石曉雯，孫巖，丁娜，孫惠英，王婷，賈小云*，李潤植*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西 太谷 030801； 2.山西省農(nóng)科院果樹研究所,山西 太谷 030800)

銀杏MYB轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及特征分析

石曉雯1，孫巖1，丁娜1，孫惠英2，王婷1，賈小云1*，李潤植1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西 太谷 030801； 2.山西省農(nóng)科院果樹研究所,山西 太谷 030800)

[目的]MYB蛋白是真核生物中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，在植物形態(tài)建成、生長發(fā)育、初生和次級代謝產(chǎn)物合成等生命過程中起重要調(diào)控作用。銀杏作為植物中的“活化石”，其提取物中含有的活性成分次生代謝物類黃酮等對人體有益。在類黃酮的生物合成中,MYB轉(zhuǎn)錄因子扮演著重要角色。本研究從轉(zhuǎn)錄組水平詳細鑒定和分析了銀杏GbMYB轉(zhuǎn)錄因子，為今后GbMYB的功能研究奠定基礎(chǔ)，也為其他物種MYB轉(zhuǎn)錄因子的分析提供方法。[方法]本文首先利用BlASTp和PlantTFbcat等生物信息學(xué)工具對銀杏的MYB蛋白序列進行篩選和鑒定；其次運用MEME和MEGA 7.0軟件分別對GbMYB蛋白進行基序和系統(tǒng)進化分析；最后使用MeV對GbMYB在銀杏各組織中的表達水平進行聚類分析。[結(jié)果]從41151個銀杏蛋白中共鑒定出60個MYB轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)MYB保守域的特點將其分為R1-MYB、R2R3-MYB和R1R2R3-MYB三大類。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)60個GbMYB可分為16個亞家族且具有相似功能的蛋白序列通常聚在一個家族。在銀杏GbMYB蛋白中共檢測到21種不同的保守基序。表達譜數(shù)據(jù)分析表明，一些GbMYB基因的表達具有組織特異性。[結(jié)論]本研究利用生物信息學(xué)方法，在銀杏轉(zhuǎn)錄組水平上共鑒定出參與調(diào)控銀杏各個組織發(fā)育的60個GbMYB轉(zhuǎn)錄因子；結(jié)合擬南芥AtMYB家族分類法將GbMYB分為16個亞家族；保守基序分析顯示GbMYB在功能上具有多樣性。研究結(jié)果為全面解析銀杏MYB基因結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能提供了新信息,也為進一步研究銀杏GbMYB轉(zhuǎn)錄因子在次生代謝產(chǎn)物中的調(diào)控功能奠定了基礎(chǔ)。

MYB轉(zhuǎn)錄因子； 銀杏； 類黃酮； 轉(zhuǎn)錄組

轉(zhuǎn)錄因子又稱反式作用因子，是與真核生物基因的順式作用元件結(jié)合并調(diào)控下游基因表達的一類蛋白分子。植物中常見的轉(zhuǎn)錄因子有：NAC、AP2、HD-ZIP、b-ZIP、APF、WRKY、APF、MYB等。MYB是植物中種類最多且功能最重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。MYB家族成員的典型特征是有一段由50～53個氨基酸構(gòu)成的保守性極強的DNA結(jié)合域(即MYB domain，用R表示)。在該結(jié)構(gòu)域中每隔18或19個氨基酸有1個保守的色氨酸(W)，參與疏水核心的組成，對維持MYB轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)象的穩(wěn)定起主導(dǎo)作用。依據(jù)MYB蛋白含有的結(jié)構(gòu)域數(shù)量不同將其分為4類，即R1R2R3-MYB、R2R3-MYB、R1-MYB及4R-MYB[1]。盡管不同的MYB蛋白在結(jié)構(gòu)和序列上存在著相似性和保守性，但功能各異。這種差異會表現(xiàn)在不同物種之間或在同一個體的不同組織器官之間。在植物中發(fā)現(xiàn)的第一個MYB轉(zhuǎn)錄因子是玉米穗基因C1編碼的參與花青素代謝合成的c-myb-like[2]。隨著MYB轉(zhuǎn)錄因子在不同植物中被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，對其功能的研究也日益增多。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)MYB類轉(zhuǎn)錄因子對植物的整個生命過程都具有重要的意義，包括細胞形態(tài)建成[3]、生長發(fā)育[4]、對生物和非生物脅迫的應(yīng)答[5,6]以及植物初生和次生代謝[7]等。

