張望明，葛章文，晏文濤，潘衛(wèi)東，焦彥朝，劉杰麟

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州 貴陽 550001；2.貴州省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州 貴陽 550002；3.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550002；4.貴州出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，貴州 貴陽 550004；5.貴州醫(yī)科大學(xué)組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心，貴州 貴陽 550004；6.貴州醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004)

RecQ解旋酶家族是解旋酶第二大超家族中最保守的一個(gè)家族，RecQ解旋酶家族在各種生物體遺傳穩(wěn)定性的維持中發(fā)揮著非常重要的作用[1]。RecQ解旋酶家族成員均具有相同的保守區(qū)，分別為解旋功能區(qū)、RecQ-C功能區(qū)、HRDC功能區(qū)。人體內(nèi)存在著RecQl、BLM、WRN、RecQ4和RecQ5共5種RecQ解旋酶，其中3種編碼基因BLM、WRN、RECQ4缺陷將會(huì)導(dǎo)致人類相應(yīng)疾病的發(fā)生，分別為Bloom綜合征、Wemer綜合征、Rothmund-Thomson綜合征。這些疾病的患者存在易患癌癥的共同特征，Bloom綜合征患者表現(xiàn)為一系列癌癥的高發(fā)病率。在細(xì)胞周期中，RecQ解旋酶參與了復(fù)制、重組和修復(fù)等DNA代謝過程，而染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的改變是腫瘤細(xì)胞的一種非常重要的細(xì)胞遺傳學(xué)表現(xiàn)。RECQ1的功能除了參與對基因調(diào)控，它也有助于腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，也就是說它可以通過調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲。沉默RecQ1的基因表達(dá)可以明顯減少腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[2]。Sanada等[3]研究發(fā)現(xiàn)，RecQ1在生長迅速的乳腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，RecQ1-siRNA干擾后能抑制乳腺癌細(xì)胞生長。人BLM解旋酶表達(dá)在許多種淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞來源的腫瘤中，在BLM表達(dá)活性和細(xì)胞增殖之間存在很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，在腫瘤中，BLM表達(dá)水平高于正常組織[4-5]。在食道鱗癌細(xì)胞中，BLM表達(dá)上調(diào)了2.927倍[6]。因此，以BLM解旋酶作為靶標(biāo)來篩選抗腫瘤藥物為癌癥的治療提供了新思路。

近年來，利用RecQ解旋酶活性抑制模型篩選具有潛在抗癌作用的小分子物質(zhì)的研究已有報(bào)道，Monika等[7]發(fā)現(xiàn)，NSC 19630(1-丙氧基甲基馬來酰亞胺)可以抑制WRN解旋酶活性。段麗霞等[8]發(fā)現(xiàn)，丙酸睪酮對大腸桿菌RecQ解旋酶活性有抑制作用。文獻(xiàn)記載，雙芐基異喹啉生物堿類具有抗腫瘤作用，現(xiàn)已作為候選抗癌藥物進(jìn)行研究開發(fā)。漢防己甲素屬于雙芐基異喹啉生物堿類，且臨床觀察表明，此藥毒性低、副作用小，無其它抗腫瘤藥物引起的骨髓抑制作用。周林云等[9]發(fā)現(xiàn)，漢防己甲素對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖具有抑制作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，漢防己甲素能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[10-11]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用熒光偏振、自由磷檢測、紫外光譜等技術(shù)，研究漢防己甲素衍生物HL-27對BLM解旋酶生物學(xué)特性的影響，對闡明漢防己甲素衍生物HL-27與BLM解旋酶作用的分子機(jī)制具有一定意義，為該小分子物質(zhì)進(jìn)行抗癌研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑漢防己甲素衍生物HL-27：貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室潘衛(wèi)東研究員提供；45 nt單鏈DNA(single stranded DNA，ssDNA)：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTTAGGTTAGGTTAG GTTAGTTTTTTTTTT-3′)和用熒光素標(biāo)記的21 nt單鏈DNA(3′-FAM-TTAGGCAGCTCGTCTCAATCC-5′)由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，兩條互補(bǔ)ssDNA在緩沖液(20 mmol·L-1Tris、100 mmol·L-1NaCl，pH 7.9)中等量混合，經(jīng)85℃水浴5 min，緩慢冷卻至室溫，復(fù)性后的雙鏈DNA(double stranded DNA，dsDNA)用作檢測BLM解旋酶DNA結(jié)合活性和解鏈活性的底物；重組大腸桿菌pET-15b-BLM642-1290-BL21-CodonPlus，法國巴黎第十一大學(xué)居里研究所奚緒光主任研究員饋贈(zèng)。實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程所用超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。

