陳衎　唐金艷　馬曉蓉　韓璐

摘要 目的：探討壽胎丸治療早發(fā)性卵巢功能不全的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)特征。方法：利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）、中醫(yī)分子機制生物信息學(xué)分析工具（BATMAN-TCM）、GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得壽胎丸活性成分及疾病靶點，利用Venn在線工具篩選二者交集基因，依托STRING數(shù)據(jù)庫，采用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖和靶點間蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖;通過DAVID數(shù)據(jù)庫對交集基因進行基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，構(gòu)建活性成分-靶點-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)圖來展示壽胎丸治療早發(fā)性卵巢功能不全的相關(guān)作用機制。結(jié)果：篩選出壽胎丸活性成分21個，成分靶點591個及疾病靶點2 438個，主要化合物有槲皮素、賴氨酸等。獲得交集基因共67個，壽胎丸可能通過過氧化氫酶（CAT）、表皮生長因子（EGF）等靶點發(fā)揮作用，GO分析結(jié)果顯示，其生物過程主要是藥物反應(yīng)，細胞組分主要是血紅素結(jié)合反應(yīng)，分子功能主要集中在線粒體基質(zhì)。主要涉及的相關(guān)信號通路有缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號通路，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K-AKT）信號通路。結(jié)論：壽胎丸的多種活性成分可能作用于CAT、EGF等相關(guān)靶點，通過HIF-1、PI3K/AKT等主要信號通路，多靶點、多通路的發(fā)揮治療早發(fā)性卵巢功能不全的作用。

關(guān)鍵詞 壽胎丸;早發(fā)性卵巢功能不全;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);活性成分;靶點;信號通路;作用機制

Abstract Objective：To investigate the network pharmacology of Shou Tai Pills in the treatment of premature ovarian insufficiency.Methods：Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP），Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechanism of Traditional Chinese Medicine（BATMAN-TCM） and GeneCards database were used to obtain the active ingredient and disease targets of Shou Tai Pills; Venn online tools were used to screen both intersection genes; relying on the STRING database，Cytoscape 3.7.0 software were used to build active ingredient-targets between network diagram and the target protein-protein interaction（PPI） network diagram; Gene ontology（GO） enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway enrichment analysis were performed on the intersection genes by David database，and a network diagram of active ingredients-target-key pathway was constructed to demonstrate the relevant mechanism of Shou Tai Wan in the treatment of premature ovarian insufficiency.Results：A total of 21 active components，591 components targets and 2 438 disease targets were screened out，the main compounds were quercetin，lysine，etc.A total of 67 overlapping genes were obtained，suggesting that Shou Tai Wan may act through catalase（CAT），epidermal growth factor（EGF） and other targets.GO analysis results showed that the biological process of Shou Tai Wan was mainly drug reaction，the cell component was mainly heme binding reaction，and the molecular function was mainly concentrated in mitochondrial matrix.The major related signaling pathways involved are hypoxia inducible factor 1（HIF-1） signaling pathway and phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B（PI3K-AKT） signaling pathway.Conclusion：A variety of active ingredients of Shou Tai Pills may act on CAT，EGF and other related targets，and play a role in the treatment of premature ovarian insufficiency through HIF-1，PI3K/AKT and other major signaling pathways.

Keywords Shou Tai Pills; Premature ovarian insufficiency; Network pharmacology; Active ingredients; Target; Signal path; Action mechanism

中圖分類號：R285文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.18.003

早發(fā)性卵巢功能不全（Premature Ovarian Insufficiency，POI）是指女性在40歲前出現(xiàn)的一種生殖內(nèi)分泌疾病，具有代謝紊亂和生殖障礙的特征。常伴有月經(jīng)紊亂、生育力下降、煩躁失眠、潮熱汗出及性欲減退等，其發(fā)病與卵巢衰老過程有關(guān)，根據(jù)歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會（ESHRE）專家共識所規(guī)范的診斷標(biāo)準，當(dāng)月經(jīng)稀發(fā)或停經(jīng)大于4個月，且伴有至少2次血清基礎(chǔ)卵泡刺激素（FSH）>25 IU/L（間隔>4周）或一次性FSH>40 IU/L即可診斷POI。POI的發(fā)病率為1%～5%，發(fā)病原因暫不明確，可能與遺傳、免疫、心理、醫(yī)源性因素和環(huán)境感染等有關(guān)。目前，POI的主要治療方法為激素替代治療（HRT），其他輔助方法有免疫治療、干細胞治療、促生育治療、基因治療等[1]，雖然在短期治療中有一定的臨床療效和優(yōu)點，但在技術(shù)方法和相關(guān)倫理道德的標(biāo)準上具有一定的局限所在。

