何益洋，李園夢，徐 鵬，馮 倩，蔣文強，俸家富△

1.四川省綿陽市中心醫(yī)院檢驗科，四川綿陽 621000；2.四川省南充市中心醫(yī)院檢驗科，四川南充 637000；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，四川成都 610075

維生素D(VitD)是一類脂溶性固醇類衍生物，25羥維生素D[25(OH)D]是主要儲存形式，包括25(OH)D2和25(OH)D3(本文簡稱VitD2和VitD3)[1-2]。VitD2和VitD3分別來源于植物和動物。有研究認為應(yīng)同時檢測VitD2和VitD3以保證兩種來源的VitD均能被檢出[3]。C3-差向異構(gòu)體(C3-epi)是VitD2和VitD3在酶作用下形成的同分異構(gòu)體。因此，評價機體內(nèi)VitD貯存，僅檢測總25(OH)D水平，或僅分別檢測VitD2和VitD3是不能準確評價的，尤其是對于未成年受試者，因其肝腎臟功能尚未成熟，導(dǎo)致VitD代謝途徑向差向異構(gòu)體分流[4]。本實驗室引入超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)，嘗試檢測了部分受試者VitD2與VitD3水平，并分析了C3-epi對結(jié)果的影響，以期為臨床評估未成年人(某些VitD相關(guān)性疾病)體內(nèi)VitD貯存提供可靠的循證依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年6—8月來綿陽市中心醫(yī)院就診或健康體檢的未成年人(<18歲)1 671例，年齡1個月至16歲，中位年齡12歲。分為健康組(n=1 204)和疾病組(n=467)，疾病組為隨機抽取的就診患兒，包括矮小癥134例、呼吸道感染215例、營養(yǎng)不良57例和抽動障礙61例。

1.2樣本檢測 受試者禁食過夜，于上午10點前，用一次性含分離膠/纖維蛋白酶促凝劑真空采血管(美國BD 公司)采集空腹靜脈血約5 mL，輕輕顛倒混勻，靜置0.5～1.0 h后，以3 000 r/min 離心10 min，分離血清，-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩Ｓ肑asperTMHPLC液相色譜儀與AB SCIEX Triple QuadTM4500MD型質(zhì)譜儀串聯(lián)，檢測血清中VitD組分含量。實驗所用標準及儀器參數(shù)設(shè)置：(1)校準品。25(OH)D2(同位素摻入≥98.0%,純度≥95.0%)、25(OH)D3(≥99.0%,≥95.0%)和3-epi-25(OH)D3-[2H3](≥98.0%,≥98.0%)購自美國IsoSciences MPD化學(xué)公司；25(OH)D2-D6和25(OH)D3-D6購自美國Medical isotopes公司，二者豐度和化學(xué)純度都分別為 > 98.0%(atom)D和>99.0%；3-epi-25-(OH)D3購自加拿大Toronto research chemical公司，純度95.0%。(2)樣本處理。向200 μL血清中加入10 μL內(nèi)標溶液，充分混勻后加入1.0 mL叔丁基甲醚，以13 000 r/min高速離心5 min，吸取上清液800 μL于潔凈的埃彭多夫管中，并吹干。然后向殘余物中加入100 μL含0.1%甲酸的65.0%甲醇溶液，使之復(fù)溶，充分混勻后待測。(3)色譜條件。采用C18色譜柱(Phenomenex，美國)進行樣本分離，柱溫為40 ℃，流速為0.6 mL/min。流動相A為含0.1%甲酸的水溶液，流動相B為含0.1%甲酸的甲醇溶液，梯度洗脫。(4)質(zhì)譜條件。采用APCI離子源進行質(zhì)譜分析；駐留時間為40 ms；掃描模式采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；VitD2、D6-25(OH)D2、VitD3和D6-25(OH)D3的離子對(母離子/定量子離子)分別為395.3/269.2 m/z、419.3/229.3 m/z、383.3/365.3 m/z和389.3/363.3 m/z；監(jiān)測VitD2、D6-25(OH)D2、VitD3和D6-25(OH)D3所使用的去簇電壓分別為110 V、85 V、130 V和130 V，碰撞能量分別為24 eV、21 eV、16 eV和19 eV。(5)數(shù)據(jù)采集：色譜圖輸出用Analyst?MD軟件(版本號：1.6.3)，數(shù)據(jù)處理用MultiquantTMMD軟件(版本號：3.0.2)，二者均是AB SCIEX Triple QuadTM4500MD質(zhì)譜儀(ABI，美國)配套操作系統(tǒng)。

