張 冬，段彥蒼，陳景偉，賀 明，范麗潔，李 慧，孟 鑫，李 穎，杜惠蘭

有資料顯示，不孕癥已成為僅次于腫瘤、心血管疾病的第3大疾病[1]。美國生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會和美國生殖內(nèi)分泌協(xié)會發(fā)表的一項規(guī)范指出，心理應(yīng)激是生育及性功能障礙的重要因素[2]。女性焦慮水平可以影響其自然受孕率，焦慮水平高的不孕癥患者經(jīng)過放松治療能夠提升其受孕率[3]。研究表明，慢性心理應(yīng)激條件下的女性機體自身免疫平衡狀態(tài)更易被破壞[4]。中醫(yī)藥治療不孕癥已取得很好的成效，且中藥具有免疫促進和免疫抑制的雙向調(diào)節(jié)作用。疏肝法已成為臨床治療不孕癥的主要治法之一，其代表方劑——逍遙丸具有促進卵泡發(fā)育及卵母細胞成熟，改善子宮內(nèi)膜容受性，提高臨床受孕率等作用[5],同時在治療女性相關(guān)的焦慮癥和抑郁癥中效果顯著[6]。研究表明，逍遙丸可抑制慢性應(yīng)激小鼠胸腺細胞凋亡，提高胸腺雙陽T細胞數(shù)量；降低人外周血Th1/Th2比率和Th17細胞數(shù)量，改善亞健康狀態(tài)[7]。逍遙丸不僅可改善母體受孕環(huán)境，緩解女性抑郁狀態(tài)，還具有潛在的免疫調(diào)節(jié)作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將網(wǎng)絡(luò)科學(xué)、生物信息學(xué)、計算機科學(xué)和數(shù)學(xué)等學(xué)科方法結(jié)合到中藥藥理研究中，通過多靶點與疾病關(guān)系角度構(gòu)建藥物-藥物、藥物-靶標等網(wǎng)絡(luò)，來預(yù)測藥物的功效以及特定功效對應(yīng)的藥物[8]。因此本研究擬基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究原理和方法，探討逍遙丸對心理應(yīng)激性不孕免疫調(diào)節(jié)的可行性和潛在作用機制，以期為后續(xù)的實驗研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥材成分靶點 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)對逍遙丸中八味藥材：柴胡、薄荷、當歸、白芍、茯苓、白術(shù)、生姜、甘草分別進行化學(xué)成分搜集。根據(jù)ADME參數(shù)設(shè)置口服生物利用度(OB)≥30%及類藥性指數(shù)(DL)≥0.18為篩選條件，獲得具有較高活性的化合物成分以及對應(yīng)的靶標蛋白。

1.2疾病靶點收集 分別以“psychological stress infertility”“immunoregulation”為關(guān)鍵詞在Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)和Genecards兩個數(shù)據(jù)庫檢索相關(guān)的基因靶點，然后將篩選結(jié)果合并，均保留唯一值。

1.3逍遙丸和疾病交集靶基因 使用在線工具Venn對逍遙丸和心理應(yīng)激性不孕及免疫調(diào)節(jié)的靶基因繪制維恩圖。

1.4蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將逍遙丸與心理應(yīng)激性不孕及免疫調(diào)節(jié)的共同靶點輸入STRING中的“multiple proteins”，選擇“Homo sapiens”檢索。最低相互作用得分設(shè)定為 0.7、并隱藏斷開連接的節(jié)點，得到PPI。下載蛋白相互作用的tsv文件，將其導(dǎo)入Cytoscape，根據(jù)節(jié)點自由度篩選重要靶點。

1.5功能富集分析 使用R語言cluster Profiler軟件包，對共同靶點進行GO和KEGG功能富集分析，以BH方法調(diào)整后的P< 0.05(p.adjust < 0.05)為標準篩選顯著富集的GO條目和KEGG通路，并以條形圖、氣泡圖和網(wǎng)絡(luò)圖對部分結(jié)果進行展示。

2 結(jié)果

2.1逍遙丸成分靶點收集結(jié)果 通過 TCMSP 數(shù)據(jù)庫共檢索收集到1357種成分，其中349種來自于柴胡，164種來自于薄荷，125種來自于當歸，85種來自于白芍，34種來自于茯苓，55種來自于白術(shù)， 265種來自于生姜，280種來自于甘草。以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為條件，篩選出161種活性化合物，其中17種來自于柴胡、10種來自于薄荷、2 種來自于當歸、13 種來自于白芍、15 種來自于茯苓、7 種來自于白術(shù)、5 種來自于生姜、92 種來自于甘草。逍遙丸八味藥材通過Uni prot數(shù)據(jù)庫獲得基因名稱的靶點249個。逍遙丸部分潛在活性成分信息見表1。

