吳立國,高景芳,張書春,夏 娟
1.唐山南湖醫(yī)院心血管內(nèi)科,河北唐山 063000;2.唐山工人醫(yī)院心內(nèi)二科,河北唐山 063000
高血壓是心血管疾病常見的危險因素,可導(dǎo)致器官損害和功能障礙,特別是對心臟射血功能造成巨大負(fù)荷。長期的高血壓會增加左心室負(fù)荷,使左心室形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變,導(dǎo)致左心室肥厚[1]。高血壓左心室肥厚發(fā)病機(jī)制目前還沒有明確,有學(xué)者認(rèn)為心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡可能與高血壓左心室肥厚的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[2]。目前研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),微小RNA(miRNA)可調(diào)控高血壓及其相關(guān)疾病的基因表達(dá)[3-4]。miR-21作為一類新型內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子,可促進(jìn)心肌纖維化進(jìn)展[5]。多種生長因子對左心室肥厚的形成具有不可替代的作用,其中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是最有效、最普遍的調(diào)節(jié)心肌肥厚、促纖維生成的細(xì)胞因子[6]。已有研究證實,miR-21可通過靶向抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白7(Smad7),從而促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)心肌纖維化[7]。但關(guān)于miR-21和TGF-β1在高血壓左心室肥厚的形成中作用的報道較少見。因此本研究將探討miR-21和TGF-β1在高血壓左心室肥厚患者血清中的表達(dá)水平及臨床意義。
1.1一般資料 選取2019年10月至2020年10月唐山南湖醫(yī)院心血管內(nèi)科收治的原發(fā)性高血壓患者122例作為研究對象,其中男64例,女58例,年齡48~70歲,平均(60.04±6.08)歲,病程5~16年,平均(11.57±3.01)年。收集患者入院靜坐時收縮壓、靜坐時舒張壓數(shù)據(jù)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《中國高血壓防治指南(2018年修訂版)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8];(2)愿意配合此次試驗者;(3)入選患者了解本次研究,并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并有惡性腫瘤患者;(2)除高血壓外,患者有明確的心血管疾病史;(3)患者有自身免疫性疾病、造血系統(tǒng)疾病等。本研究通過唐山南湖醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。
1.2左心室肥厚判定方法 所有患者均由一名有經(jīng)驗的醫(yī)師采用GE LOGIQ F Series型彩色多普勒超聲診斷儀(美國GE公司)(探頭頻率10~12 MHz)測量室間隔厚度(IVST)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)和左心室后壁厚度(LVPWT)。根據(jù)Devereux校正公式:計算左心室質(zhì)量(LVM),LVM=0.8×1.04×[(IVST+LVEDD+LVPWT)3-LVEDD3]+0.6。收集患者身高、體質(zhì)量數(shù)據(jù),根據(jù)身高和體質(zhì)量計算體表面積(BSA),計算公式:BSA(女)=0.007 3×身高+0.012 7×體質(zhì)量-0.210 6;BSA(男)=0.005 7×身高+0.012 1×體質(zhì)量+0.088 2;BSA單位是m2,身高單位是cm,體質(zhì)量單位是kg。根據(jù)BSA計算左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI),LVMI=LVM/BSA。以男性LVMI≥115 g/m2,女性LVMI≥95 g/m2為判定左心室肥厚的判定標(biāo)準(zhǔn)[9]。本研究中高血壓患者根據(jù)是否發(fā)生左心室肥厚分為左心室肥厚組35例和非左心室肥厚組87例。
1.3試劑及儀器 RNA提取試劑盒(批號R1200-100)購自北京索萊寶科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號QR0100)、熒光定量PCR試劑盒(2×SYBR Green qPCR Mix)(批號RR047A)、熒光定量PCR參比染料(ROX Reference Dye)(批號RS109)均購自日本Takara公司;人TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(批號DB100B)購自美國R&D公司;實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(型號CFX96)、酶聯(lián)免疫檢測儀(型號680)均購自美國Bio-Rad公司。
1.4研究方法
1.4.1樣品采集 采集所有患者清晨空腹靜脈血5 mL裝于普通采血管中,4 ℃,3 000 r/min,離心8 min,留上清液,凍存于-80 ℃冰箱中,待測。
