吳靜靜　王俊宏　劉玲佳　

摘要 目的：運用網(wǎng)絡藥理學及分子對接探究山藥-陳皮治療孤獨癥譜系障礙（ASD）的分子機制。方法：檢索中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）并篩選山藥-陳皮活性成分及靶點，檢索Genecards、DisGenet、TTD數(shù)據(jù)庫并篩選ASD疾病相關靶點。運用Cytoscape 3.7.2軟件建立山藥-陳皮靶點基因蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡及ASD疾病基因PPI網(wǎng)絡，提取Hithubs網(wǎng)絡，即山藥-陳皮治療ASD的關鍵靶點。運用DAVID數(shù)據(jù)庫對關鍵靶點進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析。運用Autodock軟件對山藥-陳皮活性成分與關鍵靶點進行分子對接。結果：篩選山藥-陳皮活性成分21個及對應靶點109個，檢索ASD相關靶點476個，提取山藥-陳皮治療ASD的關鍵靶點141個，GO分析結果顯示91個生物過程，68個細胞組分和77個分子功能相關過程，KEGG通路富集條目10條（P<0.05）。這些關鍵靶點涉及rRNA加工、核轉錄基因分解代謝過程、翻譯起始、靶向膜的SRP依賴性共轉運蛋白、病毒轉錄、核糖核酸聚合酶Ⅱ啟動子轉錄正調(diào)控、凋亡過程負調(diào)控、細胞周期、拼接體、核苷酸切除修復等。分子對接結果顯示山藥-陳皮活性成分與關鍵靶點結合構象穩(wěn)定。結論：山藥-陳皮治療ASD可能通過腦神經(jīng)網(wǎng)絡連接、基因表達、信號轉導、炎癥反應、病毒轉錄等途徑起效。

關鍵詞 孤獨癥譜系障礙;山藥;陳皮;藥對;網(wǎng)絡藥理學;靶點;信號通路;分子機制

Abstract Objective：To explore the molecular mechanism of Chinese yam and tangerine peel pair in the treatment of autism spectrum disorder on network pharmacology and molecular docking.Methods：TCMSP was used to screen the active components of Chinese yam and tangerine peel pair.Disease targets associated with ASD were retrieved from Genecards、DisGenet and TTD database.The Cytoscape 3.7.2 software was used to construct a drug-compound-target network.Draw Hithubs diagrams for disease targets and drug targets to screen key targets.Further analysis of GO function and KEGG pathway enrichment was conducted by the database for annotation，visualization and integrated discovery（DAVID）.Finally，Autodock software was used to conduct molecular docking between drug components and core action targets.Results：A total of 21 active ingredients and 109 potential target genes related to Chinese yam and tangerine peel pair were retrieved from TCMSP.And 476 genes directly related to ASD were obtained from the disease gene database.There were 141 key targets obtained by drawing Hithubs diagrams from component targets and disease targets.GO analysis revealed 91 biological processes，68 cell component expression processes，and 77 molecular function related processes.These genes mainly involved in 10 signaling pathways（P<0.05），such as rRNA processing，nuclear-transcribed mRNA catabolic process，nonsense-mediated decay，translational initiation，SRP-dependent co-translational protein targeting to membrane，viral transcription，positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter，negative regulation of apoptotic process，cell cycle，spliceosome and nucleotide excision repair.Conclusion：The active ingredients of Chinese yam and tangerine peel pair has active effects on ASD through multi-pathways，including neural network connection，gene expression，signal transduction，inflammatory reaction and viral transcription.

Keywords Autism spectrum disorder; Chinese yam; Tangerine peel; pair medicinal; Network pharmacology; Target; Signaling pathway; Molecular mechanism