中醫(yī)學(xué)無此病名，但根據(jù)早發(fā)性卵巢功能不全的主要特征，可以將其歸于“月經(jīng)過少”“閉經(jīng)”“不孕”“經(jīng)斷前后諸癥”等病的范疇?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》載：“女子七歲，腎氣盛……七七，任脈虛，太沖脈衰，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也?！薄陡登嘀髋啤吩唬骸敖?jīng)水出諸腎?！敝嗅t(yī)認為，腎為先天之本，主司人體生長發(fā)育與生殖，調(diào)控著女子月經(jīng)來潮及養(yǎng)精種子，是故腎氣充盛，則天癸盛，腎氣衰少，則天癸竭。故歷代醫(yī)家認為早發(fā)性卵巢功能不全的發(fā)生總歸于腎虛，導(dǎo)致腎-天癸-沖任-胞宮軸功能失衡，兼以脾虛、氣血兩虛、肝郁、血瘀、痰濁等，從而致病。故臨床多以補腎為基本法，以治腎為要，輔以疏肝健脾、活血化瘀等，從扶正補虛這一角度治療POI。

壽胎丸是治療胎漏、胎動不安的經(jīng)典方劑，由菟絲子、續(xù)斷、桑寄生、阿膠組成，源于清代名醫(yī)張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，具有補腎、固沖、安胎之效。方中菟絲子為補腎安胎之要藥，故重用為君;臣以續(xù)斷、桑寄生補益肝腎，調(diào)理沖任;佐使血肉有情之品阿膠以滋養(yǎng)陰血，使沖任血旺，共奏補腎固沖安胎之效。臨床常使用壽胎丸治療相關(guān)婦科疾病，并具有一定療效[2]，但其作用機制尚不明確，缺乏現(xiàn)代藥理學(xué)依據(jù)，此外中藥及其復(fù)方成分的復(fù)雜性也是制約系統(tǒng)研究其具體活性成分及相關(guān)信號通路、靶點的關(guān)鍵因素。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)挖掘及分析的一種方法，基于現(xiàn)代生物信息技術(shù)，通過對藥物、活性成分、作用靶點、疾病間的相互關(guān)系，發(fā)掘及闡述中藥治療相關(guān)疾病的潛在作用機制，在中醫(yī)證候、方劑配伍規(guī)律及不良反應(yīng)等方面的研究中發(fā)揮積極作用，其能從客觀角度幫助我們進行中醫(yī)藥的研究[3]。故本研究將通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討壽胎丸治療POI的作用機制，為其提供基礎(chǔ)生物學(xué)信息依據(jù)，對臨床治療POI提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 壽胎丸活性成分及靶點蛋白的篩選 利用TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），搜索菟絲子、續(xù)斷、桑寄生的主要化學(xué)成分，對比藥物動力學(xué)參數(shù)（ADME），將其標(biāo)準設(shè)定為口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18，初步挑選壽胎丸的潛在藥物活性化合物，依托BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）檢索與阿膠相關(guān)的有效化學(xué)成分，以相關(guān)閾值Score cutoff≥20，P值≤0.001作為限定條件初步篩選阿膠活性化合物。選取具有明確作用靶點的活性成分作為壽胎丸候選活性化合物，同時，提取它們的蛋白質(zhì)靶點，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）規(guī)范靶點蛋白名稱。

1.2 POI相關(guān)靶點的篩選 在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）中檢索與早發(fā)性卵巢功能不全疾病相關(guān)的靶點基因，并記錄靶點基因的Score值，將Score值大于中位值的目標(biāo)靶點作為早發(fā)性卵巢功能不全的候選靶點。

1.3 構(gòu)建壽胎丸主要活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖 為明確壽胎丸活性成分靶點與早發(fā)性卵巢功能不全疾病靶點間的關(guān)系，將已獲得的壽胎丸活性成分靶點與POI疾病靶點，利用Venn在線工具（http：//bioinformatics.psb.u-gent.be/webtools/Venn/）繪制韋恩圖，獲得交集基因。將其通過Cytoscape 3.7.0軟件可視化展示壽胎丸主要活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 構(gòu)建壽胎丸與POI交集基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò) 將交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org），將生物種類設(shè)定為“Homo Sapiens”，最小相互作用閾值設(shè)定為“medium confidence>0.4”，同時隱藏游離點，其余設(shè)置均為默認，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并通過Cytoscape3.7.0軟件進行可視化展示。

1.5 交集基因的富集分析 為闡明壽胎丸治療早發(fā)性卵巢功能不全靶點在信號通路中的作用，利用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），對所提取的交集基因進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，設(shè)定P<0.001，P值越小，則富集結(jié)果顯著性越高，將GO及KEGG分析結(jié)果的P值由小到大排序，并將分析結(jié)果通過微生信在線作圖平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）進行可視化展示。

1.6 構(gòu)建活性成分-靶點-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)圖 將KEGG通路富集分析中前15條關(guān)鍵通路與壽胎丸的活性成分、作用靶點相對應(yīng)，通過Cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖，直觀地展現(xiàn)壽胎丸治療早發(fā)性卵巢功能不全的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，闡述壽胎丸對治療早發(fā)性卵巢功能不全的潛在作用機制。