1.2儀器AKTA purifier 100蛋白質(zhì)分離純化系統(tǒng)(美國GE Healthcare公司)；VCX-500超聲波破碎儀(美國SONICS公司)；Synergy 4多功能酶標(biāo)儀(美國BIO-TEK公司)；Beacon 2000 熒光偏振儀(美國PanVera公司)；UV-3600紫外可見分光光度計(jì)(日本SHIMADZU公司)； Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore Corp公司)。

1.3方法

1.3.1BLM642-1290解旋酶的表達(dá)、純化 將重組大腸桿菌pET-15b-BLM642-1290-BL21-CodonPlus接種于LB培養(yǎng)基(含50 mg·L-1氨芐青霉素+30 mg·L-1氯霉素)，37℃、190 r·min-1培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.5～0.6。18℃、190 r·min-1條件下經(jīng)0.4 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)BLM解旋酶表達(dá)20 h，然后4℃、4 000 r·min-1離心20 min,收集菌體。超聲破碎，4℃、13 000 r·min-1離心40 min，收集上清液，再經(jīng)鎳離子親和層析柱和凝膠過濾層析柱分離純化，獲得可用于開展酶生物學(xué)特性研究的重組BLM642-1290解旋酶。

1.3.2HL-27對BLM642-1290解旋酶DNA結(jié)合活性影響的檢測 利用熒光偏振法測定HL-27對DNA與BLM解旋酶結(jié)合活性的影響。取終濃度為2 nmol·L-1的熒光素標(biāo)記DNA[dsDNA或ssDNA(21 nt)]于反應(yīng)緩沖液(20 mmol·L-1Tris、25 mmol·L-1NaCl、3 mmol·L-1MgCl2、0.1 mmol·L-1DTT，pH 7.9)中，置于熒光偏振儀中檢測熒光偏振值至穩(wěn)定；然后加入不同終濃度(0～33.34 μmol·L-1)的HL-27，測定熒光偏振值至穩(wěn)定；再加入終濃度為500 nmol·L-1的BLM解旋酶使DNA底物飽和，測定熒光偏振值至穩(wěn)定。記錄各反應(yīng)體系的熒光偏振值。本實(shí)驗(yàn)中通過調(diào)節(jié)ddH2O的體積，使反應(yīng)體系的總體積保持在150 μL。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都經(jīng)過3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)確定無誤。

1.3.3HL-27對BLM642-1290解旋酶解鏈活性影響的檢測 利用熒光偏振法測定HL-27對BLM解旋酶解鏈活性的影響。取終濃度為2 nmol·L-1熒光標(biāo)記dsDNA于反應(yīng)緩沖液(20 mmol·L-1Tris、25 mmol·L-1NaCl、3 mmol·L-1MgCl2、0.1 mmol·L-1DTT，pH 7.9)中，置于熒光偏振儀中檢測熒光偏振值至穩(wěn)定；將終濃度為500 nmol·L-1的BLM解旋酶與不同終濃度(0～50 μmol·L-1)的HL-27混勻，室溫孵育5 min，加入測定管中，測定熒光偏振值至穩(wěn)定；再加入終濃度為0.2 mmol·L-1的ATP，測定熒光偏振值至穩(wěn)定。記錄熒光偏振值。實(shí)驗(yàn)中通過調(diào)節(jié)ddH2O的體積，保持反應(yīng)體系總體積為150 μL。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都經(jīng)過3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)確定無誤。

式中，A是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的磷酸鹽濃度(μmol·L-1)；B是反應(yīng)時(shí)間(min)。相對ATPase活力=BLM解旋酶經(jīng)過處理后的ATPase活力/未經(jīng)處理的ATPase活力×100%。