中圖分類號：R285;R749文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.18.007

孤獨癥譜系障礙（Autism Spectrum Disorder，ASD），是以社會交往障礙、語言交流障礙、重復刻板行為及興趣狹窄為特征的精神發(fā)育障礙性疾病[1]，多發(fā)病于嬰幼兒。近年來該病患病率逐年升高，在發(fā)達國家，ASD患病率已達1.5%[2]。ASD病因復雜，發(fā)病機制尚不明確，可能與環(huán)境因素、遺傳因素等相關。對本病的治療，尚無明確有效的治療方案，以教育干預為主，以對癥藥物治療為輔，預后不佳[3]。ASD常伴一種或多種共患病，如智力損害、焦慮障礙、結構性語言障礙、癲癇、注意缺陷多動障礙、睡眠障礙等，此外，有研究顯示，61%的ASD患兒合并胃腸道功能紊亂[4]，胃腸道癥狀的變化與患兒臨床核心癥狀存在密切關系，可影響ASD兒童的治療效果[5]，解決胃腸問題可能對ASD患兒合并的感覺與情緒問題有緩解作用[6]，西醫(yī)治療以飲食干預為主，1979年Mc Carthy和Coleman提出的去麩質(zhì)去酪蛋白飲食，是治療ASD廣為傳播的飲食干預方法[7]。近年來研究表明，此療法有可能影響到常量營養(yǎng)素、微量營養(yǎng)素和食物群的吸收，可能發(fā)生營養(yǎng)缺乏的風險，可能加重腸道微生物成分的不平衡以及原有胃腸問題的惡化[8]。

王俊宏教授多年來運用中醫(yī)理論，致力于以脾為核心論治ASD，自擬益氣運脾方，組成為：陳皮10 g、山藥10 g、茯苓10 g、雞內(nèi)金10 g、生山楂10 g、法半夏6 g、石菖蒲6 g、生甘草6 g，臨床療效顯著，在不進行飲食干預的前提下，使患兒消化系統(tǒng)癥狀可以得到明顯改善。方中山藥甘平質(zhì)潤，補脾養(yǎng)胃，既補脾氣，又益脾陰，兼收澀止瀉?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》云：“山藥主傷中，補虛羸，除寒熱邪氣，補中，益氣力，長肌肉，久服耳目聰明。”陳皮辛行苦燥性溫，有行氣健脾，燥濕和中之功。二者相配，補氣理氣，共奏健脾和胃之效。因此，為更好地推廣應用，山藥-陳皮起效的機制值得深入挖掘。

中藥具有多成分、多靶點、多作用途徑的復雜特點，網(wǎng)絡藥理學成為中藥走向現(xiàn)代化的新的研究方法和技術手段，是在系統(tǒng)生物學理論的指導下，衍生出的以藥物多成分，多靶點為切入點研究中藥治療疾病作用機制的研究學科[9]。本研究運用網(wǎng)絡藥理學和分子對接，探究山藥-陳皮治療ASD起效的分子機制，為后續(xù)實驗研究奠定理論基礎。

1 資料與方法

1.1 山藥-陳皮活性成分及靶點篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），根據(jù)口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%且類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18的原則[10]，分別篩選山藥、陳皮的活性成分，并檢索活性成分的對應靶蛋白。運用Uniprot數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/），將山藥、陳皮活性成分的靶蛋白逐一輸入Uniprot KB進行檢索，限定物種為“Human”，限定檢索結果為已驗證的，選擇“Reviewed”，最終得到對應的靶基因信息。

1.2 ASD疾病相關靶點篩選 以“tic disorder”為關鍵詞，分別檢索Genecards（https：//www.genecards.org/）、DisGenet（http：//www.disgenet.org/）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）數(shù)據(jù)庫，篩選ASD疾病相關靶點。將上述3個數(shù)據(jù)庫的檢索結果合并，去除重復值，最終得到ASD疾病相關靶點。

1.3 山藥-陳皮治療ASD關鍵靶點篩選 運用Cytoscape 3.7.2軟件的bisogenet插件，建立山藥-陳皮靶點基因蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡及ASD疾病相關基因PPI網(wǎng)絡，運用Merge功能，將藥對PPI網(wǎng)絡映射至ASD疾病PPI網(wǎng)絡上，提取二者的交集網(wǎng)絡;運用其中的CytoNCA插件，計算中心中介性（Betweenness Centrality，BC）、最短路徑中心性（Closeness Centrality，CC）、度值（Degree）等參數(shù)指標，提取Hithubs網(wǎng)絡，即山藥-陳皮藥對治療ASD的核心靶點。

1.4 山藥-陳皮治療ASD的中藥-活性成分-關鍵靶點網(wǎng)絡構建 為明確山藥-陳皮活性成分與該藥對治療ASD起效的關鍵靶點之間的關系，運用Cytoscape 3.7.2軟件，將山藥-陳皮具有的活性成分及該藥對治療ASD起效的關鍵靶點導入，行網(wǎng)絡圖繪制可視化分析，并利用Network Analyzer插件進行網(wǎng)絡拓撲屬性分析，度值（Degree）越高，與其他節(jié)點連線越多，說明該節(jié)點起到的作用越為關鍵。