2 結(jié)果

2.1 壽胎丸有效活性成分及作用靶點蛋白的篩選結(jié)果 通過TCMSP及BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索獲得菟絲子活性成分11個，桑寄生活性成分2個，續(xù)斷活性成分8個，阿膠活性成分3個，合并去重后獲得壽胎丸活性成分21個。見表1。并通過TCMSP查詢這21個活性成分作用的靶點信息，合并去重后得到壽胎丸的靶點數(shù)目為591個，將其通過UniProt數(shù)據(jù)庫經(jīng)行規(guī)范化命名，最終得到壽胎丸的相關(guān)基因靶點。

2.2 POI靶點的收集結(jié)果 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取“POI”及“Primary Ovarian Insufficiency”的相關(guān)靶點基因，共得到POI靶點基因5 092個，Primary Ovarian Insufficiency靶點基因227個，將靶點基因Score值從小到大排列，取其中位數(shù)4.57，將其大于4.57的靶點基因選取，合并去重后得到POI相關(guān)靶點基因2 438個。

2.3 壽胎丸主要活性成分-疾病靶點圖的構(gòu)建結(jié)果利用Venn在線工具繪制韋恩圖，可以得到其交集基因67個，將其交集基因?qū)Ρ葔厶ネ杌钚猿煞肿饔冒悬c，可以得到壽胎丸的有效活性成分數(shù)目為6個。見圖1。通過Cytoscape3.7.0軟件，導(dǎo)入壽胎丸、活性成分、交集基因、POI的相關(guān)信息，制作活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖。見圖2。以節(jié)點表示藥物、活性成分、疾病和交集基因，節(jié)點之間的以邊相連;活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)包含節(jié)點75個，其中藥物節(jié)點1個，疾病節(jié)點1個，活性成分節(jié)點6個，靶點基因節(jié)點67個，壽胎丸有效活性成分與靶點基因的邊106條，活性物質(zhì)節(jié)點連接度平均值為17.7，節(jié)點度值越大，表示該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的地位越重要。故選取節(jié)點連接度大于平均值的活性成分作為候選，其中最高的是槲皮素（Quercetin，節(jié)點連接度為56），其次是賴氨酸（Lysine，節(jié)點連接度為36）。這表明它們在活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖占有核心地位，故此可預(yù)測槲皮素和賴氨酸是壽胎丸治療POI的主要活性成分。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析結(jié)果 壽胎丸活性成分與早發(fā)性卵巢功能不全交集基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見圖3。該網(wǎng)絡(luò)圖含節(jié)點67個，節(jié)點度值越高，顏色越深。經(jīng)軟件分析可得平均節(jié)點度值為7.82，選取節(jié)點度值最多的前20個靶點基因作為其核心基因。見圖4。壽胎丸可能通過過氧化氫酶（CAT）、表皮生長因子（EGF）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（NOS3）、激活蛋白1（JUN）等關(guān)鍵靶點發(fā)揮治療POI的作用。

2.5 交集基因的富集分析

2.5.1 GO功能富集 將交集基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫進行GO分析，共得到相關(guān)條目258個，其中生物過程（BP）199個，細胞組分（CC）22個，分子功能（MF）37個，主要涉及藥物反應(yīng)、血紅素結(jié)合反應(yīng)等，其主要集中在線粒體基質(zhì)。見表2、圖5。

2.5.2 KEGG通路富集分析 將壽胎丸和早發(fā)性卵巢功能不全的交集基因通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行富集分析，導(dǎo)出分析結(jié)果，共得到63條KEGG信號通路，將其中P值最小的前15條信號通路作為壽胎丸治療POI的主要信號通路。見表3。并通過微生信在線作圖平臺進行可視化展示。見圖6。圖中P值代表該信號通路的富集程度，P值越小，則富集程度越大，顏色越紅，反之P值越大則富集程度越小，顏色越綠。氣泡的大小代表所富集的基因個數(shù)。參與壽胎丸治療作用的信號通路主要有HIF-1信號通路、精氨酸生物合成（Arginine biosynthesis）信號通路、PI3K-AKT信號通路、炎癥性腸?。↖nflammatory Bowel Disease）信號通路、非受體酪氨酸激酶家族（JAK-STAT）信號通路等。由此可見，壽胎丸是通過多靶點，多通路來干預(yù)POI從而達到治療目的。

2.6 活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建結(jié)果 將前面得到的壽胎丸活性成分、潛在作用靶點及KEGG篩選出來的前15條信號通路一一對應(yīng)，經(jīng)Cytoscape3.7.0軟件制作活性成分-靶點-關(guān)鍵通路圖。見圖7。壽胎丸治療POI涉及多個活性成分、靶點及信號通路。主要活性成分包含槲皮素、賴氨酸等，主要靶點為CAT、JUN、EGF、NOS3等，涉及的主要信號通路有HIF-1、PI3K-AKT、炎癥性腸病、精氨酸生物合成、JAK-STAT信號通路等。見圖7。