1.3.5HL-27對BLM642-1290解旋酶紫外光譜影響的檢測 保持BLM解旋酶終濃度為500 nmol·L-1與不同終濃度(0～50 μmol·L-1)的HL-27置于Tris-HCl緩沖液(pH 7.9)中，維持反應(yīng)體系總體積為3 mL。置于紫外分光光度計(jì)測量室中，設(shè)定掃描波長間隔為0.5 nm，掃描速度為中等速度，于220～380 nm波段下進(jìn)行波段掃描，每3 min掃描1次直至平衡。根據(jù)峰形和峰位的變化即可判定蛋白質(zhì)的構(gòu)象是否發(fā)生變化[12]。再用同樣的方法掃描不同終濃度(0～50 μmol·L-1)的HL-27在緩沖液中的紫外吸收光譜。

2 結(jié)果

2.1HL-27對BLM642-1290解旋酶DNA結(jié)合活性的影響通過Fig 1A、1C可知，HL-27能夠與dsDNA或ssDNA(21nt)結(jié)合并形成復(fù)合物。通過Fig 1B、1D可知，HL-27作用于dsDNA或ssDNA(21nt)后可以抑制其與BLM解旋酶的結(jié)合。當(dāng)HL-27濃度達(dá)到33.34 μmol·L-1時(shí)，HL-27對dsDNA或ssDNA(21nt)與BLM解旋酶結(jié)合活性的抑制率分別達(dá)到41.35%、59.54%。HL-27對ssDNA(21nt)與BLM解旋酶結(jié)合活性的抑制要強(qiáng)于其對dsDNA與BLM解旋酶結(jié)合活性的抑制。

2.2HL-27對BLM642-1290解旋酶解鏈活性的影響通過Fig 2A、2B可知，HL-27可以強(qiáng)烈抑制BLM解旋酶的解鏈活性。當(dāng)HL-27濃度達(dá)到50 μmol·L-1時(shí)，HL-27對BLM解旋酶解鏈活性的抑制率為78.68%。由Fig 2B還可知，HL-27對BLM解旋酶的解鏈速率亦有抑制作用。

2.3HL-27對BLM642-1290解旋酶ATPase活性的影響當(dāng)HL-27的濃度達(dá)到100 μmol·L-1時(shí)，HL-27對BLM解旋酶ATPase活性的抑制率為43.8%(Fig 3)。

2.4HL-27對BLM642-1290解旋酶紫外光譜的影響通過Fig 4B、4C、4D可知，BLM解旋酶與HL-27作用后，在237 nm和277 nm兩波長處所產(chǎn)生的紫外光吸收值明顯高于HL-27、BLM解旋酶在237 nm和277 nm兩波長處的紫外光吸收值之和(BLM解旋酶的生色基團(tuán)被翻轉(zhuǎn)到極性較大的區(qū)域[12])。通過Fig 4A可知，隨著HL-27濃度的增加，BLM解旋酶與HL-27作用后237 nm與277 nm波長處所產(chǎn)生的紫外吸收峰值不斷增大。綜合以上結(jié)果可知，HL-27可以與BLM解旋酶結(jié)合，并使其構(gòu)象發(fā)生改變。

Fig 1 Effects of HL-27 on DNA-binding activity of BLM helicase

A:Effects of HL-27 on dsDNA and the fluorescence anisotrophy of complexes formed by BLM binding HL-27-dsDNA; B:Effects of HL-27 on the dsDNA-binding activity of BLM helicase; C:Effects of HL-27 on ssDNA(21 nt) and the fluorescence anisotrophy of complexes formed by BLM binding HL-27-ssDNA(21 nt); D:Effects of HL-27 on the ssDNA(21 nt)-binding activity of BLM helicase. A0is the fluorescence anisotrophy of DNA binding HL-27; A1is the fluorescence anisotrophy of complexes formed by BLM binding DNA and HL-27.

Fig 2 Effects of HL-27 on unwinding activity of BLM helicase

A：The effects of HL-27 on the unwinding activity of BLM helicase; B:The effects of 6.67, 26.67 and 50 μmol·L-1HL-27 on the unwinding time curve of BLM helicase. A1is the fluorescence anisotrophy of BLM binding DNA and HL-27; A2is the fluorescence anisotrophy after the addition of 0.2 mmol·L-1ATP.

