朱凱　梁學(xué)振　劉金豹　許波　盛韋菖　李剛　

摘要 目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討四妙散治療骨性關(guān)節(jié)炎（OA）的作用機制。方法：從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）中檢索四妙散中黃柏、蒼術(shù)、薏苡仁、牛膝的活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18為條件進行篩選，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫進行靶點預(yù)測;通過TTD、Drugbank、CTD、Gencards、OMIM、PharmGKB、GAD、KEGG數(shù)據(jù)庫獲取OA的相關(guān)靶標(biāo)，并進一步對藥物和疾病靶點相映射得到四妙散治療OA的潛在靶點，運用Cytoscape和STRING軟件構(gòu)建“中藥-成分-靶點”與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，篩選可能發(fā)揮治療作用的重要成分及靶點，并對相關(guān)靶點進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析獲知其潛在的作用機制。結(jié)果：從四妙散中共篩選出活性成分67個，包括槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、漢黃芩素、非洲防己堿等，與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的作用靶點524個，包括TNF、IL6、MAPK1、PTGS2、MAPK8等。四妙散主要通過調(diào)節(jié)TNF信號通路、HIF-1信號通路、NOD樣受體、Toll樣受體信號通路等發(fā)揮治療骨關(guān)節(jié)炎的作用。結(jié)論：本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測了四妙散治療OA可能的活性成分、關(guān)鍵靶點及作用通路，體現(xiàn)了中藥治療疾病具有“多成分、多靶點、多途徑”的特點，為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制研究提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 四妙散;骨性關(guān)節(jié)炎;活性成分;靶點;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);作用機制

Abstract Objective：To explore the mechanism of Simiao Powder in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology.Methods：The active components of Phellodendron Phellodendri，Atractylodes，Coix seed and Achyranthes bidentata in Simiao Powder were retrieved from TCMSP database，screened under the condition of OB≥30%，DL≥0.18，and the target was predicted by Uniprot database.The related targets of osteoarthritis were obtained through the databases of TTD，Drugbank，CTD，Gencards，OMIM，PharmGKB，GAD and KEGG，and the important targets of Simiao Powder in the treatment of osteoarthritis were further mapped by drugs and disease targets.The PPI network of “traditional Chinese medicine-active ingredient-important target” and protein interaction was constructed with Cytoscape and STRING，and the main treating components and key targets were screened.The potential action mechanism of the targets was obtained by GO functional enrichment and KEGG pathway enrichment analysis.Results：A total of 67 active components were screened from Simiao Powder，including quercetin，stigmasterol，β-sitosterol，wogonin，Tetrandrine，etc，and 524 targets related to osteoarthritis，including TNF，IL6，MAPK1，PTGS2，MAPK8 and so on.Simiao Powder mainly played a role in the treatment of osteoarthritis by regulating signal pathways of TNF，HIF-1，NOD-like receptor，Toll-like receptor.Conclusion：In this study，the possible active components，key targets and pathways of Simiao Powder in the treatment of osteoarthritis were predicted by the method of network pharmacology，which reflects the characteristics of “multi-components，multi-targets and multi-pathways” in the treatment of traditional Chinese medicine.It provides a theoretical foundation for the study of its pharmacodynamic material base and functional mechanism.

Keywords Simiao Powder; Osteoarthritis; Active ingredient; Target; Network Pharmacology; Mechanism of Action

中圖分類號：R289.4;R285文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.18.006

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種退行性關(guān)節(jié)疾病，可逐漸影響關(guān)節(jié)功能。以關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨重建的退行性丟失和異常修復(fù)為特征，可以致殘，并極大地影響個人生命質(zhì)量[1]。世界衛(wèi)生組織（WHO）估計，在60歲及以上的老年群體中，約10%的男性和18%的女性有OA癥狀，其中80%有活動障礙表現(xiàn)[2]。據(jù)預(yù)測，到2050年，60歲以上的人口將顯著增加，在全球范圍內(nèi)達到20多億，老年人口的增長將導(dǎo)致全球OA發(fā)病率的增加[3]。OA的發(fā)生是一個復(fù)雜的過程，涉及許多危險因素，如年齡、性別、職業(yè)、種族、肥胖、遺傳、創(chuàng)傷、炎癥、飲食、激素等[4-5]。骨關(guān)節(jié)炎在臨床中常常表現(xiàn)為關(guān)節(jié)僵硬和間歇性疼痛的輕微癥狀，關(guān)節(jié)活動受限和持續(xù)劇烈疼痛的嚴(yán)重癥狀，以及關(guān)節(jié)不穩(wěn)定和跛行等更為嚴(yán)重的癥狀[6]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療早、中期OA多選用氨基葡萄糖、非甾體抗炎藥等藥物，但常引起上消化道出血及肝腎損害等不良反應(yīng)[7]，晚期嚴(yán)重者需行關(guān)節(jié)鏡和手術(shù)治療。近年來，中醫(yī)藥對于OA的治療有較好的療效，特別是在OA的早、中期，中醫(yī)藥治療具有明顯優(yōu)勢。中醫(yī)古籍中無“骨性關(guān)節(jié)炎”一詞，但根據(jù)其癥狀及其表現(xiàn)可歸屬中醫(yī)學(xué)“痹證”“骨痹”范疇。

