趙立娜，翟 臻，梁 晨，李以良，李 巍，祝東升

雌激素受體(ER)陽(yáng)性乳腺癌是最常見(jiàn)的乳腺癌亞型之一[1]，其主要治療方法為內(nèi)分泌治療，但長(zhǎng)期治療可能會(huì)導(dǎo)致多種不良反應(yīng)及內(nèi)分泌抵抗，從而降低了有效性[2]。因此，針對(duì)ER陽(yáng)性乳腺癌的治療方法仍舊面臨重重困難，迫切需要開(kāi)發(fā)新的治療策略。

粉防己堿(tetrandrine，TET)是從粉防己(StephaniatetrandraS.Moore)根部提取的一種雙芐基異喹啉生物堿[3]。多項(xiàng)研究已經(jīng)證明TET通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤活性[3-4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)參與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、凋亡和蛋白質(zhì)折疊等多種生理過(guò)程的細(xì)胞器[5]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則是細(xì)胞自噬和(或)凋亡的重要途徑[6]?；谏鲜隼碚撗芯浚T導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡在抗癌治療中的臨床價(jià)值得到了越來(lái)越多的關(guān)注；但TET是否促進(jìn)ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞凋亡、是否通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮促凋亡作用尚不清楚。本研究以BT474細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，揭示?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)TET誘導(dǎo)ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞自噬與凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系 ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系BT474購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物研究所(ATCC)。

1.2主要試劑及儀器 TET(Sigma)、RPMI 1640(Gibco)、胎牛血清(FBA，Gibco)、胰酶(Gibco)、MTT(Sigma)、BCA蛋白定量試劑盒(Thermo)、Annexin V和PI凋亡試劑盒(索萊寶)。兔源抗LC3-Ⅱ單克隆抗體、兔源抗Beclin1單克隆抗體、兔源抗GRP78抗體、兔源抗p-PERK抗體、兔源抗p-eIF2α抗體、兔源抗CHOP抗體、兔源抗ATF6抗體、兔源抗β-actin抗體(Cell Signaling Technology，CST)、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗(Santa Cruz Biotechnology)。酶標(biāo)儀(Bio-Rad)、流式細(xì)胞儀(BD)、蛋白電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌細(xì)胞系BT474使用RPMI 1640 培養(yǎng)液+10% FBS，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4MTT檢測(cè) 對(duì)數(shù)期BT474細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)3×103個(gè)。培養(yǎng)24 h后，加入0(對(duì)照組)、5、15、30 μmol/L TET，于5% CO237 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。在培養(yǎng)終止前4 h，每孔沿孔壁加入5 mg/ml MTT溶液10 μl。培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸棄培養(yǎng)液終止培養(yǎng)，每孔沿孔壁加入150 μl DMSO，輕柔震蕩15 min。將96孔板放入酶標(biāo)儀，檢測(cè)490 nm處各孔吸光度。

1.5細(xì)胞凋亡檢測(cè) 細(xì)胞以1×106個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，用0、5、15、30 μmol/L TET處理72 h后收獲細(xì)胞；PBS充分漂洗2次，沿孔壁加入200 μl緩沖液，輕彈6孔板底部以重懸細(xì)胞，分別吸取100 μl細(xì)胞懸浮液加入1.5 ml EP管中；根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Thermo Fisher Scientific)說(shuō)明書(shū)，取10 μl 1∶1混合的Annexin-V 和PI 預(yù)混液加入細(xì)胞懸浮液中，避光孵育15 min，加入150 μl結(jié)合緩沖液，采用FACScanⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。計(jì)算凋亡細(xì)胞比例。

1.6蛋白免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集0、5、15、30 μmol/L TET處理72 h后的BT474細(xì)胞，經(jīng)RIPA裂解液裂解后，BCA蛋白定量檢測(cè)蛋白含量，取40 μg蛋白上樣檢測(cè)Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白含量。LC3-Ⅱ抗體(1∶2000)、Beclin1抗體(1∶2500)、GRP78抗體(1∶2000)、p-PERK抗體(1∶2500)、p-eIF2α抗體(1∶2500)、CHOP抗體(1∶5000)、ATF6抗體(1∶2000)、β-actin抗體(1∶2500)，4 ℃孵育過(guò)夜；清洗后加入HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h(1∶5000)；清洗后參照BCL顯色液說(shuō)明書(shū)配置顯色液，加入顯色液至膜上；凝膠成像系統(tǒng)掃描成像，目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值代表相對(duì)蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1TET降低BT474細(xì)胞活力 TET 5、15、30 μmol/L組細(xì)胞活力分別下降10.5%、31.3%、57.2%。與對(duì)照組比較，TET 5、15、30 μmol/L組細(xì)胞活力顯著降低，且呈濃度依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度TET處理后BT474細(xì)胞活力比較對(duì)照組不加TET；TET為粉防己堿；與對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與5 μmol/L組比較，cP<0.01；與15 μmol/L組比較，dP<0.01

2.2TET促進(jìn)BT474細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡率對(duì)照組為(10.35±0.78)%，TET 5、15和30 μmol/L組分別為(16.25±0.62)%、(33.49±0.82)%、(37.01±0.73)%。與對(duì)照組比較，TET 5、15和30 μmol/L組細(xì)胞凋亡率顯著增高，且呈濃度依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度TET處理后BT474細(xì)胞凋亡水平比較對(duì)照組不加TET；TET為粉防己堿；與對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與5 μmol/L組比較，cP<0.01；與15 μmol/L組比較，dP<0.01