3 討論

近年來早發(fā)性卵巢功能不全的發(fā)病率逐漸上升，增加了如骨質(zhì)疏松、糖尿病、高血壓及心腦血管等疾病的發(fā)生風(fēng)險，嚴重影響了育齡期婦女的身心健康及生命質(zhì)量。ESHRE將“原發(fā)性”改為“早發(fā)性”[1]，為的是及時對POI作出早期診斷及早期治療。現(xiàn)國內(nèi)外治療POI的主要方法為HRT，通過補充體內(nèi)所缺乏的性激素，調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢（HPO）軸的功能起到一定作用，但停藥后常易反復(fù)，并增加乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、中風(fēng)等相關(guān)疾病的發(fā)病危險，在POI的長期治療及管理中存在一定缺陷，且具有一定的禁忌證[4]。其他輔助治療方法雖具有一定優(yōu)勢，但其治療方法較為復(fù)雜，所需費用也較多，且存在一定的倫理問題，臨床上對此類方法的應(yīng)用較為有限。中藥對調(diào)節(jié)女性內(nèi)分泌功能頗有療效，有研究發(fā)現(xiàn)中藥可以通過其擬雌激素作用及調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能促進卵巢功能的恢復(fù)[5]，維持腎-天癸-沖任-胞宮軸功能的平衡，這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)HRT治療早發(fā)性卵巢功能不全有著一定的趨同性，且較之不良反應(yīng)低，花費少，故在臨床上更易被患者所接受。對于治療POI的長期管理更具優(yōu)勢。壽胎丸是治療婦科疾病的常用基礎(chǔ)方之一，具有補腎固沖助孕安胎之功，現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，菟絲子的主要藥理學(xué)作用包括抗氧化、抗衰老、抑制細胞凋亡、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、改善生殖功能等[6]，桑寄生的主要藥理作用有抗氧化、降血糖、降血脂等[7]，續(xù)斷的主要藥理學(xué)作用包括抗衰老、保護神經(jīng)等[8]，阿膠的主要藥理作用有抗氧化、增強免疫、抗疲勞等作用[9]。由于生育力降低貫穿POI的全過程，故對四者合方的壽胎丸治療POI的研究具有一定的現(xiàn)實意義。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)壽胎丸在臨床上治療流產(chǎn)、不孕、月經(jīng)病等婦科相關(guān)疾病療效較好[2]，但其相關(guān)配伍和藥理學(xué)研究較少，因此本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的相關(guān)技術(shù)及方法，基于現(xiàn)代生物信息數(shù)據(jù)，對壽胎丸治療早發(fā)性卵巢功能不全的潛在作用機制進行一定的深入研究。