尤其MYB轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控次級代謝產(chǎn)物類黃酮的生物合成在其他植物中多次被報道。Qi[8]和Yuan[9]等人將黃芩MYB轉(zhuǎn)錄因子SbMYB2，SbMYB7和SbMYB8的過表達載體轉(zhuǎn)入煙草后發(fā)現(xiàn)：參與類黃酮生物合成相關(guān)基因的表達量增加，植物的抗氧化性明顯提高。Xu[10]等人發(fā)現(xiàn)銀杏GbMYBF2轉(zhuǎn)錄因子負調(diào)控類黃酮的合成。Yan[11]和PerezDiaz[12]等研究發(fā)現(xiàn)，GmMYB100和VvMYB4-like基因分別負調(diào)控大豆和葡萄中黃酮類化合物的合成。在蘋果中，Espley[13]等發(fā)現(xiàn)MdMYB1和MdMYB2與果皮中花青素的合成有關(guān)，而MdMYB10調(diào)控蘋果果實中花青素的合成。

銀杏(GinkgobilobaL)屬于古老的孑遺植物，已有2.7億年的生活史，是非開花植物中唯一存活的代表，素有“活化石”的美稱[10]，其典型的扇形葉性狀已保留了數(shù)百萬年，這種情況在其他幸存的植物物種中很少存在，因此銀杏在植物進化史中擁有非常獨特的地位。銀杏生命力極強，對真菌、蟲害和病毒等具有較強的抗性。在草本植物中，銀杏葉提取液中含有6%的萜內(nèi)酯類化合物和24%的類黃酮化合物[14]，在全球極為暢銷，具有很高的藥用價值。類黃酮有很高的抗氧化能力，對心血管疾病和癌癥有防治作用。植物中類黃酮來源于苯丙酸合成途徑的一個分支，其合成途徑主要受一些酶基因和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。因此，弄清銀杏類黃酮分子代謝途徑，發(fā)現(xiàn)并鑒定類黃酮代謝過程中起調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子進而揭示其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，有利于對藥用植物的進一步開發(fā)和利用[15]。

本研究通過對藥用植物數(shù)據(jù)庫中銀杏的蛋白序列進行生物信息學(xué)分析，共鑒定出60個銀杏GbMYB轉(zhuǎn)錄因子，并依據(jù)其所含有的MYB domain 數(shù)目將其分為3類。通過對銀杏MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進行基序、聚類分析、系統(tǒng)進化以及表達分析，為今后進一步解析銀杏MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)，也為其他物種的MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究提供方法。

1 材料與方法

1.1 蛋白序列的收集與整理

銀杏(GinkgobilobaL.)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)的蛋白序列分別從藥用植物數(shù)據(jù)庫(Medicinal Plant Genomics Resource,http://medicinalplant genomics.msu.edu/)和擬南芥信息資源數(shù)據(jù)庫(The Arabidopsis Information Resource,http://www.arabidopsis.org/)中下載。將獲得的蛋白序列用Notepad++軟件進行編輯。若某蛋白有不同的序列，選擇最長的氨基酸序列。并將蛋白序列的編號進行了簡化處理，如>gba_locus_10001簡記為>gba10001。然后將編輯好的蛋白序列拷貝到Excel文件中，作為后續(xù)分析的蛋白序列數(shù)據(jù)庫。

1.2 銀杏GbMYB轉(zhuǎn)錄因子的篩選、鑒定和驗證

將NCBI數(shù)據(jù)庫中已知的銀杏MYB蛋白進行序列比對，得到一段由104個氨基酸組成的高度保守的GbMYB片段。用該片段對上述編輯好的銀杏蛋白數(shù)據(jù)庫中的序列進行BLASTP比對，初步確定MYB轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)目。為保證獲得的MYB轉(zhuǎn)錄因子的準(zhǔn)確性，將上述所鑒定的蛋白序列提交至CDD (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)數(shù)據(jù)庫進行鑒定。最后，將含有MYB功能域的序列在PlantTFbcat (http://plantgrn.noble.org/ PlantTFcat/)中進行比對分析，進一步驗證其是否屬于MYB類轉(zhuǎn)錄因子。

1.3 銀杏GbMYB轉(zhuǎn)錄因子的分類與結(jié)構(gòu)域基序分析

對驗證正確的MYB蛋白序列進行SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) 批量搜索[16]，根據(jù)所含有的DNA-binding domain的數(shù)量對其進行分類。利用MEGA 7.0對銀杏中數(shù)量最多的R2R3-MYB類蛋白序列進行比對，并保存比對結(jié)果。然后將得到的比對結(jié)果刪除不保守區(qū)域后，利用weblogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)對R2R3-MYB的DNA domain進行結(jié)構(gòu)域特征分析[17]。

