謝平凡,譚 林,周紅兵,陳維順

中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬株洲醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南株洲 412000

結(jié)腸癌是全球常見的惡性腫瘤之一，其死亡率位居所有腫瘤的第二位[1]。結(jié)腸癌患者早期臨床癥狀不明顯，大多數(shù)患者確診時(shí)已是中晚期，已錯(cuò)過早期診斷及治療的最佳時(shí)機(jī)。準(zhǔn)確的早期診斷是治療結(jié)腸癌的關(guān)鍵。G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白(RGS)家族是一類能負(fù)性調(diào)節(jié)G蛋白活性的多功能蛋白。RGS19，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的RGS家族成員，參與調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)下游細(xì)胞信號(hào)活動(dòng)并與細(xì)胞增殖和生長密切相關(guān)[2]。RGS19蛋白的轉(zhuǎn)錄水平改變與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。在卵巢癌[2]、胃癌[3]、前列腺癌[4]等癌細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)RGS19表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。目前，RGS19在結(jié)腸癌中表達(dá)情況和作用的相關(guān)報(bào)道甚少。為了明確RGS19在結(jié)腸癌中的表達(dá)水平及其臨床意義，本文比較了RGS19在結(jié)腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)，并進(jìn)一步分析了RGS19在結(jié)腸癌中的表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2014年5月至2015年7月結(jié)腸癌根治手術(shù)切除的100例結(jié)腸癌及30例癌旁組織標(biāo)本。癌旁組織距癌組織邊緣>15 cm，病理證實(shí)無癌浸潤。所有標(biāo)本來源的病例均經(jīng)病理學(xué)診斷為原發(fā)性腺癌，且術(shù)前均未接受放化療及相關(guān)靶向藥物治療。根據(jù)美國聯(lián)合癌癥委員會(huì)第八版TNM分類[5]對(duì)這些病例進(jìn)行TNM分期，根據(jù)病理標(biāo)準(zhǔn)確認(rèn)分化程度(高、中、低)。本研究組織標(biāo)本的獲取及使用均經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者對(duì)本研究均知情。通過電話對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪，以手術(shù)日期為起始時(shí)間，以死亡為終點(diǎn)時(shí)間，隨訪截止時(shí)間為2020年7月。共隨訪100例，失訪0例。

1.2方法

1.2.1免疫組化染色 結(jié)腸癌組織及癌旁組織經(jīng)石蠟包埋處理后，切片為4 μm厚度。切片經(jīng)二甲苯脫蠟處理，梯度乙醇(100.0%、85.0%、75.0%、50.0%乙醇)及雙蒸水浸泡水化處理。用3.0%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗。水浴鍋加熱枸櫞酸鈉緩沖液(0.01 mol/L，pH 6.0)至90 ℃恒溫，浸入切片繼續(xù)加熱15～30 min進(jìn)行抗原修復(fù)，隨后自然冷卻。切片經(jīng)PBS清洗后用10.0%兔血清37 ℃封閉10～15 min。棄去封閉液，加入RGS19一抗(稀釋比例1∶1 200)，4 ℃孵育過夜。次日將切片用PBS清洗后滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液，37 ℃孵育20 min；PBS清洗，切片滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，37 ℃孵育20 min。PBS洗滌后進(jìn)行DAB顯色反應(yīng)，以及蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。脫水和封片后置于顯微鏡下觀察，每個(gè)切片中隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

1.2.2結(jié)果判斷 RGS19的免疫組織化學(xué)結(jié)果由兩位獨(dú)立研究人員進(jìn)行評(píng)估。RGS19染色定位于細(xì)胞核內(nèi)。按陽性細(xì)胞百分比計(jì)分：0.0%～5.0%為0分，>5.0%～25.0%為1分，>25.0%～50.0%為2分，>50.0%～75.0%為3分，>75.0%～100.0%為4分；按染色強(qiáng)度計(jì)分：無染色為0分，弱染色為1分，中度染色為2分，強(qiáng)染色為3分。根據(jù)上述兩項(xiàng)得分的乘積來劃分低表達(dá)組和高表達(dá)組：<6分為低表達(dá)，≥6分為高表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用n表示，采用χ2檢驗(yàn)分析RGS19在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達(dá)差異及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系；生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線分析法，并用Log-rank檢驗(yàn)其統(tǒng)計(jì)意義；Cox回歸模型分析結(jié)腸癌預(yù)后影響因素。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1RGS19在結(jié)腸癌組織中表達(dá)較癌旁組織高 免疫組化結(jié)果顯示RGS19蛋白陽性染色定位于細(xì)胞核內(nèi)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示在30例癌旁組織中，RGS19的高表達(dá)率為33.3%；而在100例結(jié)腸癌組織中，RGS19的高表達(dá)率為61.0%，高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1和圖1。