四妙散出自清代張秉成的《成方便讀》一書，該方由黃柏、蒼術(shù)、薏苡仁、牛膝組成，具有清熱利濕、補益肝腎的功效。方中黃柏性味苦寒，善清下焦?jié)駸?，蒼術(shù)燥濕健脾，薏苡仁祛濕熱，利筋絡(luò)，牛膝補肝腎強筋骨，還可加強諸藥走入下焦之力。其組方全面嚴(yán)謹(jǐn)，功專效宏，是作為臨床治療濕熱痹癥的常用方。吳鵬飛[8]研究結(jié)果證實四妙散加減能夠顯著改善膝關(guān)節(jié)OA患者的臨床癥狀，提高治療有效率。梅宗志[9]運用四妙散加味治療觀察組膝關(guān)節(jié)OA患者的有效率高達90.32%，明顯改善膝關(guān)節(jié)的疼痛及活動程度。鐘邱等[10]運用四妙散加味聯(lián)合針灸推拿治療膝關(guān)節(jié)OA，療效顯著。

中醫(yī)藥治療骨關(guān)節(jié)炎的方法在臨床上應(yīng)用較廣泛，且取得了較好的療效，但中醫(yī)藥臨床辨證施治和各種治療方式的應(yīng)用與普及，一直缺乏可被接受的科研規(guī)范，阻礙中醫(yī)藥療法成為治療骨關(guān)節(jié)炎的主流治療方法[11]。目前，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門新興交叉學(xué)科。它構(gòu)建了“藥物-靶向-疾病”的多層網(wǎng)絡(luò)，利用網(wǎng)絡(luò)分析觀察藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)和影響，從而更好地理解藥物對疾病的治療作用[12]。其強調(diào)從“一個目標(biāo)，一種藥物”向“網(wǎng)絡(luò)目標(biāo)，多組分治療”的范式轉(zhuǎn)變，具有整體性和系統(tǒng)性特點。而這與中醫(yī)藥的整體思維及中醫(yī)辨證論治的整體思想相一致[13-15]。基于此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘分析四妙散治療OA的活性成分及作用靶點，并為其作用機制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫 分析軟件使用Cytoscape 3.7.2，所用數(shù)據(jù)庫名稱及其網(wǎng)址見表1[16-26]。

1.2 藥活性成分及藥物靶點的篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP），分別輸入黃柏、蒼術(shù)、牛膝、薏苡仁4味中藥的名稱，搜索獲取活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18為條件進行篩選，匯總活性成分，并檢索對應(yīng)的靶標(biāo)蛋白。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）查詢靶標(biāo)蛋白所對應(yīng)的基因名稱，對重復(fù)的靶點進行刪除，加以匯總。

1.3 疾病相關(guān)靶點的檢索 通過TTD、Drugbank、CTD、Gencards、OMIM、PharmGKB、GAD、KEGG數(shù)據(jù)庫分別以疾病名稱“Osteoarthritis”進行檢索，根據(jù)不同的篩選條件總結(jié)歸納，進而得到OA的相關(guān)靶點。將中藥活性成分的作用靶點與OA疾病靶點交互映射，以獲取潛在靶點。

1.4 中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將四妙散4味中藥的名稱、主要活性成分及其靶點的相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入至Cytoscape 3.7.2軟件以繪制中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 建潛在靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) 將四妙散作用于OA的潛在靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置蛋白質(zhì)種類為“homo sapiens”，其他參數(shù)默認，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)模型，其中自由度（Degree）表示與該節(jié)點直接連接的節(jié)點數(shù)目。利用Cytoscape 3.7.2進行網(wǎng)絡(luò)拓撲屬性分析，以篩選出四妙散治療OA的關(guān)鍵靶點。在STRING數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入33個潛在靶點以繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。圖中圓點代表靶點，若顏色越深，形狀越大，則代表該節(jié)點與其他節(jié)點之間的連線越多，關(guān)系越密切。

1.6 基因本體（GO）富集分析與京都基因和基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析 DAVID數(shù)據(jù)庫作為一種基因注釋工具，可充分發(fā)掘基因與疾病間的相關(guān)性，并對相關(guān)基因進行富集分析[26]。利用該數(shù)據(jù)庫對四妙散治療OA的潛在靶點進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路富集分析，找出其關(guān)鍵通路。