1.4 銀杏MYB轉(zhuǎn)錄因子保守基序組成

GbMYB蛋白基序用MEME 4.8.0 (http://meme.nbcr.net/meme/intro.html)在線軟件進行分析[18]。具體參數(shù)為：基序位點數(shù)量1～50；基序重復(fù)次數(shù)為any；每個基序的長度為6～70個氨基酸殘基；預(yù)測基序的數(shù)量最多為21個。

1.5 銀杏R2R3-MYB家族進化分析

為進一步研究銀杏MYB 轉(zhuǎn)錄因子的功能，運用MEGA7.0軟件采用鄰近法(Neighbor-Joining)構(gòu)建包含125個擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子及55個銀杏MYB轉(zhuǎn)錄因子(其中有五條序列由于同源性相差太大，剔除)的系統(tǒng)發(fā)育樹。其中Model設(shè)置為p-distance, Bootstrap值設(shè)為3 000，其余參數(shù)設(shè)為默認。

1.6 銀杏GbMYB表達分析

銀杏轉(zhuǎn)錄組測序的表達數(shù)據(jù)從MPGR數(shù)據(jù)庫下載。GbMYB基因在根、熟果、幼果、葉和莖中表達數(shù)據(jù)系統(tǒng)聚類及其表達模式分析選用MeV4.9.0軟件，聚類結(jié)果中紅色和綠色分別表示與對照相比表達上調(diào)和下調(diào)的GbMYB基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏MYB轉(zhuǎn)錄因子的鑒定

為鑒定銀杏GbMYB轉(zhuǎn)錄因子，首先從藥用植物數(shù)據(jù)庫中檢索到41 511個單拷貝蛋白序列。然后用已知的銀杏MYB蛋白與前面得到的序列進行比對，經(jīng)BLASTP鑒定得到191條含有MYB結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。最后，去除短序列及冗余轉(zhuǎn)錄本序列后，剩余蛋白序列進一步經(jīng)NCBI在線保守域分析和PlantTFbcat轉(zhuǎn)錄因子軟件鑒定，最終得到銀杏MYB蛋白序列共60條。

2.2 銀杏MYB蛋白序列的分類與結(jié)構(gòu)域特征分析

對得到的60條銀杏MYB蛋白序列進行批量SMART搜索后按照所含有的 DNA binding domain的數(shù)量進行分類。含有1個DNA binding domain的MYB為R1-MYB，同理含有2個 DNA binding domain的MYB 為R2R3-MYB 類轉(zhuǎn)錄因子，含有3個DNA binding domain 的MYB為R1R2R3-MYB 類轉(zhuǎn)錄因子，如圖1。共鑒定出 R1-MYB 12個，R2R3-MYB 47個，R1R2R3-MYB 1個，而沒有發(fā)現(xiàn)包含4R-MYB類的轉(zhuǎn)錄因子。

圖1 銀杏MYB 轉(zhuǎn)錄因子分類示意圖Fig.1 Classification of GbMYB transcription factors W: 色氨酸殘基;X: 其它氨基酸殘基；F: 苯丙氨酸殘基; I: 異亮氨酸殘基。W: Tryptophane; X: Other amino acid; F: Phenylalanine; I: Isoleucine.

利用weblogo在線分析軟件對銀杏中數(shù)量最多的R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域進行特征分析。氨基酸出現(xiàn)頻率越大在圖中對應(yīng)位點的字母長度越高，表明氨基酸殘基越保守(圖2)。在長度約為51個氨基酸殘基的R2結(jié)構(gòu)域中含有3個高度保守的色氨酸殘基(分別位于第4位、24位和44位)，且每個色氨酸殘基間隔18～19個氨基酸(圖2)。在R3結(jié)構(gòu)域中第一個色氨酸殘基往往會被苯丙氨酸(F)所替代(圖2中第57位)，第2個和第3個色氨酸殘基仍具有高度保守性(圖中第76位和95位)。這些都與其他物種已鑒定出的MYB結(jié)構(gòu)域的特點一致[19]。除了高度保守的色氨酸殘基外，R2和R3結(jié)構(gòu)域中也存在大量其他的保守氨基酸殘基，如在結(jié)構(gòu)域起始位置的賴氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)以及在R2結(jié)構(gòu)域中的GKSCRL序列和R3結(jié)構(gòu)中存在LPGRTDN序列。這些保守氨基酸殘基可能與色氨酸殘基共同維持MYB轉(zhuǎn)錄因子形成的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，進而保證能與DNA分子大溝結(jié)合行使其功能。