1.5 山藥-陳皮治療ASD關鍵靶基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析 運用DAVID數(shù)據(jù)庫（http：//david.nifcrf.gov/），導入山藥-陳皮治療ASD起效的關鍵靶點，進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，限定物種為“homo sapiens”，篩選P<0.05的條目，最終分析結果包括：生物過程（Biological Process，BP）、細胞組分（Cellular Component，CC）表達、分子功能（Molecular Function，MF）相關過程。運用其中的Merge插件，提取山藥-陳皮治療ASD起效的交集靶點;運用cytoNCA插件，計算出BC、CC、Degree值等參數(shù)，提取Hithubs網(wǎng)絡。

1.6 山藥-陳皮活性成分與關鍵靶點分子對接 分子對接是一種有效的計算方法，主要用于小分子與靶蛋白的結構對接，并評估其與確定結合位點的結合親和力[11]。若對接的結合能量為負值，則提示小分子與靶蛋白能夠有效的自主結合。一般認為，配體與受體結合的構象穩(wěn)定時能量越低，發(fā)生的作用可能性越大[12]。本研究通過對山藥-陳皮藥對Degree值排名靠前的活性成分與該藥對治療ASD起效的關鍵靶點進行分子對接。運用TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）下載山藥-陳皮活性成分的結構圖，以mol2格式保存;運用PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）下載山藥-陳皮治療ASD起效的關鍵靶點的3D結構圖，以pdb格式保存;將二者導入Autodock軟件，去水，加氫，進行分子對接。運用PyMol軟件將對接結果進行可視化分析。

2 結果

2.1 山藥-陳皮活性成分及靶點篩選 共得到山藥-陳皮活性成分共21個，其中山藥16個，陳皮5個。見表1。檢索山藥活性成分對應的靶蛋白134個，陳皮活性成分對應的靶蛋白92個。運用Uniprot數(shù)據(jù)庫，將檢索到的山藥-陳皮靶蛋白逐一轉化為對應的靶基因，合并后刪去重復值，最終得到山藥-陳皮活性成分對應靶點109個。

2.2 ASD疾病相關靶點篩選 共獲得ASD疾病相關靶點381個、164個、9個，合并以上檢索結果并刪去重復值，共得到ASD疾病相關靶點476個。

2.3 山藥-陳皮治療ASD關鍵靶點篩選 構建山藥-陳皮藥對活性成分的作用靶點PPI網(wǎng)絡中節(jié)點4 600個，節(jié)點之間的相互關系114 179個;構建ASD疾病相關靶點PPI網(wǎng)絡，包括節(jié)點8 903個，節(jié)點之間的相互關系196 670個。運用其中的Merge插件，提取山藥-陳皮治療ASD起效的交集靶點;山藥-陳皮治療ASD的關鍵靶點，包括HNRNPA1、CUL2、RPA1、CUL5、FUS、STAU1、RPS3、TARDBP、NCL、RPS27A等141個靶點。見圖1。

2.4 山藥-陳皮治療ASD的中藥-活性成分-關鍵靶點網(wǎng)絡構建 中藥-活性成分-關鍵靶點網(wǎng)絡包含132個節(jié)點，247條作用關系，中心2個粉色矩形圖標分別代表中藥陳皮和山藥，中間黃色V形圖標代表活性成分，外圍藍色菱形圖標代表關鍵靶點。見圖2。圖中節(jié)點越大，與該節(jié)點的連線越多，則該節(jié)點越為重要，可見其中HNRNPA1、CUL2、RPA1、CUL5、FUS、STAU1、RPS3、TARDBP、NCL、RPS27A可能在陳皮-山藥治療ASD中起著至關重要的作用。