2 結(jié)果

2.1 中藥活性成分及藥物靶點的篩選結(jié)果 共檢索到四妙散中黃柏、蒼術(shù)、薏苡仁、牛膝的活性成分分別為140、49、38、176個，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為篩選條件，共獲取活性成分67個，其中黃柏38個，蒼術(shù)9個，薏苡仁9個，牛膝21個。靶點預(yù)測發(fā)現(xiàn)，黃柏736個、蒼術(shù)68個、薏苡仁87個、牛膝444個，去除重復(fù)靶點后共獲得84個。

2.2 OA相關(guān)靶點檢索結(jié)果 通過TTD、Drugbank、CTD、Gencards、OMIM、PharmGKB、GAD、KEGG數(shù)據(jù)庫分別檢索到10、14、384、76、65、1、63、2個靶點，合并及刪除重復(fù)靶點后共獲得524個重要靶點。

2.3 中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 將四妙散活性成分靶點與OA靶點進行映射，獲得四妙散治療OA的33個潛在靶點，以韋恩圖的形式展示。見圖1。通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，從中可見該網(wǎng)絡(luò)共有155個節(jié)點，包括4個藥物、67個活性成分及84個靶點節(jié)點，共有1 384條邊。Degree值前10位的活性成分主要有MOL000098（槲皮素）、MOL000449（豆甾醇）、MOL000358（β-谷甾醇）、MOL000173（漢黃芩素）、MOL000785（非洲防己堿）等。見表2。此外，每個活性成分平均與20.66個靶點互相作用，而每個靶點平均與15.56個活性成分互相作用。見圖2。

2.4 潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果 共有33個節(jié)點，274條邊，Degree均值為16.61，其中大于Degree均值的靶點共有15個。見圖3。網(wǎng)絡(luò)中的10個關(guān)鍵節(jié)點可能在四妙散治療OA中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。見圖4。

2.5 GO功能富集及KEGG信號通路富集分析結(jié)果共得到211條GO富集條目（P<0.05），其中包括153個生物過程（Biological Processes，BP）、20類細胞組分（Cell Components，CC）和38種細胞功能（Molecular Function，MF）。BP主要富集在RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、凋亡過程、基因表達等;CC方面，在胞質(zhì)核周區(qū)、線粒體、核質(zhì)、胞外區(qū)、質(zhì)膜基因富集占比較高;MF方面主要富集在血紅素結(jié)合、類固醇激素受體活性、蛋白質(zhì)同二聚體活性、序列特異性DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄活性等。見圖5。

共富集到與OA相關(guān)的KEGG信號通路79條，其中P<0.05的信號通路共有70條。其中主要顯著在癌癥途徑、TNF信號通路、恰加斯病、甲型流感、利什曼病、百日咳、沙門菌感染、破骨細胞分化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎通路、HIF-1信號通路、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路等。KEGG通路富集前20位（按P值排列）。見圖6。氣泡圖Y軸英文字母代表KEGG通路名稱，X軸數(shù)字代表基因的百分比，圓圈大小代表富集的基因個數(shù)，顏色代表-Log10 P值，其與富集的程度正相關(guān)。

3 討論

OA是一種以關(guān)節(jié)軟骨退化、骨贅形成、滑膜增生、軟骨下骨囊腫和硬化為特征的退行性關(guān)節(jié)疾病，是導(dǎo)致老年人群關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙的主要原因之一[27]。流行病學(xué)研究表明，55歲和65歲患者的OA發(fā)病率分別為44%～70%和60%～70%[28]。盡管OA的患病率很高，但其發(fā)病機制仍不明確。OA在中醫(yī)古籍中未提及，但根據(jù)其癥狀及表現(xiàn)，將其歸于中醫(yī)“痹證”“骨痹”的范疇。中醫(yī)認為人至中年，肝腎虧虛，筋骨肌肉漸失濡養(yǎng)，寒濕之邪易乘虛而入，滯于筋脈關(guān)節(jié)，引起關(guān)節(jié)腫痛，寒濕日久郁而化熱，進而形成濕熱痹證。故肝腎虧虛是痹證的基本病機，清熱利濕更應(yīng)首當(dāng)其沖，補益肝腎亦不可加重濕熱，因此當(dāng)以清熱利濕為主兼顧補益肝腎[10]。而四妙散可清熱利濕，補益肝腎，是臨床治療濕熱痹癥常用方，已廣泛應(yīng)用證屬濕熱痹癥的關(guān)節(jié)疾病。