圖2 銀杏R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域特征示意圖Fig.2 Structural characteristics of R2R3-MYB DNA binding domain of Ginkgo biloba

2.3 銀杏MYB轉(zhuǎn)錄因子的聚類分析

為鑒定GbMYB的功能，采用Neighbor-Joining法分析55個銀杏MYB蛋白和125個擬南芥MYB蛋白序列之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。依據(jù)Dubos[20]對擬南芥MYB蛋白的分類方法，將銀杏MYB蛋白序列分為16個亞家族G1-G16(圖3)。在這16個亞家族中G8亞家族含有的成員數(shù)目最多，共有8個GbMYB，而G7亞家族僅含有一個GbMYB。本研究發(fā)現(xiàn)銀杏中的G8亞族與擬南芥S7亞族可聚成一類，Stracke[21]的研究表明擬南芥S7亞族中的成員(AtMYB11、AtMYB12和AtMYB111)可參與調(diào)控黃酮類化合物的合成；Huang[22]等人通過實驗證實傳統(tǒng)中藥材淫羊藿中與AtMYB111聚在一類的EsMYBF1同樣能調(diào)控類黃酮的合成。同樣在Nakatsuka[23]等人的研究中也發(fā)現(xiàn)與擬南芥S7亞族成員有較高親緣性的GtMYBP3、GtMYBP4參與調(diào)控龍膽花中黃酮類化合物的生物合成。因此，我們推測銀杏G8亞族與擬南芥S7亞族可能具有相同的功能。銀杏G1、G4、G3亞家族與擬南芥中發(fā)育相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子[24～26]聚在一起，推測這幾類GbMYB可能與銀杏的細胞發(fā)育相關(guān)。G15和G12亞族可能與銀杏的非生物脅迫有關(guān)，因為與G15聚在一起的AtMYB60和AtMYB96通過ABA信號途徑調(diào)控氣孔移動分別響應(yīng)干旱和病害脅迫[27～29]，而與G12聚成一族的AtMYB15參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑響應(yīng)冷害脅迫[30]。

2.4 銀杏GbMYB基序組成分析

MYB轉(zhuǎn)錄因子含有很多的保守序列，如圖2中R2和R3結(jié)構(gòu)域中保守的氨基酸殘基，這些保守序列可能與DNA分子的某些部位相結(jié)合，在表達調(diào)控過程中起重要作用。為識別銀杏GbMYB家族中潛在的保守基序，我們通過MEME在線分析軟件對GbMYB蛋白序列進行了基序組成分析，如圖4中所示：共鑒定出21個保守基序(表1)。Motif 1是MYB蛋白N端結(jié)構(gòu)域，幾乎存在于所有的銀杏GbMYB中(圖4)。相對N端來說，C端的Motif的易變性較高，每條序列不盡相同，大約有18到250個核苷酸的差異，這些特異性的基序預(yù)示著不同亞族可能具有不同的功能[31]。位于同一進化分支的GbMYB蛋白含有相同的保守基序種類且位置大體一致，推測這些轉(zhuǎn)錄因子的功能可能相似。不同進化分支中GbMYB蛋白保守基序種類和位置差異較大。gba196、gba57103、gba3518沒有與其他的任何GbMYB蛋白序列聚到一起，他們的基序組成也與其他分支的蛋白序列存在較大差異(圖4)。銀杏GbMYB基序組成分析結(jié)果也表明了同一亞族的蛋白序列在結(jié)構(gòu)上是保守的。

圖3 銀杏和擬南芥MYB蛋白聚類分析Fig.3 Cluster analysis of MYB protein from Ginkgo biloba and Arabidopsis thaliana

2.5GbMYB基因的表達分析

為進一步了解銀杏GbMYB轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能，我們使用Mev軟件對GbMYB在根、莖、葉、幼果、熟果中的表達進行了聚類分析并繪制熱圖。如圖5所示，有16個GbMYB在葉片組織中的表達量較高，7個GbMYB在莖中的表達量較高，11個GbMYB在根中表達較高，3個GbMYB基因在根和莖中都有表達，11個GbMYB在熟果中沒有檢測到表達量。以上不同GbMYB基因在不同組織中的差異表達情況表明GbMYB轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控銀杏各個組織的發(fā)育。