1.3C3-epi分析 隨機抽取87例樣本，包括健康者24例，不同疾病患者63例。用同位素稀釋超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進行3-epi-25(OH)D3，即C3-epi檢測。

1.4VitD組分水平的計算 根據(jù)液質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜測得的VitD2和VitD3結(jié)果，計算出25(OH)D=VitD2+VitD3；由于VitD3是VitD2活性的2～3倍，以最高活性3倍計算，將VitD2折算為VitD3，再加上VitD3的活性，合并為AVitD3?；钚訴itD3(AVitD3)=VitD2/VitD3+VitD3。

1.5VitD營養(yǎng)狀態(tài)的評估 根據(jù)美國醫(yī)學(xué)研究所(IOM)推薦[5]，VitD營養(yǎng)狀態(tài)判斷標準為≤20 ng/mL為缺乏；20～<30 ng/mL為不足；≥30 ng/mL為充足。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS25.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。因本研究的VitD組分水平不服從正態(tài)分布，所測結(jié)果以M(P25～P75)進行描述。比較健康組與疾病組指標的差異，選擇Mann-WhitneyU檢驗；比較多組間指標的差異，選擇Kruskal-WallisH檢驗，兩兩比較采用Bonferroni法(即調(diào)整α水準法)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1受試者血清VitD組分水平 受試者VitD2、VitD3、25(OH)D和AVitD3水平見表1。因本組資料均不呈正態(tài)分布，用Mann-WhitneyU檢驗對健康組和疾病組兩組差異進行分析，結(jié)果顯示，疾病組的血清VitD2水平、血清VitD3水平、25(OH)D水平和AVitD3水平均明顯低于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2受試者血清VitD2和VitD3水平 受試者中，VitD2水平從高至低依次為抽動障礙組、健康組、呼吸道感染組、矮小癥組和營養(yǎng)不良組，中位值水平分別為1.96、1.91、1.61、1.44 ng/mL 和0.99 ng/mL，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)Bonferroni法兩兩比較，營養(yǎng)不良組血清VitD2水平明顯低于健康組和抽動障礙組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。受試者中，VitD3水平由高至低依次為健康組、呼吸道感染組、營養(yǎng)不良組、矮小癥組、抽動障礙組，中值水平依次分別為：29.48、28.48、25.89、25.64、24.73 ng/mL，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)Bonferroni法兩兩比較，矮小癥組和抽動障礙組血清VitD3水平均明顯低于健康組和呼吸道感染組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3受試者血清25(OH)D和AVitD3水平 受試者中，25(OH)D水平由高至低依次為健康組、呼吸道感染組、抽動障礙組、矮小癥組和營養(yǎng)不良組，見表2，中位值水平分別為34.29、33.21、30.04、28.14、27.51 ng/mL，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)Bonferroni法兩兩比較，矮小癥組、營養(yǎng)不良組和抽動障礙組血清25(OH)D水平均明顯低于健康組，而且矮小癥組血清25(OH)D水平還明顯低于呼吸道感染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

受試者中，AVitD3水平由高至低依次為健康組、呼吸道感染組、抽動障礙組、矮小癥組和營養(yǎng)不良組，中值水平分別為30.91、30.19、26.56、26.47、26.07 ng/mL，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)Bonferroni法兩兩比較，矮小癥組和抽動障礙組血清AVitD3水平均明顯低于健康組，而且矮小癥組血清AVitD3水平還明顯低于呼吸道感染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.4C3-epi分析 本研究用同位素稀釋質(zhì)譜法評估了87個血清樣本C3-epi水平，通過調(diào)整質(zhì)譜條件和更換色譜柱，實現(xiàn)C3-epi和VitD3色譜峰的有效分離，見圖1。結(jié)果顯示，VitD3和C3-epi分別在3.39 min和3.47 min洗脫，洗脫時間非常接近；同時C3-epi的質(zhì)譜峰與VitD3密切相關(guān)。然后，在引入C3-epi標準品和同位素內(nèi)標之后，采用正離子條件下多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，實現(xiàn)對C3-epi同位素內(nèi)標法定量，見表3。因本組資料均不呈正態(tài)分布，用Mann-WhitneyU檢驗對健康組和疾病組兩組差異進行分析，結(jié)果顯示，隨機抽樣的血清樣本中，疾病組的VitD2、VitD3和25(OH)D水平明顯高于健康組，而疾病組的VitD2/VitD3與健康組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這些改變均與總體血清樣本的改變一致；但是疾病組的血清C3-epi水平明顯高于健康組，其與VitD3的比值(即C3-epi/VitD3)在疾病組和健康組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而其與25(OH)D的比值[即C3-epi/25(OH)D]疾病組低于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

