摘要：腸球菌（Enterococci）作為條件性致病菌廣泛存在于人和動物中，其耐藥性和致病性隨地區(qū)和動物來源的不同而變化。據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)顯示，關(guān)于武漢市馬源腸球菌的耐藥性研究相當匱乏。以武漢市2個馬術(shù)俱樂部42匹溫血馬為主要研究對象，分別對馬匹糞便進行樣品搜集并進行耐藥研究（氨芐西林，四環(huán)素，慶大霉素，頭孢氨芐，恩諾沙星，氯霉素，諾氟沙星，紅霉素，萬古霉素、林可霉素等）。結(jié)果顯示，從42份樣本中分離出10株糞腸球菌，分離率為23.8%;藥敏試驗結(jié)果顯示，分離株中有6株為慶大霉素耐藥，6株為頭孢類抗生素耐藥，2株為慶大霉素和頭孢類抗生素混合耐藥，其他藥物未產(chǎn)生耐藥性。結(jié)果表明該俱樂部馬源腸球菌已對慶大霉素和頭孢類抗生素產(chǎn)生嚴重耐藥性，試驗為該馬術(shù)俱樂部用藥提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：馬源腸球菌（Enterococcus）;耐藥性;武漢市

中圖分類號：S852.61+1? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? 文章編號：1007-273X（2021）07-0017-03

腸球菌（Enterococcus）為觸媒陰性、單個或鏈狀排列的格蘭氏陽性球菌，是人及動物微生物群中正常存在的一部分，一般不會引起發(fā)病，屬于條件性致病菌[1，2]。有學者報道，腸球菌屬菌種有19個，主要有鳥腸球菌（E. avium）、病臭腸球菌（E. malodoratus）、棉子糖腸球菌（E. raffinosus）、糞腸球菌（E. faecalis）、屎腸球菌（E. faecium）、鉛黃腸球菌（E. casseliflavus）、蒙氏腸球菌（E. mundtii）、殊異腸球菌（E. dispar）、盲腸腸球菌（E. cecorum）和孤立四聯(lián)球菌（E. Solitarius）等，至2003年確定的腸球菌屬已增至31種[3]。在正常人群中，堅忍腸球菌（E. durans）和海氏腸球菌（E. Hirae）攜帶率分別為18%和9%。而在家畜中，堅忍腸球菌主要存在于牛及仔雞中。腸球菌的分布隨地區(qū)不同而不同，在西班牙臨床上主要的腸球菌種為糞腸球菌與屎腸球菌，而在瑞典等國家主要為屎腸球菌和海氏腸球菌。腸球菌一直被認為是非致病性陽性菌存在，臨床風險很小，但近年來很多研究發(fā)現(xiàn)腸球菌是導(dǎo)致外科傷口、血液、泌尿道、腦膜和血管感染的主要醫(yī)院病原體[4]，目前，由腸球菌引起的菌血癥及心內(nèi)膜炎已在醫(yī)院廣泛存在，其中糞腸球菌是主要病原體，其次是屎腸球菌，而其他腸球菌種很少見發(fā)病。

腸球菌細胞壁較厚，故對多種藥物具有天然耐藥性，但也更易被誘導(dǎo)產(chǎn)生新的耐藥性。近年來，由于抗生素在臨床上的廣泛使用，腸球菌耐藥菌株不斷增多。至今萬古霉素的耐藥菌株已廣泛存在，某些抗生素甚至達到完全耐藥，且有研究表明，腸球菌攜帶的耐藥基因可在人和動物之間進行傳播，給臨床治療帶來了很大難題，對動物及人類健康造成了嚴重威脅。然而，根據(jù)武漢馬術(shù)協(xié)會數(shù)據(jù)顯示，歷年來武漢馬術(shù)俱樂部及相關(guān)工作人員的數(shù)量呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢，這無疑增加了人畜共患病原體的傳播風險。由于武漢市馬源腸球菌的耐藥性調(diào)查數(shù)據(jù)極其缺乏，鑒于此，本研究對武漢馬術(shù)俱樂部進行隨機抽查，對其腸球菌分離和耐藥情況進行調(diào)查，旨在為當?shù)伛R匹疾病的防治提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以武漢市2個馬術(shù)俱樂部為主要研究對象，分別對42匹溫血馬匹進行糞便樣品采集，于-20 ℃保存。采樣時認真記錄編號，并調(diào)查俱樂部飼養(yǎng)管理、既往病史、役用及用藥情況。