3 討論

MYB蛋白是植物中數(shù)量最多的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，現(xiàn)已在多種植物中被鑒定出來，如：擬南芥、水稻、玉米和大豆[32]。通常，MYB轉(zhuǎn)錄因子依據(jù)所含的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的個數(shù)可被分為R1-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和4R-MYB四類。而在植物中最常見的是R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是目前研究最多的，也是生物體最重要的調(diào)控方式。本研究首次在轉(zhuǎn)錄組水平上利用PlantTFbcat和BLASTp在線軟件對銀杏MYB轉(zhuǎn)錄因子進行了鑒定和篩選。我們共鑒定出60個MYB轉(zhuǎn)錄因子，其中1R-MYB類成員的數(shù)目占20%，R2R3-MYB類占78%，而R1R2R3-MYB類只含有1個，而沒有4R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子，這種分布比例與擬南芥、小麥和玉米等基本相似[33]。但是從總數(shù)上來說本研究鑒定的GbMYB蛋白相對較少，可能是因為本次分析是在銀杏的轉(zhuǎn)錄組水平，可用的基因組信息量較少，所以導(dǎo)致一些GbMYB未被鑒定。對47條銀杏R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的保守域基序分析表明其含有MYB家族典型的DNA binding domain。

圖4 銀杏GbMYB蛋白序列的MEME保守基序及進化分析Fig.4 Phylogenetic analyses of conserved motifs of GbMYB

MOTIFWIDTHSITESMultilevelconsensussequenceE?value13548NYLRPD[ILV]KRGN[FI][ST]PEE[ED]QLII[QR][LA]HA[LI]LGN[RK]W[SA]LIA27e?94221545PGRTDN[EA]IKN[YH]WN[TS][HT]71e?49631545AG[LP][LG]RCGKSCRLRW[IT]60e?44642150W[TS][PA]EEDXKL[IV][AK][YL][IV][EQ]K[HY]G[HE][GR][NC]W23e?48451524MGR[ASH]PCC[DES]K[QV][GK]L[KN][KR]G25e?17362022[LI]KK[KR]L[LR]Q[MR]GIDP[VK]TH[KR]P[LI]SD83e?1457246[WR]K[KI][IS][AER][AN]FV[PG]S[KR][ST][PV][IT]Q[IV][AR]SHAQKYF14e?2308194[GA][GD][FL]L[AGS][IL]MREM[IV]AKEV[QH][NKS]Y[MI]57e?2109294[NFP]GY[LIM][KR]A[DE][ED]A[MV][ETV][MW]MS[AEST]A[VI][KN][MS][ATV][VL][AGT]Q[AT][LI][APS][LP][IMV][FL]19e?17010617R[AS]LPKK38e?13011494[DQ][ADEN][KG][NST][NIS][NDE][QP][SK][RIY][HKW][QHR][KR][QKP]K[MY][AKQR][VAM]R[KN][ACS][AV][QNP][DH]S[TA][IG][MS][QEP][QHR][EG][IL][LIV][EDK]N[RG][EGN][ILNY][VAF][SP][VAS][PLS][ND][TA][EK][NDT][LP][PL][EV]E48e?13012292IRKPYTITKSRESWTEQEHDKFLEALQLF18e?09013166[NQ][LI][HI]RPVPRLSAFX[CS][YF][NS]31e?09014154[HM][MKS]A[QH]W[EA][NST]ARLEA[EL][AST]R45e?09015502FDP[GS][TV][ST]SHLKKLKEM[AD]PID[LR]ET[IV][LV]LLMRNL[AS]INLSSPDFEE[HN]KLF[LS]SVYD24e?08016292MARKYREQSS[AG]Y[GR]RRK[PS]QVQRKEK[NR]VCTE10?07017372D[HQ][GK]A[QR]LQNMQS[FS]GVLVEQNLNGQQ[CF]CPTS[GR]DNSL[KN]IG58e?06018302KVQKNG[ST][GR][DE]HVPPPRPKRK[AS]A[HQ]PYPQKASK11e?05019502VTSYQ[LM]NE[FI][LP]ESV[IM]TG[NS]G[CF]S[GI][DG]SPRE[CG]SN[GT][SV]NI[PR][HN]S[HV]A[PS][NT]AF[AG]FQP[QR]A[LS]T58e?04020152W[EG]LG[NS]C[CP]WNNMPGVC81e?0402194LRR[RK][YC]LAEK14e?030

圖5 不同組織中GbMYB基因的表達譜Fig.5 Expression profiles of GbMYB genes in Ginkgo biloba between different tissues 注：紅色和綠色分別表示與對照相比表達上調(diào)和下調(diào)的GbMYB基因Note:Blocks with red and green indicate upregulated and downregulated transcript accumulation of GbMYB relative to the control, respectively.