2.5 關鍵靶點GO分析和KEGG分析結果 GO分析結果顯示共有91個生物過程（BP），68個細胞組分（CC）和77個分子功能（MF）相關過程，對富集排名靠前的條目進行可視化展示。見圖3。其中涉及BP富集排名靠前的有：rRNA加工、核轉錄基因分解代謝過程、翻譯起始、靶向膜的SRP依賴性共轉運蛋白、病毒轉錄、核糖核酸聚合酶Ⅱ啟動子轉錄正調(diào)控、凋亡過程負調(diào)控;涉及CC富集排名靠前的有：胞質(zhì)、細胞核、細胞膜、細胞質(zhì)、細胞外基質(zhì)、焦點黏附、核糖體;涉及MF富集排名靠前的有：核糖體、蛋白結合、聚腺苷酸核糖核酸結合、核糖體的結構成分、DNA結合、三磷酸腺苷結合、蛋白質(zhì)結構域特異性結合、蛋白質(zhì)異二聚活性、組蛋白結合、泛素蛋白連接酶結合。KEGG分析結果顯示P<0.05的富集排名靠前的條目進行可視化展示，包括：核糖體、病毒致癌作用、乙醇中毒、細胞周期、拼接體、卵母細胞減數(shù)分裂、核苷酸切除修復、非同源的末端連接。見圖4。

2.6 山藥-陳皮活性成分與關鍵靶點分子對接 結果顯示與RPA1蛋白結合構象穩(wěn)定的小分子有：MOL000546（薯蕷皂素），結合能為-5.57 kcal/mol，在TYR-326、GLN-373和LEU-422處形成氫鍵。與CUL2蛋白結合構象穩(wěn)定的小分子有：MOL000546（薯蕷皂素），結合能為-6.05 kcal/mol，在HIS-110、TRP-117和ARG-69處形成氫鍵;MOL000953（CLR），結合能為-5.31 kcal/mol，在PRO-99、ARG-107、ARG-108和HIS-115處形成氫鍵。運用PyMol軟件對上述分子對接結果進行可視化分析，對接空間圖中相應對接的氨基酸殘基以文字形式進行了標示。見圖5。

3 討論

ASD是嚴重影響兒童健康的精神發(fā)育障礙之一，近年來發(fā)病率逐年上升，對患兒家庭及社會造成了沉重負擔。本病病因復雜，遺傳度高，目前15%的ASD案例與基因突變有關，高生育年齡、產(chǎn)前感染及藥物的使用不當、低出生體質(zhì)量或胎兒期接觸丙戊酸鈉、毒素暴露及輻射污染等均可能是ASD的風險因素[13-14]。此外，近年來研究發(fā)現(xiàn)，消化道微生物組失調(diào)可能與ASD的發(fā)生、發(fā)展及癥狀嚴重程度密切相關[15]。目前，本病發(fā)病機制尚不明確，臨床上無針對ASD核心癥狀的有效治療方案，以改善患兒胃腸道癥狀、情緒控制及睡眠障礙等對癥治療為主。西醫(yī)常用抗精神病藥、抗抑郁藥等，如利培酮、阿立哌唑，在快速緩解患兒精神癥狀的同時，不良反應多，中藥可以調(diào)節(jié)臟腑，扶正祛邪，利于ASD患兒遠期康復和回歸，同時能減輕西藥的不良反應[16]。王俊宏教授以脾為核心論治ASD療效顯著，本課題組既往對益氣運脾方治療ASD的臨床療效觀察研究表明：益氣運脾方可以改善患兒的胃腸道癥狀、情緒及睡眠，孤獨癥癥狀也有逐步減輕[17]。本研究探究本方山藥-陳皮起效的分子機制，為中藥以脾為核心論治ASD提供一定的理論依據(jù)，也為下一步實驗研究提供新的思路。