Fig 3 Effects of HL-27 on ATPase activity of BLM helicase

3 討論

RecQ解旋酶在DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)、重組以及端粒的維持等細(xì)胞代謝過程中都發(fā)揮著非常重要的作用[13]。解旋酶的生化活性是其能夠發(fā)揮這些重要功能的基礎(chǔ)，解旋酶與dsDNA結(jié)合是其發(fā)揮解鏈功能的第一步，在與DNA結(jié)合后解旋酶具有DNA依賴的ATP酶活性，能水解ATP產(chǎn)生能量，在此基礎(chǔ)上解旋酶將dsDNA解開。

熒光偏振技術(shù)是本課題研究中所用到的最為重要的技術(shù)。Weber[14-15]發(fā)明了第一臺熒光偏振儀器。Dandliker等[16]將熒光偏振技術(shù)應(yīng)用到生物系統(tǒng)中，如抗原-抗體反應(yīng)、激素-受體反應(yīng)。Jolley等[17]將熒光偏振法應(yīng)用于治療藥物的監(jiān)測。目前，熒光偏振技術(shù)被廣泛應(yīng)用于熒光免疫分析、藥物篩選、測定蛋白質(zhì)-核酸及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用等領(lǐng)域。熒光偏振技術(shù)應(yīng)用于該研究，能夠?qū)崟r(shí)跟蹤檢測藥物分子與DNA的相互作用、DNA與藥物分子作用后對BLM解旋酶結(jié)合DNA的影響，以及藥物對BLM解旋酶解開dsDNA的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，漢防己甲素衍生物HL-27與熒光素標(biāo)記的ssDNA、dsDNA均能發(fā)生結(jié)合。HL-27結(jié)合DNA后對DNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，從而影響B(tài)LM解旋酶與之結(jié)合。當(dāng)HL-27濃度為33.34 μmol·L-1時(shí)，其對BLM解旋酶結(jié)合dsDNA活性的抑制率為41.35%，而對BLM解旋酶結(jié)合ssDNA活性的抑制率達(dá)59.54%。說明HL-27對BLM解旋酶結(jié)合ssDNA的抑制作用要強(qiáng)于dsDNA。BLM解旋酶的ATPase活性依賴于其結(jié)合DNA的能力[18]，因此，我們檢測了HL-27對BLM解旋酶ATPase活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HL-27對BLM解旋酶的ATPase活性有較強(qiáng)的抑制作用，這與其抑制BLM解旋酶結(jié)合DNA活性是相符的。BLM解旋酶依賴其ATPase活性水解ATP為其解鏈DNA提供能量[19]，本研究發(fā)現(xiàn)，HL-27對BLM解旋酶的DNA解鏈活性亦有較強(qiáng)的抑制作用，這與其對BLM解旋酶ATPase活性的抑制亦是相符的。

本實(shí)驗(yàn)通過研究HL-27對 BLM解旋酶的紫外吸收光譜的影響發(fā)現(xiàn)，HL-27能與BLM解旋酶結(jié)合并使其構(gòu)象發(fā)生改變。HL-27對BLM解旋酶構(gòu)象變化的影響在HL-27濃度為0.1 μmol·L-1時(shí)就很明顯，這與其對BLM解旋酶活性的抑制濃度范圍存在較大差異。原因可能是HL-27在較低的濃度下雖可使BLM解旋酶構(gòu)象發(fā)生一定程度的改變，但還不足以引起B(yǎng)LM解旋酶活性的變化。當(dāng)HL-27達(dá)到較高濃度時(shí)，HL-27通過較大程度地改變BLM解旋酶的構(gòu)象，才使得其結(jié)合DNA活性被抑制，進(jìn)而抑制其ATPase活性與解鏈活性。

Fig 4 Effects of HL-27 on ultraviolet aborption spectrum of BLM helicase

A:Effects of different concentrations of HL-27 on the ultraviolet absorption spectrum of BLM helicase(500 nmol·L-1);B:Effects of HL-27 (0.1 μmol·L-1) on the ultraviolet absorption spectrum of BLM helicase(500 nmol·L-1);C:Effects of HL-27 (5 μmol·L-1) on the ultraviolet absorption spectrum of BLM helicase(500 nmol·L-1);D:Effects of HL-27 (50 μmol·L-1) on the ultraviolet absorption spectrum of BLM helicase(500 nmol·L-1).

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究了漢防己甲素衍生物HL-27對BLM解旋酶生物學(xué)特性的影響，對闡明其與BLM解旋酶的作用機(jī)制具有一定意義，為下一步應(yīng)用該小分子物質(zhì)進(jìn)行抗癌研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在貴州醫(yī)科大學(xué)組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心完成，感謝對實(shí)驗(yàn)給予幫助的老師和同學(xué)！)

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