擬南芥作為一種模式生物，關(guān)于其MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究已經(jīng)較為成熟。為進一步了解銀杏MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能我們用擬南芥的AtMYB蛋白和銀杏GbMYB蛋白序列構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)GbMYB蛋白劃分為16個亞家族。銀杏中沒有一個MYB蛋白序列與擬南芥的S12、S6、S19和S20亞家族聚在一起，可能是銀杏在基因組進化過程中發(fā)生了基因的丟失現(xiàn)象。最新研究表明擬南芥S12亞家族來源于早期分化出的蕓苔屬植物基因復(fù)制事件[34]。在擬南芥中，這類家族調(diào)控芥子油苷的生物合成，而這類次級代謝產(chǎn)物主要分布在蕓苔屬植物中，所以在銀杏中沒有MYB轉(zhuǎn)錄因子跟其聚在一起，相似的研究結(jié)果在白梨[35]和大豆[31]中都有報道。另一方面，銀杏的gba196，gba3518等序列沒有與擬南芥的任何AtMYB亞家族聚合，而是單獨聚在一起組成新的亞家族G16，這或許是該物種為適應(yīng)環(huán)境而發(fā)生了基因組數(shù)量的增加，其機理還有待研究。我們對部分聚在一起的MYB轉(zhuǎn)錄因子進行了功能預(yù)測，為今后研

究銀杏GbMYB 的功能奠定了基礎(chǔ)。GbMYB蛋白保守基序的分析表明，銀杏GbMYB的保守基序多達21個，各亞家族成員間的保守基序組成和分布都有所不同，表明GbMYB蛋白具有生物學(xué)上的多功能性和可塑性。進一步對銀杏GbMYB的表達量進行聚類分析發(fā)現(xiàn)，不同基因在不同組織中的表達模式不同，表明銀杏GbMYB參與調(diào)控各個組織的發(fā)育。感興趣的是，G8亞族的成員可能參與類黃酮的合成，而且G8亞族的GbMYB基因在葉中有較高的表達量，推測可能與銀杏葉中類黃酮含量較多相關(guān)[10]。

本研究為進一步全面解析銀杏MYB轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能提供了參考，尤其為銀杏GbMYB對類黃酮物質(zhì)合成的調(diào)控機理奠定了基礎(chǔ)。銀杏2.7億年的生活史使其在生命進化過程中具有獨特的歷史地位，因此對其轉(zhuǎn)錄因子的研究也可為解析樹木進化和生命進化的早期事件提供一定的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究為進一步全面解析銀杏MYB轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能提供了參考，尤其為銀杏GbMYB對類黃酮物質(zhì)合成的調(diào)控機理奠定了基礎(chǔ)。銀杏2.7億年的生活史使其在生命進化過程中具有獨特的歷史地位，因此對其轉(zhuǎn)錄因子的研究也可為解析樹木進化和生命進化的早期事件提供一定的理論依據(jù)。

[1]Rosinski J A, Atchley W R. Molecular evolution of the MYB family transcription factors:evidence for polyphyletic origin[J].Journal of Molecular Evolution, 1998, 46(1):74-83.

[2]Paz-Ares J, Ghosal D, Wlenand U, et al. The regulatory c1 locus of Zea mays encodes a protein with homology to myb proto-oncogene products and with structural similarities to transcriptional activators[J]. Embo Journal, 1987, 6(12):3553-3561.

[3]Perez-Rodriguez M, Jaffe F W, Butelli E, et al. Development of three different cell types is associated with the activity of a specific MYB transcription factor in the ventral petal of Antirrhinum majus flowers[J]. Development, 2005, 132(2):359-370.

[4]Higginson T, Li SF, Parish RW. At MYB103 regulates tapetum and trichome development in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal, 2003, 35(2):177-192.

[5]Hartmann U, Sagasser M, Mehrtens F, et al. Differential combinatorial interactions of cis-acting elements recognized by R2R3-MYB, BZIP, and BHLH factors control light-responsive and tissue-specific activation of phenylpropanoid biosynthesis genes[J]. Plant Molecular Biology, 2005, 57(2):155-171.

[6]Jung C, Seo JS, Han SW, et al. Overexpression of At MYB44 enhances stomatal closure to confer abiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis[J]. Plant Physiology, 2008, 146(2):623-625.

[7]Goicoechea M, Lacombe E, Legay S, et al. EgMYB2, a new transcriptional activator from Eucalyptus xylem,regulates secondary cell wall formation and lignin biosynthesis[J].Plant Journal, 2005, 43(4):553-567.