3.1 壽胎丸活性成分與相關(guān)靶點的分析 本研究共篩選出壽胎丸潛在活性成分21種，其中部分化合物已通過研究證實具有調(diào)節(jié)卵巢功能、延緩其衰老的作用。壽胎丸的核心化學(xué)物質(zhì)槲皮素具有抗氧化、抗炎等藥理作用[10]，黃長盛等[11]發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有擬雌激素活性，對卵巢功能衰退的小鼠有一定的治療效果，同時也可以改善卵泡質(zhì)量，促進各級卵泡的發(fā)育及卵巢顆粒細胞的增殖，增加體內(nèi)雌二醇（E2）的分泌，升高AMH數(shù)值，減少FSH、黃體生成素（LH）的含量，進而恢復(fù)卵巢功能。雌激素缺乏會導(dǎo)致鈣的流失，故POI患者都或多或少伴隨著骨密度的降低。閔珺[12]發(fā)現(xiàn)槲皮素可以有效改善去卵巢小鼠的骨代謝，通過抑制破骨細胞對骨基質(zhì)的吸收，增強成骨細胞分化活性，從而提高骨密度，從根本上改善因雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松的癥狀。有研究發(fā)現(xiàn)，在一定條件下可以通過補充槲皮素來減少卵巢顆粒細胞凋亡，增高CAT等抗氧化物質(zhì)的含量，提高機體抗氧化能力，減輕卵巢組織氧化損傷，進而維持原始卵泡正常形態(tài)，保護卵巢功能[13]。壽胎丸的另一個核心化合物質(zhì)——賴氨酸，是維持正常生命功能的人體必需氨基酸之一，具有增強免疫、促進發(fā)育、營養(yǎng)神經(jīng)等功能。阿孜古麗·要力瓦斯[14]通過實驗發(fā)現(xiàn)賴氨酸可以通過增強卵巢早衰小鼠的免疫力來改善卵巢功能，緩解卵巢功能衰退的進程。Yang等[15]發(fā)現(xiàn)賴氨酸可以促進卵泡的發(fā)育，提高E2含量，增強卵泡支持卵母細胞成熟的能力。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素及賴氨酸在其網(wǎng)絡(luò)圖中具有重要地位，這表明這2種化合物在壽胎丸維持卵巢功能，延緩其衰老的治療過程中起著主要作用，其他化合物如精氨酸（Arginine）、芝麻素（Sesamin）等起到輔助作用。這幾種物質(zhì)可能是壽胎丸治療POI的主要有效成分，但目前對于這幾種活性成分的研究較少，缺少對其具體的相關(guān)作用機制、作用途徑的研究，故有待我們進一步的研究探討。本研究發(fā)現(xiàn)，壽胎丸可能通過CAT、EGF、JUN、NOS3等關(guān)鍵靶點發(fā)揮治療作用，早發(fā)性卵巢功能不全的發(fā)生有多靶點、多生物過程及多信號通路的參與。目前相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，CAT是細胞叉形頭轉(zhuǎn)錄因子1（FoxO1）信號通路的下游靶點，參與細胞的氧化應(yīng)激（OS）、細胞凋亡過程，當(dāng)卵巢發(fā)生再灌注損傷導(dǎo)致OS發(fā)生時，CAT含量的增加會增強卵巢抗氧化能力，減輕OS對卵巢的破壞，抑制細胞凋亡，并提高成骨細胞的增殖，延緩骨質(zhì)疏松，當(dāng)CAT含量異常時，則會導(dǎo)致卵泡的凋亡，造成卵巢功能衰竭，并導(dǎo)致骨密度的下降[16-18]。EGF是一種小分子多肽，其正常表達可以激活細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）、PI3K等下游信號通路，并協(xié)同F(xiàn)SH，有效降低卵巢顆粒細胞的凋亡，減輕卵巢顆粒細胞的損傷，并增強機體抗氧化能力，為卵母細胞的生長、成熟及發(fā)育提供一個適當(dāng)?shù)沫h(huán)境，有保護卵巢顆粒細胞及卵母細胞的作用[19-21]，從而促進E2的分泌，維持卵巢功能[22]。目前研究發(fā)現(xiàn)JUN在細胞生長發(fā)育、細胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用，但相關(guān)研究較少，其作用機制尚未明確[23]。由于POI的發(fā)病可能與自身免疫類疾病有關(guān)，如甲減患者中抗甲狀腺抗體會引起卵巢功能受損[24]，原發(fā)性慢性腎上腺皮質(zhì)功能減退癥患者抗腎上腺皮質(zhì)抗體陽性會導(dǎo)致卵巢功能的衰退[25]，故猜測JUN可能是通過促進卵巢顆粒細胞的生長發(fā)育、抑制細胞凋亡、調(diào)節(jié)自身相關(guān)免疫系統(tǒng)疾病的相關(guān)過程，起到間接治療POI的作用。Taguchi等[26]發(fā)現(xiàn)NOS3的正常表達可以在一定程度上改善子宮內(nèi)膜容受性，提高子宮內(nèi)膜局部組織的血供，利于胚胎著床，增加妊娠概率，從而改善早發(fā)性卵巢功能不全患者的生育功能。由此可見，壽胎丸可能通過以上核心靶點，通過增強細胞抗氧化能力、減輕細胞凋亡，調(diào)節(jié)免疫、促進生育等方面來發(fā)揮治療POI的作用。

3.2 壽胎丸GO功能富集分析 壽胎丸治療POI涉及多種生物過程、細胞組分及分子功能。生物過程主要涉及藥物反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、過氧化氫生物合成、過氧化氫反應(yīng)等。其中，過氧化氫反應(yīng)與POI的發(fā)生有著密切關(guān)系。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH具有調(diào)節(jié)竇卵泡抗氧化應(yīng)激的能力，其含量與總氧化劑狀態(tài)、OS指數(shù)正相關(guān)，當(dāng)FSH上調(diào)的抗氧化防御機制失衡而撤退，或暴露于活性氧（ROS）時，ROS會進一步通過OS過程激活下游信息分子，引起卵泡閉鎖，降低卵泡質(zhì)量及數(shù)量，同時，體內(nèi)過多的過氧化氫會嚴重抑制LH的敏感性及類固醇的產(chǎn)生，通過影響體內(nèi)類固醇代謝導(dǎo)致機體甾體合成途徑受阻，導(dǎo)致顆粒細胞分泌E2減少，從上游進一步導(dǎo)致卵巢功能的破壞[27-30]。當(dāng)機體處于OS狀態(tài)時，通過添加抗氧化物質(zhì)可以顯著提高CAT、超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低卵巢ROS水平，從而保護卵巢的正常功能，減少POI的發(fā)生[31-32]。細胞組分主要與血紅素結(jié)合反應(yīng)相關(guān)，該反應(yīng)通過血紅素結(jié)合蛋白（Hpx）的表達來起到抗氧化、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、調(diào)控信號通路的作用[33]。由于卵巢中含有豐富的血供，Hpx在血液中可以誘導(dǎo)相關(guān)酶的基因表達，鈍化ROS，并通過其降解產(chǎn)物如膽綠素等來調(diào)節(jié)OS[34]，另一方面，在血紅素促脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程，Hpx復(fù)合物可以阻斷其反應(yīng)發(fā)生，從而有效減少血紅素帶來的細胞氧化損傷[35]。鄧玉潔等[36]發(fā)現(xiàn)多芳香烴暴露對卵巢顆粒細胞基因表達、生長發(fā)育和細胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等有影響，可損傷卵母細胞并使生長卵泡發(fā)生閉鎖，導(dǎo)致組織發(fā)生損傷效應(yīng)，而Hpx的表達會隨多環(huán)芳烴暴露程度的加重而增加，故可以檢測Hpx指標(biāo)來作為機體化學(xué)暴露的指標(biāo)之一，對預(yù)測POI的發(fā)生提供了相關(guān)指標(biāo)[37]。分子功能的發(fā)生主要集中在線粒體基質(zhì)，線粒體功能的異常常伴隨著人類疾病及衰老的發(fā)生，同時也是細胞氧化應(yīng)激發(fā)生的主要場所。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)線粒體功能異常與卵巢衰老密切相關(guān)，當(dāng)卵巢衰老過程發(fā)生時，常伴隨著卵母細胞線粒體功能及結(jié)構(gòu)的異常[38]。王博[39]通過實驗發(fā)現(xiàn)線粒體受外來化學(xué)物質(zhì)干擾時，其膜電勢會降低，同時抑制線粒體復(fù)合物I的活性，誘導(dǎo)線粒體發(fā)生氧化應(yīng)激，破壞卵巢功能，而補腎中藥可以有效改善POI小鼠卵母細胞線粒體形態(tài)、數(shù)量、分布及其活力水平，調(diào)節(jié)激素水平和氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而恢復(fù)卵巢功能[40]，所以可以通過改善線粒體功能，增加線粒體數(shù)量來維持卵母細胞的正常功能，延緩POI的發(fā)生。以上均表明，壽胎丸治療POI可能涉及多種生物過程、細胞組分及相應(yīng)分子功能。