1.2 試驗方法

1.2.1 腸球菌的分離及初步鑒定 腸球菌的初步分離按照鏈球菌培養(yǎng)方式進行。樣品做預(yù)處理后，置于含20%兔血清的營養(yǎng)肉湯中進行培養(yǎng)，過夜后蘸取菌液接種于TSA培養(yǎng)基中，24 h后觀察菌落形態(tài)。表面扁平、光滑并呈灰白色菌落初步定為可疑菌落，并對可疑菌落進行格蘭式染色（陽性球菌）、觸酶試驗（陰性者為腸球菌）、16 sDNA基因擴增等進行鑒定。

1.2.2 腸球菌耐藥性研究 對“1.2.1”中的菌株進行KB紙片擴散試驗，結(jié)果根據(jù)CLSI《美國臨床實驗室標準化協(xié)會》標準進行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離鑒定結(jié)果與分析

對2個馬術(shù)俱樂部共計42份樣本分離出的10個菌株樣品分別進行革蘭氏染色（圖1）、生化試驗（表1）和觸酶試驗鑒定，結(jié)果初步鑒定為糞腸球菌，分離率為23.8%。

對初步鑒定為腸球菌菌株再次進行16sDNA PCR擴增（圖2），進一步確定為腸球菌。對16s DNA擴增引物測序并進行Blast對比分析，結(jié)果見圖3。由圖3可見，H8樣本與糞腸球菌同源性最高。

2.2 耐藥性試驗結(jié)果

將所有分離菌株進行KB紙片擴散試驗，結(jié)果顯示10株腸球菌菌株中有6株為慶大霉素耐藥（60%），6株為頭孢類抗生素耐藥（60%），2株為慶大霉素和頭孢類抗生素混合耐藥（20%），且據(jù)馬主陳述，采樣之前3個月內(nèi)均未使用抗生素進行治療。具體結(jié)果見表2和圖4。

3 小結(jié)與討論

腸球菌是革蘭氏陽性兼性厭氧菌。曾被認為是非致病性共生體，臨床風險很小。最近調(diào)查顯示，腸球菌是引起人類醫(yī)院感染的第二大革蘭氏陽性細菌，是導(dǎo)致手術(shù)傷口、尿路、腦膜和心內(nèi)膜感染的主要醫(yī)源病原體[5]。腸球菌對低至高水平的幾種抗菌素本能具有耐藥性，包括內(nèi)酰胺、頭孢菌素、氨基糖苷類和林可亞胺[6]。醫(yī)院感染率的增加可部分歸因于人類醫(yī)院大量使用抗菌素和腸球菌耐藥（AR）菌株的發(fā)展[7]。然而，馬源腸球菌研究相當匱乏[8]。

本試驗結(jié)果顯示，武漢市2個馬術(shù)俱樂部糞腸球菌分離率為23.8%，與韓國賽馬管理局統(tǒng)計數(shù)據(jù)和其他動物如藏豬分離率相比均較低[9]，這可能與本試驗采樣點局限性有關(guān)。

本試驗結(jié)果說明2個馬術(shù)俱樂部馬源腸球菌耐藥率較高，其中慶大霉素和頭孢氨芐耐藥率均達到60%，而混合耐藥率為20%（慶大霉素和頭孢氨芐）。本次試驗結(jié)果耐藥率較高，雖可能跟樣本數(shù)量有關(guān)，但仍需引起注意。本次試驗結(jié)果耐藥性與藏豬源腸球菌耐藥結(jié)果相似[9]，但與韓國馬源耐藥率（70.6%）相比較低，與葡萄牙部分地區(qū)馬源腸球菌耐藥性相比則較高（8.8%）[10，11]。

綜上所述，這是首次對武漢市馬術(shù)俱樂部腸球菌進行采樣耐藥研究。結(jié)果顯示，腸球菌優(yōu)勢種為糞腸球菌，且耐藥性較為嚴重。通過韓國研究者報道顯示，耐藥性腸球菌在馬之間或馬與其環(huán)境之間可以傳播，這意味著從馬傳播到人類尤其是成為騎手、馬工等馬業(yè)工作者的潛在風險。因此，筆者后期將繼續(xù)研究武漢市馬源腸球菌與周圍環(huán)境之間的關(guān)系。

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