[8]Qi L, Yang J, Yuan Y, et al. Overexpression of two R2R3-MYB genes from Scutellaria baicalensis induces phenylpro panoid accumulation and enhances oxidative stress resistance in transgenic tobacco[J]. Plant Physiology & Biochemistry, 2015, 94(4):235-243.

[9]Yuan Y, Qi L, Yang J, et al. A Scutellaria baicalensis, R2R3-MYB gene,SbMYB8, regulates flavonoid biosynthesis and improves drought stress tolerance in transgenic tobacco[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 2015, 120(3):961-972.

[10]Feng Xu, Yingjing Ning, Weiwei Zhang, et al. An R2R3-MYB transcription factor as a negative regulator of the flavonoid biosynthesis pathway in Ginkgo biloba[J]. Functional & Integrative Genomics, 2014, 14(1):177.

[11]Yan J, Wang B, Zhong Y, et al. The soybean R2R3 MYB transcription factor GmMYB100 negatively regulates plant flavonoid biosynthesis[J]. Plant Molecular Biology, 2015, 89(1):35-48.

[12]Pérez-Rodríguez P, Riao-Pachón DM, Corrêa LG, et al. PlnTFDB: updated content and new features of the plant transcription factor database[J]. Nucleic Acids Research, 2009, 38:D822-829.

[13]Espley RV, Hellens RP, Putterill J, et al. Red colouration in apple fruit is due to the activity of the MYB transcription factor MdMYB10[J]. The Plant Journal,2007,49(3):414-427.

[14]van Beek T, Montoro P. Chemical analysis and quality control of Ginkgo biloba leaves, extracts, and phytopharmaceuticals[J]. Journal of Chromatography A, 2009, 1216(11):2002-2032.

[15]楊致榮,王興春,薛金愛,等.藥用植物長春花WRKY轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及表達譜分析[J].生物工程學(xué)報,2013,29(6):785-802.

[16]Schultz J, Milpetz F, Bork P, et al. SMART, a simple modular architecture research tool: Identification of signaling domains[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1998,95(11): 5857-5864.

[17]Crooks G E, Hon G, Chandonia JM, et al. Web Logo: A sequence logo generator[J]. Genome Research, 2004, 14(6):1188-1190.

[18]Bailey TL, Johnson J, Grant CE，et al. The MEME suite[J].Nucleic Acids Res,2015,43(W1): W39-W49.

[19]成舒飛,端木慧子,陳超,等.大豆MYB轉(zhuǎn)錄因子的全基因組鑒定及生物信息學(xué)分析[J].大豆科學(xué),2016,35(1):52-57.

[20]Dubos C, Stracke R, Grotewold E, et al. MYB transcription factors in Arabidopsis[J]. Trends in Plant Science, 2010, 15(10):573-81.

[21]Stracke R, Ishihara H, Huep G, et al. Differential regulation of closely related R2R3-MYB transcription factors controls flavonol accumulation in different parts of the Arabidopsis thaliana seedling[J]. Plant Journal,2007,50:660-677.

[22]Huang W, Khaldun A B, Chen J, et al. A R2R3-MYB Transcription Factor Regulates the Flavonol Biosynthetic Pathway in a Traditional Chinese Medicinal Plant, Epimedium sagittatum[J]. Frontiers in Plant Science, 2016, 7(e70778).

[23]Nakatsuka T, Saito M, Yamada E, et al. Isolation and characterization of GtMYBP3 and GtMYBP4, orthologues of R2R3-MYB transcription factors that regulate early flavonoid biosynthesis, in gentian flowers[J]. Journal of Experimental Botany, 2012, 63(18):6505-6517.

[24]Ryoung Shin, Adrien Y, Burch, et al. The Arabidopsis transcription factor MYB77 modulates auxin signal transduction[J]. Plant Cell, 2007, 19(8):2440-2053.

[25]Keller T, Abbott J, Moritz T, et al. Arabidopsis REGULATOR OF AXILLARY MERISTEMS1 controls a leaf axil stem cell niche and modulates vegetative development[J]. Plant Cell, 2006, 18(3):598-611.

[26]Müller D, Schmitz G, Theres K. Blind Homologous R2R3 Myb Genes Control the Pattern of Lateral Meristem Initiation in Arabidopsis[J]. Plant Cell, 2006, 18(3):586-597.

[27]Cominelli E, Galbiati M, Vavasseur A, et al. A guard-cell-specific MYB transcription factor regulates stomatal movements and plant drought tolerance[J].Current Biology, 2005, 15(13):1196-1200.