表1 逍遙丸部分潛在活性成分信息

2.2逍遙丸與心理應(yīng)激性不孕靶點的篩選結(jié)果 OMIM 數(shù)據(jù)庫中篩選到心理應(yīng)激性不孕靶點194個、免疫調(diào)節(jié)靶點6個。Genecards 數(shù)據(jù)庫中找到心理應(yīng)激性不孕靶點973個，找到關(guān)于免疫調(diào)節(jié)靶點569個。將兩個數(shù)據(jù)庫篩選到的靶點去除重復(fù)后心理應(yīng)激性不孕相關(guān)靶點有1133個，免疫調(diào)節(jié)相關(guān)靶點有570個。將心理應(yīng)激性不孕、免疫調(diào)節(jié)和逍遙丸的靶點基因繪制維恩圖，結(jié)果顯示心理應(yīng)激性不孕和免疫調(diào)節(jié)交集靶基因226個，心理應(yīng)激性不孕、免疫調(diào)節(jié)和逍遙丸三者交集靶基因53個。

2.3PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 將篩選的逍遙丸-心理應(yīng)激性不孕-免疫調(diào)節(jié)共有的53個靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，組織(Organism)設(shè)置為“Homo sapiens”，以得到PPI。見圖1。此網(wǎng)絡(luò)中共包含50個節(jié)點，384條邊，連接節(jié)點邊的數(shù)目越多，成為核心基因的可能越大。去掉斷開連接的節(jié)點，網(wǎng)絡(luò)圖中共有節(jié)點50個。圖中不同顏色的線代表不同的相互作用類型。下載tsv文件將其導(dǎo)入Cytoscape，作出“逍遙丸-靶標-心理應(yīng)激性不孕-免疫調(diào)節(jié)”網(wǎng)絡(luò)圖。見圖2。圖中橙色菱形代表逍遙丸，紫色倒三角代表心理應(yīng)激性不孕，粉色正三角代表免疫調(diào)節(jié)。圓形節(jié)點代表基因，圓形越大、顏色越深表示自由度越大，該基因在網(wǎng)絡(luò)中越重要。節(jié)度值自由度前20的靶點蛋白包括白細胞介素6(IL6)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素1β(IL1β)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGFA)、CC類趨化性細胞因子2(CCL2)、CXC類趨化性細胞因子8(CXCL8)、細胞間黏附因子1(ICAM1)、白細胞介素10(IL10)、腫瘤蛋白TP53(TP53)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)、白細胞介素2(IL2)、表皮生長因子(EGF)、白細胞介素4(IL4)、重組人血紅素氧合酶-1(HMOX1)、重組蛋白(IFNG)，這可能是逍遙丸治療心理應(yīng)激性不孕免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用的關(guān)鍵潛在靶點。

圖1 逍遙丸-心理應(yīng)激性不孕-免疫調(diào)節(jié)靶蛋白相互作用

圖2 逍遙丸-靶標-心理應(yīng)激性不孕-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4GO功能富集分析 為進一步明確所篩選靶點的作用機制，本課題組通過R語言cluster Profiler 包對逍遙丸、心理應(yīng)激性不孕及免疫調(diào)節(jié)的53個交集靶基因進行GO功能富集分析，共富集到1868條生物過程(BP)條目，29條細胞成分(CC)條目，70條分子功能(MF)條目。對最顯著富集的前15條BP、CC、MF條目應(yīng)用氣泡圖進行展示，見圖3。圖中橫軸為基因富集比例，縱軸為富集到的GO條目，氣泡大小代表富集到的基因數(shù)目的多少，氣泡的顏色代表調(diào)整后的P值。根據(jù)報告顯示，前述所篩選靶點，BP主要參與炎癥反應(yīng)、T細胞激活、氧化應(yīng)激反應(yīng)等過程，CC主要涉及細胞膜、染色質(zhì)、核染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等區(qū)域，MF主要包括炎性因子受體結(jié)合、炎性因子活性、蛋白酶結(jié)合、抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、TNF結(jié)合等方面。

圖3 逍遙丸、心理應(yīng)激不孕及免疫調(diào)節(jié)53個交集靶基因GO功能富集分析A.生物過程條目； B.細胞成分條目； C.分子功能條目

2.5KEGG功能富集分析 通過R語言cluster Profiler 包對逍遙丸、心理應(yīng)激性不孕及免疫調(diào)節(jié)的53個交集靶基因進行KEGG功能富集分析共富集到154條KEGG通路，對最顯著富集的前15條結(jié)果應(yīng)用柱狀圖展示，見圖4A。橫軸為富集到的基因數(shù)目，柱狀的長短代表富集到的基因數(shù)目的多少，條形顏色代表調(diào)整后的P值。對最顯著富集的前5條KEGG通路做靶點和通路的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4B。對最顯著富集的前15條KEGG通路做通路之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4C。圖中黃色的點代表通路，灰色的點代表靶點基因，此處基因用Uniport符號表示。其中信號通路主要集中在與糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的AGE/RAGE、IL17、TNF和癌癥信號通路等。