注：C3-epi的質(zhì)譜峰與VitD3密切相關(guān)，洗脫時間非常接近。VitD3和C3-epi分別在3.39 min和3.47 min洗脫。

2.5受試者體內(nèi)VitD營養(yǎng)狀態(tài) 用25(OH)D水平分析本組受試者機體VitD貯存狀況，因為是夏季，再加上兒童可能有意識地補充了VitD，從圖2可見，65.4%健康組和52.7%疾病組受試者VitD充足，疾病組中VitD充足者比例低于50%的是矮小癥(41.8%)和營養(yǎng)不良患者(43.9%)。但是，由于VitD2活性僅是VitD3活性的1/3～1/2，因此將VitD2活性折算為AVitD3水平用于分析后發(fā)現(xiàn)，僅健康組(53.2%)和呼吸道感染組(51.2%)有剛過一半的受試者VitD貯存充足，而矮小癥(30.6%)和抽動障礙患者(31.2%)中VitD貯存充足者不足1/3，其VitD缺乏或不足超過者分別占69.4%和68.8%。

將本研究受試者VitD營養(yǎng)狀況繪成圖，按25(OH)D判斷，見圖2A；按AVitD3判斷，見圖2B。

注：A為25(OH)D判斷；B為AVitD3判斷。

3 討 論

VitD缺乏已成為全球的公共衛(wèi)生健康問題，越來越多的研究者們對VitD水平的關(guān)注已不僅僅局限于營養(yǎng)學(xué)，而是對很多疾病的構(gòu)成比，如心臟病、腎病、肺病、癌癥、糖尿病、高血壓、精神分裂癥和自身免疫性疾病等的發(fā)生發(fā)展、療效監(jiān)測和預(yù)后評估的意義都在進行廣泛的探索[2,6-11]。但是，鑒于早些年醫(yī)學(xué)實驗室VitD檢測技術(shù)的局限，這些研究多集中在某種疾病與25(OH)D水平關(guān)系的層面，而對VitD組分的組成、測定及其與疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，研究報道較少。

本研究用UHPLC-MS/MS技術(shù)分析了未成年人中健康受試者和某些種類疾病患者血清VitD組分。疾病組血清VitD2、VitD3和25(OH)D水平均較健康組降低。說明未成年人在疾病發(fā)生后可能導(dǎo)致體內(nèi)VitD水平下降，當然也可能是機體VitD水平較低導(dǎo)致疾病發(fā)生。雖然還沒能證明VitD是一種抗氧化劑，但VitD能調(diào)節(jié)多條合成抗氧化物質(zhì)的細胞通路，對抗活性氧自由基和一氧化氮的氧化作用，防止組織細胞氧化損傷[12]。因此，如若機體內(nèi)VitD長期維持在較低水平，個體對抗ROS的能力就將下降，組織細胞被氧化損傷的可能性增加，導(dǎo)致疾病發(fā)生和發(fā)展概率增加。另一方面，大多數(shù)疾病都與炎癥相關(guān)，機體抗炎性反應(yīng)必然消耗抗氧化劑，這可能就是發(fā)生疾病時體內(nèi)VitD水平降低的原因之一。

由于人體血液中VitD2及其代謝產(chǎn)物與VitD結(jié)合蛋白相結(jié)合的能力比VitD3低，加之VitD2存在一個非生理代謝形式，且其半衰期較VitD3短，VitD2的生物效力明顯低于VitD3，這些因素使得VitD3實際存儲VitD的能力要比VitD2高2～3倍[1,13]。因此，生理狀態(tài)下，機體內(nèi)VitD3水平遠高于VitD2水平，VitD2/VitD3比值極低。受試者因某些不明原因?qū)е麦w內(nèi)VitD2水平過高而VitD3卻明顯降低時，若僅檢測血清25(OH)D水平，就可能導(dǎo)致VitD貯存充足的假象。對本組受試者的研究顯示，經(jīng)VitD2向AVitD3折算后，以AVitD3水平再進行體內(nèi)VitD營養(yǎng)狀況評估時，本組受試者中無論健康與否，其VitD中位數(shù)水平均有明顯下降。這可能就是檢測血清VitD濃度時，需檢測其組分的真正理由所在，因為只有這樣才能正確評價受試者體內(nèi)VitD營養(yǎng)水平。然而，關(guān)于對機體內(nèi)VitD貯存的評價，現(xiàn)在臨床實驗室?guī)缀醵际鞘褂妹庖邩擞浖夹g(shù)(即化學(xué)發(fā)光法)來檢測血清總25(OH)D水平，其結(jié)果不僅只是將VitD2與VitD3的生物活性等同，而且還忽視了樣本中C3-epi的存在，顯然這樣的評價方式極為不當甚至是錯誤的認識，真正能正確評價受試者體內(nèi)VitD貯存的指標是生物可利用VitD，即AVitD。本研究可見，當不考慮VitD2的生物效力時，許多受試者尚表現(xiàn)為有足夠的VitD貯存，但若將各種VitD組分折算為AVitD后，2/3以上疾病患者體內(nèi)VitD貯存不足或缺乏。

