高婷 袁芳艷 劉澤文 劉威 周丹娜 楊克禮 郭銳 梁婉 陳文杰 田永祥

摘要：為比較豬鏈球菌中g(shù)idA缺失菌株與野生菌株氨基酸代謝之間的差異，揭示GidA調(diào)控氨基酸代謝的規(guī)律，為豬鏈球菌致病性的解析以及防控提供理論依據(jù)，分別收集gidA缺失菌株、野生菌株菌體，采用高效液相色譜法（HPLC）、質(zhì)譜儀在正離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析，檢測(cè)樣本中30種氨基酸及其衍生物的含量，比較gidA缺失菌株、野生菌株菌體中氨基酸代謝譜的差異。結(jié)果表明，2種菌株中精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、丙氨酸、纈氨酸、色氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、肌酸酐及鳥氨酸具有顯著差異（P<0.05，倍數(shù)差異>1.2），其中精氨酸上調(diào)約4倍，天冬酰胺下調(diào)約17倍。說明tRNA修飾酶GidA缺失引起豬鏈球菌氨基酸代謝異常，尤其是精氨酸與天冬酰胺，其機(jī)制可能與豬鏈球菌致病性下降相關(guān)。

關(guān)鍵詞：豬鏈球菌;tRNA修飾酶;GidA;氨基酸代謝

中圖分類號(hào)：S858.28? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? 文章編號(hào)：1007-273X（2021）07-0010-03

豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是一種重要的人獸共患傳染病病原菌，不僅感染豬還感染人，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致敗血癥型休克甚至死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，也威脅著人類的身體健康和生命安全[1-3]。tRNA修飾酶葡萄糖抑制分裂蛋白A（Glucose inhibited division protein A，GidA）是全局性的調(diào)控因子，對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)以及致病性具有重要的調(diào)控作用[4]，然而GidA蛋白對(duì)豬鏈球菌的氨基酸代謝譜的影響尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)，以標(biāo)準(zhǔn)品為參照，對(duì)特定氨基酸代謝物群進(jìn)行有針對(duì)性、特異性的檢測(cè)與分析，發(fā)現(xiàn)GidA對(duì)豬鏈球菌的氨基酸代謝譜產(chǎn)生了嚴(yán)重的擾動(dòng)，尤其是精氨酸，而精氨酸代謝又與豬鏈球菌致病性相關(guān)。毒力因子ADS 是精氨酸代謝的重要途徑，廣泛存在于原核生物體內(nèi)。ADS主要由精氨酸脫亞氨ArcA、ArcB 和ArcC 3種核心酶組成，通過上述核心酶的作用最終將精氨酸催化降解生成鳥氨酸、二氧化碳、氨和ATP，為細(xì)菌提供能量以及增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)酸性環(huán)境的適應(yīng)性。因此，本研究為豬鏈球菌致病性的解析以及防控提供了新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器和試劑

試驗(yàn)儀器：5500 QTRAP質(zhì)譜儀（AB SCIEX），Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng)，低溫高速離心機(jī)（Eppendorf 5430R），色譜柱Zic-HILIC 3.5 ?m，2.1 mm×150 mm Column。

試劑：甲酸（Fluka，06450），乙腈（Merck，1499230-935），甲醇（Merck，144282），所有氨基酸及其衍生物的標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自Sigma-Aldrich。

1.2 代謝物提取

取細(xì)菌菌體樣本，每個(gè)樣本中加入1 mL 預(yù)冷甲醇/乙腈/水（2∶2∶1，V/V/V），轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，渦旋混合，冰浴中超聲30 min，-20 ℃孵育1 h用于沉淀蛋白，14 000 r/min 4 ℃離心20 min，取上清，真空干燥。質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)加入100 μL乙腈-水溶液（1∶1，V/V）復(fù)溶，14 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清進(jìn)樣分析。每組另取樣本適量，等量混合為質(zhì)控（Quality control，QC）樣本。QC樣本按照上述方法平行進(jìn)行制備。