本研究通過運用網(wǎng)絡藥理學，篩選山藥-陳皮活性成分21個，包括（-）-taxifolin（花旗松素）、Hancinone C（山蒟酮C）、Campesterol（菜油甾醇）、Sitosterol（豆甾醇）、Diosgenin（薯蕷皂素）、Naringenin（柚皮素）、5，7-dihydroxy-2-（3-hydroxy-4-methoxyphenyl） chroman-4-one（橙皮素）、Nobiletin（川陳皮素）等，分屬黃酮類、萜類、木脂素、植物甾醇等。有研究表明花旗松素可以減少細胞內(nèi)線粒體產(chǎn)生自由基，具有抗氧化活性[18]，還具有良好的抗炎活性[19]。柚皮素具有高抗氧化、抗炎活性和神經(jīng)保護作用[20-23]。已有研究證實，柚皮素能夠降低6-羥多巴胺（6-OHDA）誘導的氧化應激生物標志物水平，改善6-OHDA誘導的線粒體膜電位降低狀態(tài)，對6-OHDA誘導的神經(jīng)毒性和神經(jīng)變性具有神經(jīng)保護作用[24]。此外，有研究表明，柚皮素通過減少大腦中Aβ的產(chǎn)生、Tau蛋白過度磷酸化、氧化應激和神經(jīng)炎癥，能夠顯著改善衰老小鼠空間學習和記憶能力[25]。橙皮素是一種天然黃酮類化合物，有研究表明，橙皮素早期干預可改善APPswe/PS1dE9小鼠學習記憶能力，降低TLR2和Aβ以減輕海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷[26]，還可通過增加海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的水平來提高小鼠學習和記憶能力[27-28]。有研究在自閉癥患者的大腦和腦脊液中檢測到小膠質(zhì)細胞活化以及炎癥介質(zhì)和趨化因子增加的跡象[29-31]。薯蕷皂素的藥理作用在抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒等方面得到了深入研究[32]。最近有研究表明，ASD患者體內(nèi)高水平的活性氧，可導致氧化應激。氧化應激、炎癥和免疫系統(tǒng)功能障礙可能與ASD的發(fā)病機制和（或）嚴重程度有關[33]。由此推測花旗松素、薯蕷皂素、柚皮素和橙皮素可能通過抗炎、抗氧化作用達到治療ASD的療效。

本研究提取山藥-陳皮治療ASD的關鍵靶點，包括HNRNPA1、CUL2、RPA1、CUL5、FUS、STAU1、RPS3、TARDBP、NCL、RPS27等。這些關鍵靶點涉及：rRNA加工、核轉錄基因分解代謝過程、翻譯起始、靶向膜的SRP依賴性共轉運蛋白、病毒轉錄、核糖核酸聚合酶Ⅱ啟動子轉錄正調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控、細胞周期、拼接體、卵母細胞減數(shù)分裂、核苷酸切除修復等，主要與腦神經(jīng)網(wǎng)絡連接、基因表達、信號轉導、炎癥反應、病毒轉錄等有關。其中HNRNPA1是一種核糖核酸結合蛋白，在許多病毒的生命周期中起著重要的功能和調(diào)節(jié)作用，在轉錄、轉錄后、翻譯和翻譯后水平上影響宿主中許多關鍵基因的表達，這些基因負責控制宿主中的關鍵代謝途徑[34]。遺傳學研究表明，編碼突觸蛋白的基因突變，如SHANK3，NLGN3，NLGN4X，CNTNAP2和GARB都與ASD有關。8個編碼參與活性氧代謝的關鍵蛋白的基因（GCLM、SOD2、NCF2、PRNP、PTGS2、TXN和FTH1）在自閉癥患者中下調(diào)。在自閉癥障礙患者中差異表達的2種基因SOD2和GPX3的水平也降低[35-37]。分子對接結果顯示，山藥-陳皮活性成分薯蕷皂素、橙皮素、柚皮素與關鍵靶點RPA1、CUL2、CLR結合構象穩(wěn)定，提示山藥-陳皮可能作用于上述靶點對ASD起到治療作用。

中藥網(wǎng)絡藥理學以中醫(yī)藥基本理論為指導來研究疾病的發(fā)生機制，為治療復雜疾病提供新的方法和思路[38-39]，體現(xiàn)了中藥單個成分對應多靶點、多信號通路以及多種成分作用同一靶點或信號通路協(xié)同作用的特點[40]，能夠為中醫(yī)學從基于經(jīng)驗的醫(yī)學邁向基于證據(jù)的醫(yī)學提供新的途徑，并能加速中藥藥物發(fā)現(xiàn)的進程，同時改進當前的藥物研究策略[41]。本研究運用網(wǎng)絡藥理學和分子對接，預測了陳皮-山藥具有多個成分，為通過多靶點、多信號通路的協(xié)同作用治療ASD提供了客觀依據(jù)，為實驗研究提供了理論基礎。通過預測，后續(xù)實驗研究可重點研究花旗松素、薯蕷皂素、橙皮素和柚皮素在ASD治療中的起效的關鍵作用。

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（2020-11-21收稿 責任編輯：楊覺雄）