3.3 關(guān)鍵信號通路的相關(guān)機制分析 HIF-1信號通路是POI的核心通路之一。HIF-1是組織細胞缺氧狀態(tài)下廣泛存在的一種轉(zhuǎn)錄因子，在機體氧化應(yīng)激過程中起著關(guān)鍵作用。HIF-1信號通路可以由HIF-1的異常表達而被激活，從而誘導(dǎo)卵巢中HIF-1αmRNA和蛋白表達的增加，并特異性表達于卵巢顆粒細胞，且與雌激素受體的表達正相關(guān)，而雌激素受體主要存在于卵囊泡膜細胞，這表明HIF-1信號通路可能直接作用于卵巢[41-42]。相關(guān)研究表明，溫經(jīng)湯可以參與OS過程，糾正局部組織缺氧狀態(tài)，調(diào)控HIF-1信號通路的表達，防止卵巢早衰[43]。PI3K-AKT信號通路是廣泛表達于機體各處的基礎(chǔ)信號通路之一，同時也是細胞增殖、凋亡最主要的傳導(dǎo)通路之一。有研究發(fā)現(xiàn)，卵母細胞中存在大量的PI3K和AKT，PI3K-AKT信號通路參與調(diào)節(jié)卵母細胞生長、原始卵泡發(fā)育以及顆粒細胞的增殖、分化[44]。當(dāng)其正常表達時，可以促進顆粒細胞的增殖，維持卵巢的正常功能，同時也能與分布在卵巢顆粒細胞的特異性受體結(jié)合，增加雌孕激素的分泌，延緩其衰老。當(dāng)PI3K受到缺氧、細胞因子等細胞外信號刺激時可被過度激活，進而誘導(dǎo)AKT，通過調(diào)控其下游哺乳動物雷帕霉素（mTOR）來誘導(dǎo)卵母細胞的閉鎖，而如果PI3K的信號終止，也可引起原始卵泡的提前發(fā)育，使其過快凋亡，從而導(dǎo)致POI的發(fā)生[45-46]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)方法，將現(xiàn)代生物學(xué)信息技術(shù)與傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論相結(jié)合，對壽胎丸組成藥物的化合物、有效活性成分、靶點、疾病靶點及信號通路進行分析，運用相關(guān)數(shù)據(jù)庫及信息軟件構(gòu)建活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖，直觀體現(xiàn)了壽胎丸治療POI是通過多成分、多靶點的方式發(fā)揮其功效，同時PPI網(wǎng)絡(luò)圖也反映了該藥治療POI相關(guān)各靶點間的聯(lián)系程度，并結(jié)合GO富集分析與KEGG信號通路分析，初步探討了壽胎丸治療POI復(fù)雜的作用機制[47]。本研究發(fā)現(xiàn)，POI的發(fā)病涉及多種反應(yīng)機制，如氧化應(yīng)激、細胞凋亡、免疫反應(yīng)等，壽胎丸對POI的作用主要通過提高機體抗氧化能力，抑制細胞凋亡等發(fā)揮治療作用，并激發(fā)與卵巢發(fā)育有關(guān)的mRNA及相關(guān)蛋白的表達，發(fā)揮擬雌激素樣作用，刺激原始卵泡和卵母細胞的生長發(fā)育，從而延緩卵巢衰老，維持其正常生理功能。雖然通過活性成分-疾病靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖可以清楚表明壽胎丸復(fù)雜的作用機制，但缺乏相關(guān)研究，對于各靶點、信號通路之間關(guān)系的闡述不夠充分，且由于中藥復(fù)方之間化學(xué)成分的復(fù)雜作用機制尚不明確，故本研究具有一定的局限性。同時，除現(xiàn)有已經(jīng)明確的對POI有治療效果的活性成分及信號通路外，本研究還發(fā)現(xiàn)了其他潛在成分（精氨酸、芝麻素等）、靶點（EGF、JUN等）及信號通路（Jak-STAT、IBD等），為POI后續(xù)研究、臨床藥物的使用及相關(guān)治療藥物的研發(fā)提供了一定參考。