本研究初步篩選出四妙散中67個重要活性成分，檢索到四妙散治療骨關(guān)節(jié)炎84個重要靶點，繪制出中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果顯示節(jié)點度值較高的活性成分主要有槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇等。其中槲皮素是一種天然黃酮類化合物，在抑制炎癥介質(zhì)生成、影響炎癥相關(guān)信號通路以及抑制ECM降解等方面起到保護關(guān)節(jié)軟骨的作用，以延緩OA的發(fā)展[29]。豆甾醇、β-谷甾醇皆屬于植物甾醇，Chen等[30]研究發(fā)現(xiàn)豆甾醇在抑制基質(zhì)金屬蛋白酶表達方面具有重要作用，能減少軟骨的降解，具備治療OA的潛力。Choi等[31]研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可明顯抑制NO的合成，減弱巨噬細胞IL-6的活性，從而減少TNF、IL-1等炎癥介質(zhì)的分泌而發(fā)揮其抗炎作用。四妙散治療OA的PPI網(wǎng)絡(luò)圖顯示共有33個靶點蛋白，通過網(wǎng)絡(luò)拓撲分析得到的關(guān)鍵靶點包括TNF、IL6、MAPK1、PTGS2、MAPK8等。有研究證實TNF在關(guān)節(jié)滑膜炎性病變及軟骨基質(zhì)的降解過程中起重要作用[32]。IL6作為炎癥介質(zhì)，通過促進細胞外基質(zhì)更新的速度，進而加快關(guān)節(jié)軟骨細胞退化和凋亡[33]。MAPK1、MAPK8同屬于絲裂原活化蛋白激酶家族，有研究表明MAPK途徑是介導(dǎo)OA軟骨損傷極為重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，其主要機制是利用關(guān)節(jié)炎的特異性炎癥介質(zhì)、生長因子等與細胞膜受體結(jié)合，以激活細胞內(nèi)MAPKs信號通路，引起相關(guān)反應(yīng)，例如MMPs表達增加、軟骨細胞凋亡、軟骨破壞等[34]。PTGS2是一種較為典型的炎癥反應(yīng)基因，在OA的發(fā)病機制中具有一定作用，有研究發(fā)現(xiàn)抑制T型VGCCs可通過降低PTGS2的表達來減弱軟骨細胞的OA樣表型[35]。

GO富集分析結(jié)果表明，四妙散治療OA主要通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，基因表達等生物過程實現(xiàn)的。KEGG信號通路結(jié)果顯示，四妙散主要通過干預(yù)炎癥反應(yīng)、細胞周期、破骨細胞分化等通路治療OA。與炎癥相關(guān)的通路主要是TNF信號通路及NOD樣受體信號通路。TNF是一種細胞因子，可與細胞膜上特異性受體結(jié)合，從而發(fā)揮促進細胞生長、分化、凋亡及誘發(fā)炎癥的作用[36]。有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可通過促進滑膜炎癥和激活軟骨細胞及滑膜成纖維細胞參與OA的發(fā)病機制[37]。在NOD樣受體信號通路中，NOD樣受體作為一種模式識別受體，在自身免疫反應(yīng)起始階段發(fā)揮重要作用，在受到刺激后活化，通過激活Caspase-1蛋白促進細胞的死亡以及炎癥反應(yīng)，從而進一步激活MAPK途徑，影響軟骨細胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄及修飾，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)基質(zhì)的降解和關(guān)節(jié)炎癥[38]。干預(yù)細胞周期相關(guān)的HIF-1通路，在骨發(fā)育、再生與成骨結(jié)合過程中起著至關(guān)重要的作用，可介導(dǎo)軟骨細胞對缺氧的反應(yīng)，促進細胞外基質(zhì)合成和抑制凋亡，在軟骨內(nèi)穩(wěn)中起關(guān)鍵作用[39]。Toll樣受體（TLRs）是一類天然免疫受體，在軟骨細胞中可表達，其中TLR4是最主要受體，在OA的進展中具有重要作用[40]，錢臣和卞曉星[41]發(fā)現(xiàn)TLR4的表達活化與軟骨細胞的凋亡有密切聯(lián)系。此外，其他顯著性較高的通路，如癌癥通路、美洲錐蟲病等通路也可能成為四妙散治療OA的重要通路，但相關(guān)文獻較少，仍待進一步探索，可能成為今后研究的重點。

本研究為開展四妙散的臨床應(yīng)用和科學(xué)研究提供了重要參考，證明了四妙散中多種成分可以作用于同一靶點，一種成分同樣可以通過不同靶點起作用，充分體現(xiàn)了四妙散治療OA具有“多成分、多靶點、多通路”的特點。但是四妙散成分多樣、作用機制復(fù)雜，本研究僅通過數(shù)據(jù)庫的檢索來分析四妙散治療OA的活性成分及可能作用機制，尚未進行進一步的實驗驗證，具有一定局限性，而后仍需大量的臨床及實驗研究證實。

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（2020-10-18收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）