[28]Seo P J, Xiang F, Qiao M, et al. The MYB96 Transcription Factor Mediates Abscisic Acid Signaling during Drought Stress Response in Arabidopsis[J]. Plant Physiology, 2009, 151(1):275-289.

[29]Seo P J, Park C M. MYB96-mediated abscisic acid signals induce pathogen resistance response by promoting salicylic acid biosynthesis in Arabidopsis[J]. New Phytologist, 2010, 186(2):471-483.

[30]Reyes J L, Chua N H. ABA induction of miR159 controls transcript levels of two MYB factors during Arabidopsis seed germination[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology, 2007, 49(4):592-606.

[31]Du H, Yang S S, Liang Z, et al. Genome-wide analysis of the MYB transcription factor superfamily in soybean[J]. BMC Plant Biology, 2012, 12(1):106.

[32]曹忠慧.蘋果MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的生物信息學(xué)分析及MdMYB121和MdSIMYB1在非生物脅迫響應(yīng)中的作用[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[33]劉淑君.番茄MYB轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及其表達分析[D].杭州：浙江師范大學(xué),2012.

[34]Yanhui C,Xiaoyuan Y,Kun H,et al. The MYB transcription factor superfamily of Arabidopsis: expression analysis and phylogenetic comparison with the rice MYB family[J]. Plant Molecular Biology, 2006, 60(1):107-124.

[35]Xiaolong Li,Cheng Xue,Jiaming Li,et al.Genome-Wide Identification, Evolution and Functional Divergence of MYB Transcription Factors in Chinese White Pear (Pyrus bretschneideri). International Journal of Molecular Sciences, 2015, 16(12):28683-28704.

(編輯：武英耀)

Identification and characterization of MYB transcription factors inGinkgobiloba

Shi Xiaowen1, Sun Yan1, Ding Na1, Sun Huiying2, Wang Ting1, Jia Xiaoyun1*, Li Runzhi1*

(1.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2.ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,Taigu030800,China)

[Objective] MYB is one of the largest families of transcription factors in plants and participates in kinds of biological processes, such as, plant development, cell morphogenesis and the synthesis of primary and secondary metabolites.Ginkgobilobais called “l(fā)iving fossil” in plant and contains many secondary metabolites，such as flavonoid. MYB transcription factors play an important role in flavonoid biosynthesis. In this study, MYB transcription factor ofginkgowere identified at the transcriptome level. The result will lay the foundation for functional study of GbMYB and identification of MYB from other species. [Methods] Firstly, MYB transcription factors inginkgowere screened and identified by BlASTP and PlantTFbcat. Sencondly, MEME and MEGA 7.0 software were used to analyze motifs and evolution ofginkgoMYB, respectively. Lastly, the expression patterns ofGbMYBin different tissues ofginkgowere analyzed by using MeV software. [Result] In our study, a total of 60 GbMYB were identified from 41151 proteins inginkgoand classified into three distinct groups (R1-MYB, R2R3-MYB and R1R2R3-MYB) according to the structure of MYB domain. Phylogenetic analysis showed these MYB genes were classified into 16 subgroups. Clearly, GbMYBs with the similar functions were gathered together. There were 21 different conserved motifs in GbMYB. Expression profiles analysis showed that the expression ofGbMYBhad tissue specificity.[Conclusion] Our study identified 60 GbMYB at the transcriptome level, which participate in the development of different tissues. The GbMYB was classed into 16 subfamilies by referring to AtMYB. The result of conserved motif analysis showed that GbMYB have diverse functions. Our research provided new message for comprehensively analyzing the structure and function of GbMYB and laid the foundation for the further study of GbMYB in the regulating of secondary metabolites.

MYB transcription factors，Ginkgobiloba， Flavonoid， Transcriptome

2016-12-15

2017-02-20

石曉雯 (1992-)，女 (漢族)，山西呂梁人，碩士研究生，研究方向：植物生物化學(xué)與分子生物學(xué)

*通信作者：賈小云，教授，博士生導(dǎo)師，Tel:13935439653；E-mail：gssjxy2001@hotmail.com；李潤植，教授，博士生導(dǎo)師，Tel:13593105815：E-mail： rli2001@hotmail.com

國家自然科學(xué)基金(31101555)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生創(chuàng)新項目(20143058)；山西省高等學(xué)校優(yōu)秀青年學(xué)術(shù)帶頭人項目(2012)；山西人才引進與開發(fā)專項(614191)

S664.3；Q946.1

A

1671-8151(2017)05-0351-09