圖4 逍遙丸、心理應(yīng)激性不孕及免疫調(diào)節(jié)53個交集靶基因KEGG功能富集分析A.KEGG通路富集柱狀圖(前15)；B.KEGG通路靶點和通路相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(前5)；C. KEGG通路間調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖(前15條)

3 討論

應(yīng)激狀態(tài)時遵照生存優(yōu)先的原則，機體的應(yīng)激反應(yīng)與生長發(fā)育和繁殖相關(guān)[9]。心理狀態(tài)是獨立于年齡、不孕時間等因素以外的，影響自然妊娠率及治療效果的重要因素[10]。激活下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸是應(yīng)激時最主要的神經(jīng)內(nèi)分泌改變。在慢性應(yīng)激條件下由于糖皮質(zhì)激素的持續(xù)增高表現(xiàn)為免疫功能的抑制，女性自身免疫平衡狀態(tài)較男性更易破壞，可表現(xiàn)為向Th1/Th17促炎狀態(tài)的轉(zhuǎn)變[4]。大量臨床數(shù)據(jù)顯示，不孕癥患者外周血或復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者子宮內(nèi)膜中Th1和Th17細胞比例顯著增加，Th1和Th17 型細胞因子亦相應(yīng)增加[11]。通過調(diào)節(jié)對HPA軸作用可提高心理應(yīng)激性不孕癥患者妊娠率[12]。正常妊娠時母體細胞免疫功能受到抑制，免疫反應(yīng)以體液免疫為主，發(fā)生由Th1/Th17向Th2/Treg型反應(yīng)漂移現(xiàn)象[13]，在IL17、IL6、TNF-α、IL1β等大量細胞因子的參與下，通過MAPK/STAT3/NF-κB等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，完成妊娠免疫耐受和免疫應(yīng)答等過程[14]。逍遙丸調(diào)節(jié)作用廣泛，涉及機體神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫等系統(tǒng)。因此本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺，應(yīng)用相關(guān)數(shù)據(jù)庫及軟件，構(gòu)建“逍遙丸-心理應(yīng)激性不孕-免疫調(diào)節(jié)”的關(guān)鍵靶點和信號通路網(wǎng)絡(luò)，以探討逍遙丸對心理應(yīng)激性不孕潛在的免疫調(diào)節(jié)作用及可能的機制。

本研究篩選出161種活性化合物，主要為黃芩苷、豆甾醇、β-谷甾醇、槲皮素、毛地黃黃酮、芍藥苷、圣草酚等。篩選出逍遙丸-心理應(yīng)激性不孕-免疫調(diào)節(jié)相關(guān)靶點，如IL6、STAT3、TNF、IL1β、MAPK1、VEGFA、MMP9等，主要涉及炎癥反應(yīng)、T細胞激活、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及細胞膜、染色質(zhì)、核染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等區(qū)域，與IL17、TNF等信號通路有關(guān)。文獻報道，黃芩苷可改善脂多糖誘導(dǎo)孕鼠的子癇前期癥狀，降低大鼠胎盤中促炎細胞因子的水平，具有強效抗抑郁作用[15-16]。豆甾醇和β-谷甾醇可顯著降低結(jié)腸組織IL1β、IL6水平[17]。槲皮素可降低創(chuàng)傷性腦損傷后IL6、TNF-α水平，改善神經(jīng)功能缺損和認知功能[18]，同時對大鼠卵巢卵泡發(fā)育和成熟有一定的促進作用[19]。芍藥苷可通過MAPK/NF-κB 等通路，影響IL17等細胞因子的生成，發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[20]。圣草酚具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及神經(jīng)系統(tǒng)保護等多種藥理活性[21]。在KEGG所篩選的較為集中的信號通路中，IL17的促炎特性是其宿主保護能力的關(guān)鍵，對宿主防御、組織修復(fù)、炎癥疾病的發(fā)生起重要作用，MAPK/NF-κB-TNF-α是與IL17密切相關(guān)的信號通路，生物學(xué)上，維持IL17信號的致病和保護作用的平衡是非常必要的[22-23]。 TNF-α是健康有機體和疾病條件下哺乳動物免疫反應(yīng)的關(guān)鍵中介和調(diào)節(jié)因子，誘導(dǎo)NF-κB和MAP活性是其主要的生化功能，在誘導(dǎo)T細胞亞群的激活、分化和存活中發(fā)揮重要作用[24]。

綜上所述，逍遙丸有效成分黃芩苷、豆甾醇等在抗炎、免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)系統(tǒng)保護方面發(fā)揮重要作用，涉及IL6、TNF等蛋白以及機體免疫調(diào)節(jié)關(guān)鍵的IL17信號通路和TNF信號通路等，具有多成分、多靶點和多途徑且相互調(diào)節(jié)的特點，為臨床應(yīng)用逍遙丸對心理應(yīng)激性不孕免疫調(diào)節(jié)的可行性和潛在作用機制提供了理論依據(jù)，后續(xù)將以此依據(jù)進行相關(guān)的實驗驗證。