1.4.2熒光定量PCR檢測血清中miR-21的表達(dá) 使用RNA提取試劑盒提取樣品中總RNA,檢測所得RNA純度,總RNA依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用qRT-PCR儀對miR-21及內(nèi)參U6進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),miR-21正向引物5′-AAA GTT GTA GTC AGA CTA TTC GAT-3′,反向引物5′-GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT-3′。內(nèi)參U6正向引物5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′,反向引物5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′。引物由北京索萊寶科技有限公司合成。qRT-PCR反應(yīng)體系20 μL:2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL,正向和反向引物各2 μL,cDNA模板(50 ng/μL)1 μL,ROX Reference Dye 0.4 μL,ddH2O 4.6 μL。反應(yīng)條件:95 ℃,5 min;95 ℃,30 s;60 ℃,30 s;72 ℃,30 s;38個循環(huán)。對miR-21相對表達(dá)量用2-ΔΔCt法計算。
1.4.3檢測血清中TGF-β1水平 采用ELISA法檢測血清中TGF-β1水平,操作步驟嚴(yán)格依據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。
2.1左心室肥厚組和非左心室肥厚組患者基線資料比較 左心室肥厚組和非左心室肥厚組在性別、年齡上比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與非左心室肥厚組相比,左心室肥厚組患者高血壓病程、靜坐時收縮壓、靜坐時舒張壓較高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。
表1 左心室肥厚組和非左心室肥厚組患者基線資料比較
2.2左心室肥厚組和非左心室肥厚組患者IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI水平比較 與非左心室肥厚組相比,左心室肥厚組患者IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI水平較高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。
表2 左心室肥厚組和非左心室肥厚組患者IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI水平比較
2.3左心室肥厚組和非左心室肥厚組患者血清miR-21和TGF-β1水平比較 與非左心室肥厚組相比,左心室肥厚組患者血清miR-21、TGF-β1水平較高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。
表3 左心室肥厚組和非左心室肥厚組患者血清miR-21和TGF-β1水平比較
2.4高血壓患者血清miR-21、TGF-β1與IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示,高血壓患者血清miR-21與IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05),血清TGF-β1與IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。見表4。
表4 高血壓患者血清miR-21、TGF-β1水平與IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI的相關(guān)性分析
2.5血清miR-21、TGF-β1及兩者聯(lián)合對高血壓左心室肥厚診斷價值分析 繪制ROC曲線結(jié)果顯示,miR-21、TGF-β1單項及聯(lián)合檢測診斷高血壓左心室肥厚的曲線下面積(AUC)分別為0.882(95%CI:0.812~0.952)、0.847(95%CI:0.772~0.922)、0.947(95%CI:0.908~0.987)。見表5和圖1。
表5 血清miR-21、TGF-β1及兩者聯(lián)合對高血壓左心室肥厚診斷價值
圖1 ROC曲線分析血清miR-21、TGF-β1單項及聯(lián)合檢測對高血壓左心室肥厚的診斷價值
高血壓是一種全身性慢性疾病,主要表現(xiàn)為體循環(huán)動脈血壓升高。早期血壓控制不好,持續(xù)升高,會使左心室心肌持續(xù)處于超負(fù)荷工作狀態(tài),導(dǎo)致左心室代償性肥厚發(fā)生。另有報道顯示,長期心臟壓力負(fù)荷會刺激成纖維細(xì)胞增殖、心肌細(xì)胞胞外基質(zhì)膠原過度沉積,最終導(dǎo)致心肌纖維化,促進(jìn)左心室肥厚[10]。據(jù)報道,高血壓患者發(fā)生左心室肥厚的概率為20.00%~30.00%,心室肥厚是心臟事件致死及全因死亡的獨立危險因素[11]。分析左心室肥厚形成的機(jī)制有助于高血壓左心室肥厚的診斷和治療。