參考文獻

[1]European Society for Human Reproduction and Embryology（ESHRE） Guideline Group on POI，Webber L，Davies M，et al.ESHRE Guideline：management of women with premature ovarian insufficiency[J].Hum Reprod，2016，31（5）：926-937.

[2]張娟，陳麗.壽胎丸臨床應(yīng)用研究進展[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，17（3）：116-119.

[3]陳衎，唐金艷，馬曉蓉，等.左歸飲“異病同治”早發(fā)性卵巢功能不全、閉經(jīng)、絕經(jīng)綜合征的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2021，44（6）：744-752.

[4]王亞如，蘇健，狄曉倩，等.卵巢早衰的研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2019，25（19）：3895-3899.

[5]余悅，白筱璐，雷玲，等.滋肝方對免疫性卵巢早衰小鼠的影響[J].四川中醫(yī)，2016，34（9）：46-49.

[6]王堯堯，王蕾，戚瑩雪，等.菟絲子藥材化學(xué)成分研究進展[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2020，44（6）：705-712.

[7]管俊，崔瑛.桑寄生藥理作用及臨床應(yīng)用研究進展[J].河北中醫(yī)，2017，39（3）：460-463.

[8]汪文來，鞠大宏，劉梅潔，等.續(xù)斷有效成分藥理學(xué)研究進展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2015，17（10）：1059-1060.

[9]杜怡波，樊慧蓉，閻昭.阿膠的化學(xué)成分及藥理作用研究進展[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2018，24（3）：267-270.

[10]楊穎，王蕓蕓，蔣琦辰.槲皮素藥理作用的研究進展[J].特種經(jīng)濟動植物，2020，23（5）：24-28.

[11]黃長盛，賀守第，管雁丞，等.菟絲子黃酮和槲皮素對雷公藤多苷致卵巢早衰大鼠卵巢功能的影響[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2020，36（6）：667-670.

[12]閔珺.槲皮素對卵巢去勢大鼠骨代謝的影響及其作用機制的研究[D].南昌：南昌大學(xué)，2019.

[13]楊璐愷，蔣利剛，崔妍婷，等.槲皮素在羊卵巢組織玻璃化凍存中的卵泡保護及抗氧化作用[J].山東大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2020，58（9）：1-7.

[14]阿孜古麗·要力瓦斯.中藥木尼孜其干預(yù)的慢性應(yīng)激卵巢早衰大鼠模型代謝組學(xué)研究[D].烏魯木齊：新疆醫(yī)科大學(xué)，2020.

[15]Yang H，F(xiàn)oxcroft GR，Pettigrew JE，et al.Impact of dietary lysine intake during lactation on follicular development and oocyte maturation after weaning in primiparous sows[J].J Anim Sci，2000，78（4）：993-1000.

[16]白鴻愛，何勇靜，張奇，等.基于FoxO1通路探討仙茅苷對H2O2誘導(dǎo)成骨細胞氧化損傷的保護作用及機制[J].中藥新藥與臨床藥理，2020，31（11）：1296-1304.

[17]于月新，李巨，陳佳，等.解除附件扭轉(zhuǎn)對兔卵巢組織MDA、GSH-Px和CAT的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2013，38（1）：23-25.

[18]陳燕霞.補腎促卵方調(diào)控PI3K和Nrf2信號通路保護卵巢儲備功能低下的機制研究[D].北京：中國中醫(yī)科學(xué)院，2020.

[19]Ding C，Zou Q，Wu Y，et al.EGF released from human placental mesenchymal stem cells improves premature ovarian insufficiency via NRF2/HO-1 activation[J].Aging（Albany NY），2020，12（3）：2992-3009.

[20]Ritter LJ，Sugimura S，Gilchrist RB.Oocyte induction of EGF responsiveness in somatic cells is associated with the acquisition of porcine oocyte developmental competence[J].Endocrinology，2015，156（6）：2299-2312.

[21]Gupta S，Pandey S，Parmar MS，et al.Impact of oocyte-secreted factors on its developmental competence in buffalo[J].Zygote，2017，25（3）：313-320.

[22]Palmerini MG，Nottola SA，Tunjung WA，et al.EGF-FSH supplementation reduces apoptosis of pig granulosa cells in co-culture with cumulus-oocyte complexes[J].Biochem Biophys Res Commun，2016，481（1-2）：159-164.

