治療的潛在靶點(diǎn)。