心肌成纖維細(xì)胞的增殖和心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化是心肌纖維化的關(guān)鍵。TGF-β是結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的多肽生長因子,可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化,一共有5種亞型。目前哺乳動物中有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。TGF-β1位于19q13染色體上,在體細(xì)胞系中分布最廣泛、活性最強(qiáng)。TGF-β與多種疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān),如肺纖維等纖維化疾病[12]。TGF-β1是心肌纖維化的主要調(diào)節(jié)因子,可通過TGF-β1/Smad信號通路減少細(xì)胞外基質(zhì)降解,促進(jìn)Ⅰ型膠原等蛋白合成,促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化[13]。夏勇等[14]報道高血壓粥樣硬化斑塊患者和增厚患者TGF-β1水平明顯高于頸動脈正常的高血壓患者;高血壓左心室肥厚患者TGF-β1水平明顯高于無左心室肥厚患者,同時發(fā)現(xiàn)TGF-β1與LVMI水平呈正相關(guān)關(guān)系,表明TGF-β1與高血壓患者左心室肥厚有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)左心室肥厚組患者血清TGF-β1水平顯著高于非左心室肥厚組患者,提示TGF-β1可能與高血壓左心室肥厚發(fā)生有關(guān)系,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)血清TGF-β1與IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI呈正相關(guān)關(guān)系,進(jìn)一步證實了TGF-β1可能參與高血壓左心室肥厚的發(fā)生。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)血清TGF-β1對高血壓左心室肥厚診斷的AUC為0.847,靈敏度為81.40%,特異度為78.50%,提示TGF-β1在臨床上對高血壓左心室肥厚的評估可能比較可靠。
miRNA是一類長度19~25個核糖核苷酸的單鏈小分子RNA,常作為內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子參與心臟疾病的發(fā)生過程,包括心肌纖維化[15]。與心肌纖維化有關(guān)的幾種miRNAs中,miR-21因其靶點在腎、肝等多個器官的纖維化中發(fā)揮重要作用而受到特別關(guān)注[16-17]。人miR-21位于染色體17q23.2區(qū)域,與其他miRNA不同,其有獨立的啟動子區(qū)域。ZHOU等[18]在大鼠實驗中發(fā)現(xiàn)miR-21能夠靶向降解Jagged1蛋白,促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化和心肌纖維化形成。薛貽敏等[19]在小鼠實驗中發(fā)現(xiàn),miR-21可促進(jìn)慢性病毒性心肌炎小鼠心肌纖維化,這一過程是通過介導(dǎo)TGF-β1/Smad7信號通路實現(xiàn)的。孟華等[20]報道m(xù)iR-21通過抑制Smad7表達(dá),增強(qiáng)心臟成纖維細(xì)胞的增殖,加重心肌梗死后心肌纖維化,表明miR-21是作用于成纖維細(xì)胞,促進(jìn)心肌纖維化,而非作用于心肌細(xì)胞本身,推測miR-21可能參與高血壓左心室肥厚的心肌纖維化過程。周湘鴻等[21]報道高血壓左心室肥厚患者miR-29b水平明顯高于高血壓非左心室肥厚患者,與高血壓左心室肥厚呈正相關(guān)關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)左心室肥厚組患者血清miR-21水平顯著高于非左心室肥厚組患者,提示miR-21可能參與高血壓左心室肥厚發(fā)生,猜測miR-21是通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞心肌纖維化,促進(jìn)高血壓患者左心室肥厚的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)血清miR-21與IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI呈正相關(guān)關(guān)系,證實了miR-21與高血壓患者的左心室肥厚發(fā)生具有緊密聯(lián)系。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)miR-21對高血壓左心室肥厚診斷的AUC為0.882,靈敏度為74.40%,特異度為92.40%;血清miR-21和TGF-β1聯(lián)合對高血壓左心室肥厚診斷的AUC為0.947,靈敏度為95.30%,特異度為83.50%,兩者聯(lián)合診斷的AUC顯著高于單獨診斷時AUC,提示兩者聯(lián)合檢測對高血壓左心室肥厚診斷效果可能更好。本研究從臨床上分析了miR-21和TGF-β1對高血壓左心室肥厚的評估價值,為預(yù)測高血壓患者是否發(fā)生左心室肥厚提供了理論基礎(chǔ),為高血壓左心室肥厚疾病在醫(yī)學(xué)上的研究進(jìn)展奠定基礎(chǔ)。
綜上所述,高血壓左心室肥厚患者血清miR-21和TGF-β1水平上調(diào),兩者對高血壓左心室肥厚具有較好的評估價值,兩者聯(lián)合診斷效果更好。