[23]楊海洋，汪國鵬，楊文寧，等.黃芩素、槲皮素、高良姜素對黃嘌呤氧化酶靶點占有率的模擬分析[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2021，27（14）：147-154.

[24]劉堯，饒坤穎，牟曉玲.原發(fā)性卵巢功能不全的預(yù)測指標(biāo)解析[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2018，34（9）：1351-1354.

[25]Gao J，Jiao X，Dang Y，et al.Identification of patients with primary ovarian insufficiency caused by autoimmunity[J].Reprod Biomed Online，2017，35（4）：475-479.

[26]Taguchi M，Alfer J，Chwalisz K，et al.Endothelial nitric oxide synthase is differently expressed in human endometrial vessels during themen strual cycle[J].Mol Hum Repord，2000，6（2）：185-190.

[27]Kolodecik TR，Aten RF，Behrman HR.Ascorbic acid-dependent cytoprotection of ovarian cells by leukocyte and nonleukocyte peroxidases[J].Biochem Pharmacol，1998，55（9）：1497-1503.

[28]Rizzo A，Roscino MT，Binetti F，et al.Roles of reactive oxygen species in female reproduction[J].Reprod Domest Anim，2012，47（2）：344-352.

[29]Luderer U.Ovarian toxicity from reactive oxygen species[J].Vitam Horm，2014，94：99-127.

[30]Aaayak E，Yaman Grük N，Küsen H，et al.Role of inflammation and oxidative stress in the etiology of primary ovarian insufficiency[J].Turk J Obstet Gynecol，2016，13（3）：109-115.

[31]Zhang JQ，Wang YR.Breaking dormancy in freshly matured seeds of Elymus sibiricus，an important forage grass in the Tibetan Plateau[J].Genet Mol Res，2015，14（3）：11109-11118.

[32]盧長柱，石艷會，焦?jié)櫳?維生素E對老年大鼠卵巢顆粒細胞保護作用機制的探討[J].中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2009，25（4）：565-568.

[33]楊海嬌，楊廣民.血紅素結(jié)合蛋白的研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2020，26（13）：2534-2538.

[34]楊諾，李文.血紅素加氧酶1對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用[J].醫(yī)學(xué)綜述，2019，25（12）：2289-2293，2298.

[35]Hu S，Hua Y，Keep RF，et al.Deferoxamine therapy reduces brain hemin accumulation after intracerebral hemorrhage in piglets[J].Exp Neurol，2019，318：244-250.

[36]鄧玉潔，劉慧，羅友紅，等.苯并芘和4-溴聯(lián)苯醚聯(lián)合暴露對大鼠卵巢功能的影響及機制探討[J].山東醫(yī)藥，2017，57（18）：26-28.

[37]吳舟.多環(huán)芳烴暴露與血漿白蛋白和血紅素結(jié)合蛋白水平的關(guān)聯(lián)[D].武漢：華中科技大學(xué)，2009.

[38]Labarta E，de Los Santos MJ，Escribá MJ，et al.Mitochondria as a tool for oocyte rejuvenation[J].Fertil Steril，2019，111（2）：219-226.

[39]王博.線粒體損傷和細胞凋亡在甲氧滴滴涕卵巢毒性中的作用[D].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2008.

[40]楊珍，魏茂林，董曉英.毓麟珠通過影響免疫性POI小鼠卵母細胞線粒體改善卵巢功能的研究[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2020，13（11）：1846-1852.

[41]王媛中.腎虛型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者蛻膜組織VEGF、VEGFR-2、ER、PR、HIF-1a的表達及補腎健脾中藥對流產(chǎn)小鼠干預(yù)的研究[D].合肥：安徽中醫(yī)藥大學(xué)，2018.

[42]Kazi AA，Koos RD.Estrogen-induced activation of hypoxia-inducible factor-1alpha，vascular endothelial growth factor expression，and edema in the uterus are mediated by the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway[J].Endocrinology，2007，148（5）：2363-2374.

[43]王曉松，王蓓，姚曉光，等.溫經(jīng)湯對婦科實寒證模型大鼠子宮HIF-1α、ET-1及VEGF表達的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2017，28（1）：15-17.

[44]鄧敦，吳陽，申思楠，等.護卵湯對早發(fā)性卵巢功能不全模型小鼠SIRT1/NF-κB/p53/p21通路的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2021，27（15）：36-42.

[45]Asselin E，Wang Y，Tsang BK.X-linked inhibitor of apoptosis protein activates the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in rat granulosa cells during follicular development[J].Endocrinology，2001，142（6）：2451-2457.

[46]楊靜，梁嘉麗，秦佳佳.PI3K/Akt信號通路與卵巢早衰相關(guān)性的研究進展[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2016，25（2）：156-158.

[47]世界中醫(yī)藥學(xué)會聯(lián)合會.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評價方法指南[J].世界中醫(yī)藥，2021，16（4）：527-532.

（2021-01-20收稿 責(zé)任編輯：魏慶雙）