25(OH)D能被25-羥基維生素D3-3-差示酶作用，使VitD3第3個碳原子上的羥基空間位置由3β反轉(zhuǎn)為3α，形成3-epimer-25(OH)D3[14]，即C3-epi。C3-epi與VitD3有著相同分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)式,僅空間構(gòu)象不同，但它沒有生物活性[14]。因此，相同VitD3水平，如果C3-epi含量高，其實質(zhì)就是降低了VitD的體內(nèi)貯存。在兒童，尤其1歲以下嬰兒，由于VitD代謝通路尚不成熟，C-3異構(gòu)化可能是25(OH)D的主要代謝途徑之一，所以1歲以下嬰兒C3-epi濃度很高[15]。本組健康受試者的分析結(jié)果也能進一步證明該結(jié)論。因此，兒童尤其是1歲以下嬰兒如果不檢測C3-epi水平，高估其體內(nèi)VitD貯存的可能性極大。隨著年齡的增長，如果血清C3-epi濃度依然高，可能表明VitD代謝通路成熟較慢。本研究發(fā)現(xiàn)當處于疾病狀態(tài)時，患者C3-epi中位數(shù)和區(qū)間估計均高于健康受試者，表明某些疾病可能影響了機體內(nèi)VitD的正常代謝，從而影響了機體的真實VitD貯存水平，這類患者如果不檢測C3-epi水平，必將高估體內(nèi)VitD貯存。此外同VitD3一樣，VitD2也存在差向異構(gòu)化，但因為正常生理狀況下甚至在多數(shù)疾病狀況下，VitD2在人體內(nèi)的含量遠較VitD3低，因此，除研究外，臨床上檢測VitD2的差向異構(gòu)體對評價VitD貯存的意義不大。這也是本文不分析VitD2差向異構(gòu)體的原因。但是，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C3-epi增加的患者，有VitD2增加的趨勢。那么，C3-epi的生成與VitD2水平有無關(guān)系？是VitD2促進C3-epi的生成，還是C3-epi增加導(dǎo)致的VitD2適應(yīng)性增加？VitD2增加是否也意味著其差向異構(gòu)體增加？這需要作進一步研究。

目前，還沒有任何醫(yī)療機構(gòu)或研究單位提供VitD2、VitD3及其比值(VitD2/VitD3)的參考值范圍，因為現(xiàn)有臨床醫(yī)生均僅依據(jù)25(OH)D水平來評價受試者機體內(nèi)VitD貯存。分析原因：第一，現(xiàn)有臨床實驗室所使用的免疫學(xué)檢測方法尚不能分別檢測VitD2和VitD3水平；第二，大多數(shù)人認為機體內(nèi)VitD2水平遠低于VitD3水平，VitD2的改變對總的25(OH)D水平影響不大；第三，極少有人關(guān)注C3-epi對25(OH)D水平的影響。但是，由于VitD2和VitD3活性不同，以及C3-epi形式的存在，即便相同25(OH)D檢測水平，也可能由于VitD2、VitD3和C3-epi的組成不同，從而表現(xiàn)出不同的VitD貯存水平。因此，想要準確評估受試者機體內(nèi)VitD營養(yǎng)狀況，就必須準確測定VitD2、VitD3和C3-epi在內(nèi)的VitD組分。由此可見，正確選擇VitD的檢測方法和其必須的組分檢測，對正確認識和評估受試者機體內(nèi)貯存至關(guān)重要。

由于受試者體內(nèi)VitD可能存在C3-epi形式，如果只是檢測血清25(OH)D水平，或者只檢測VitD2和VitD3水平均會過高估計受試者體內(nèi)VitD貯存。因此，C3-epi水平檢測對準確評價受試者體內(nèi)VitD貯存極為重要，尤其是1歲以下嬰兒和某些疾病患兒。