1.3 高效液相色譜條件

樣品采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離。流動(dòng)相：A液為含0.08% FA 25 mmol/L甲酸銨水溶液，B液為0.1% FA乙腈。樣品置于4 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器中，柱溫40 ℃，流速為250 μL/min，進(jìn)樣量2 μL。相關(guān)液相梯度如下：0～12 min，B液從 90%線性變化到70%;12～18 min，B液從70%線性變化到50%;18～25 min，B液從50%線性變化到40%，30.0～30.1 min，B液從40%線性變化到90%;30.1～37.0 min，B液維持在90%。樣本隊(duì)列中每間隔一定數(shù)量的樣本設(shè)置一個(gè) QC 樣本，用于檢測(cè)和評(píng)價(jià)系統(tǒng)的穩(wěn)定性及重復(fù)性。

1.4 質(zhì)譜分析

采用5500 QTRAP 質(zhì)譜儀（AB SCIEX）在正離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析。5500 QTRAP ESI 源條件如下：Source temperature 500 ℃，Ion source gas1（Gas1）：40，Ion source gas2（Gas2）：40，Curtain gas（CUR）：30，Ion sapary voltage floating（ISVF）5500 V;采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)待測(cè)離子對(duì)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Multiquant軟件提取色譜峰面積及保留時(shí)間。采用氨基酸及其衍生物的標(biāo)準(zhǔn)品矯正保留時(shí)間，進(jìn)行代謝物鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 △gidA缺失菌株與野生菌株SC19氨基酸及其衍生物多反應(yīng)監(jiān)測(cè)結(jié)果

樣本中共檢測(cè)到23種氨基酸及其衍生物，以△gidA與SC19定量比較，其中精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、丙氨酸、纈氨酸、色氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、肌酸酐以及鳥氨酸具有顯著差異（P<0.05，倍數(shù)差異>1.2），其中精氨酸上調(diào)約4倍，天冬酰胺下調(diào)約17倍，詳細(xì)定量數(shù)據(jù)見表1。

2.2 氨基酸代謝組聚類分析

為了評(píng)價(jià)候選氨基酸的合理性，同時(shí)更全面直觀地顯示樣本之間的關(guān)系以及氨基酸在不同樣本中的表達(dá)模式差異，利用定性的顯著性差異氨基酸的表達(dá)量對(duì)各組樣本進(jìn)行層次聚類分析，結(jié)果見圖1。由圖1可見，精氨酸上調(diào)顯著，天冬酰胺下調(diào)顯著（紅色代表顯著性上調(diào)氨基酸，藍(lán)色代表顯著性下調(diào)氨基酸）。

2.3 系統(tǒng)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

所有樣品等量混合制備成為QC樣本，采用QC樣本對(duì)實(shí)驗(yàn)過程儀器系統(tǒng)的穩(wěn)定性和重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果見圖2。由圖2可見，檢測(cè)氨基酸及其衍生物在QC樣本中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于30%，說明實(shí)驗(yàn)過程儀器系統(tǒng)穩(wěn)定、數(shù)據(jù)可靠。

3 小結(jié)與討論

氨基酸對(duì)于維持細(xì)菌正常的生理功能至關(guān)重要，氨基酸代謝的異常對(duì)細(xì)菌的適應(yīng)性、耐藥性及致病性影響重大[5]。細(xì)菌在宿主體內(nèi)對(duì)酸性環(huán)境的耐受性與存活、定殖、感染、組織炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，而精氨酸代謝途徑通過產(chǎn)生氨來增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)酸性環(huán)境的適應(yīng)性，并且已有文獻(xiàn)證實(shí)精氨酸代謝途徑與細(xì)菌的致病性有關(guān)[6-8]。Khoury 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在補(bǔ)充谷氨酰胺以后，肺炎鏈球菌在青霉素作用下的存活率提高，表明谷氨酰胺降低了細(xì)菌對(duì)青霉素的敏感性。豬鏈球菌是一種人畜共患病原菌，根據(jù)莢膜多糖的差異，可分為33個(gè)血清型，其中2型是毒力最強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)血清型[10]，然而豬鏈球菌2型的氨基酸代謝研究尚未見有人涉及。本研究采用靶向氨基酸代謝組學(xué)技術(shù)，分析了tRNA修飾酶GidA對(duì)豬鏈球菌氨基酸代謝譜的影響，篩選到精氨酸、天冬酰胺等顯著改變的氨基酸，揭示了GidA調(diào)控氨基酸代謝的規(guī)律，為豬鏈球菌致病性的解析以及防控提供了理論依據(jù)。

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