2.3TET促進(jìn)BT474細(xì)胞自噬 與對(duì)照組比較，TET 5、15、30 μmol/L組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ表達(dá)水平顯著升高，且15、30 μmol/L組高于5 μmol/L 組，30 μmol/L組高于15 μmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。圖3、4。

圖3 不同濃度TET處理后BT474細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ表達(dá)蛋白免疫印跡圖對(duì)照組不加TET；TET為粉防己堿

圖4 不同濃度TET處理后BT474細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ相對(duì)表達(dá)水平比較對(duì)照組不加TET；TET為粉防己堿；與對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與5 μmol/L組比較，cP<0.01；與15 μmol/L組比較，dP<0.01

2.4TET激活BT474細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 與對(duì)照組比較，TET 5、15、30 μmol/L組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白萄萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、p-PERK、p-eIF2α、CHOP表達(dá)水平升高，且15、30 μmol/L組高于5 μmol/L組，30 μmol/L組高于15 μmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。對(duì)照組與TET 5 μmol/L組ATF6表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組和5 μmol/L組比較，TET 15、30 μmol/L組ATF6表達(dá)水平升高，且30 μmol/L組高于15 μmol/L組(P<0.01)。見(jiàn)圖5、6。

圖5 不同濃度TET處理后BT474細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白表達(dá)免疫印跡圖對(duì)照組不加TET；TET為粉防己堿，GRP78為萄萄糖調(diào)節(jié)蛋白78

圖6 不同濃度TET處理后BT474細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較對(duì)照組不加TET；TET為粉防己堿，GRP78為萄萄糖調(diào)節(jié)蛋白78；與對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與5 μmol/L組比較，cP<0.01；與15 μmol/L組比較，dP<0.01

3 討論

目前臨床針對(duì)ER陽(yáng)性乳腺癌治療包括芳香化酶抑制劑和抗雌激素化合物，雖然內(nèi)分泌治療已經(jīng)大幅降低了乳腺癌的復(fù)發(fā)率和病死率，但臨床不良反應(yīng)和獲得性耐藥仍然是該治療方案的最大挑戰(zhàn)[2]。因此，亟須探究和開(kāi)發(fā)新的有效治療手段。

TET對(duì)多種受體狀態(tài)的乳腺癌細(xì)胞有抗增殖和促凋亡作用，增加放化療的敏感性[6-7]。既往研究證實(shí)TET抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，從而促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的自噬和凋亡[3]。但TET是否促進(jìn)ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞自噬和凋亡及其相關(guān)作用機(jī)制研究較少。

自噬是溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞降解過(guò)程，該生理過(guò)程在腫瘤進(jìn)展中起重要作用[8]，也是癌癥治療的潛在靶點(diǎn)，是增強(qiáng)放療和(或)化療敏感性的策略之一[9]。Beclin1蛋白是自噬體形成的重要因子，介導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白的亞細(xì)胞定位，從而調(diào)控自噬泡的形成及隨后成熟[10]。LC3-Ⅱ附著于自噬體膜上，是自噬體的結(jié)構(gòu)蛋白[11]。文獻(xiàn)報(bào)道，TET誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬與凋亡，其作用機(jī)制與下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2及促進(jìn)細(xì)胞自噬標(biāo)志物蛋白Beclin1表達(dá)有關(guān)[12]。本研究揭示了TET促進(jìn)ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系BT474的自噬和凋亡，與既往研究一致，TET處理可提高BT474細(xì)胞中Beclin1和LC3-Ⅱ表達(dá)，證明TET能夠激活自噬信號(hào)通路，從而抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且該效應(yīng)具有明顯的濃度依賴(lài)性。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過(guò)激活細(xì)胞自噬信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是真核生物中重要的應(yīng)激-防御機(jī)制之一，其通過(guò)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)及其他相關(guān)分子信號(hào)調(diào)控自噬與細(xì)胞凋亡[13]。UPR信號(hào)通路由以下通路組成：PERK通路[14]、IRE1通路[15]和ATF6通路[16]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78是評(píng)估內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平的分子標(biāo)志物[17]。Tiwari等[18]報(bào)道γ-生育三烯酚可提高乳腺癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞自噬水平，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡；同樣，法卡地醇可通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[19]。本研究發(fā)現(xiàn)TET可激活ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路相關(guān)蛋白GRP78、p-PERK、p-eIF2α、CHOP、ATF6表達(dá)，激活經(jīng)典p-PERK、CHOP和ATF6通路。證實(shí)TET可能通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活細(xì)胞自噬細(xì)胞通路和細(xì)胞凋亡，從而抑制ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系BT474的增殖。與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致。本研究為T(mén)ET治療ER陽(yáng)性乳腺癌提供了理論依據(jù)，但不足的是本研究使用的細(xì)胞系有限，后續(xù)可擴(kuò)充乳腺癌細(xì)胞系類(lèi)型以驗(yàn)證本結(jié)論。

綜上所述，TET通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路激活細(xì)胞自噬，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞BT474增殖。本研究豐富了TET在ER陽(yáng)性乳腺癌中的作用機(jī)制，為臨床的研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。