注：A為癌旁組織低表達(dá)；B為結(jié)腸癌組織低表達(dá)；C為結(jié)腸癌組織高表達(dá)。

表1 RGS19在結(jié)腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)[n(%)]

2.2RGS19的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 RGS19在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與患者N分期、M分期和TNM分期有關(guān)(P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤大小、分化程度和T分期無關(guān)(P>0.05)，見表2。

表2 結(jié)腸癌中RGS19的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.3RGS19高表達(dá)和低表達(dá)結(jié)腸癌患者5年生存分析 對(duì)本研究100例結(jié)腸癌患者隨訪5年，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，RGS19低表達(dá)的患者中位生存時(shí)間為52個(gè)月，高于RGS19高表達(dá)患者的38個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3；RGS19低表達(dá)的患者總生存率(76.9%)高于RGS19高表達(dá)患者總生存率(44.3%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

表3 RGS19表達(dá)與結(jié)腸癌患者5年生存時(shí)間的關(guān)系

圖2 RGS19高表達(dá)和低表達(dá)結(jié)腸癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.4結(jié)腸癌患者預(yù)后的影響因素分析 單因素Cox回歸分析顯示結(jié)腸癌RGS19的表達(dá)與TNM分期、T分期、N分期一樣，都是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的因素；多因素Cox回歸分析顯示RGS19表達(dá)水平和TNM分期是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素(P<0.05)，見表4。

表4 影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的單因素及多因素分析

3 討 論

結(jié)腸癌是胃腸道常見的惡性腫瘤。隨著結(jié)腸癌篩查的廣泛開展，作為篩查目標(biāo)人群的老年人中結(jié)腸癌的死亡率有所下降，但50歲以下的人群中結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率卻一直在增加[6]。結(jié)腸癌的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)和輔助檢查。早期結(jié)腸癌患者癥狀不明顯或輕微，是導(dǎo)致結(jié)腸癌不能被早發(fā)現(xiàn)和早治療的主要原因。本研究通過檢測(cè)結(jié)腸癌和癌旁組織RGS19的表達(dá)，并分析其與結(jié)腸癌患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，旨在為結(jié)腸癌診斷提供新的腫瘤標(biāo)志物。

GPCR介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及應(yīng)激響應(yīng)中起著重要作用[7]。GPCR通過與G蛋白偶聯(lián)來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶活性，產(chǎn)生第二信使作用于下游效應(yīng)蛋白，從而將配體信號(hào)由細(xì)胞外傳遞至細(xì)胞內(nèi)，改變細(xì)胞功能活性。G蛋白由α、β和γ 3個(gè)亞基組成。Gα亞基與GDP結(jié)合，以無活性狀態(tài)存在；當(dāng)GPCR與配體結(jié)合而激活后，Gα與β和γ亞基解離，并與GDP分離而與GTP結(jié)合。與GTP結(jié)合的Gα亞基處于活性狀態(tài)，參與下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑。RGS是一類GTP酶激活蛋白，可激活Gα亞基內(nèi)在的GTP酶，使得與Gα亞基結(jié)合的GTP水解為GDP，使Gα亞基失活，從而負(fù)調(diào)節(jié)GPCR介導(dǎo)的信號(hào)通路[7]。RGS家族蛋白擁有130個(gè)氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域及結(jié)合激活的Gα亞基[8]。迄今為止，有研究發(fā)現(xiàn)RGS蛋白調(diào)節(jié)G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與多種細(xì)胞生物過程，包括細(xì)胞增殖、分化、質(zhì)膜運(yùn)輸、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和胚胎發(fā)育等[9]。目前RGS家族已被發(fā)現(xiàn)有20多位成員[10]，其中至少有14種RGS蛋白被證明參與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程[11]，其中研究較多的是RGS17、RGS20。RGS19在腫瘤中的作用也廣泛受到關(guān)注，但目前相關(guān)研究結(jié)論不一。SAKAGUCHI等[12]通過GEO數(shù)據(jù)庫、Oncomine數(shù)據(jù)庫和TCGA數(shù)據(jù)庫分析了RGS19在不同腫瘤和正常組織中的基因和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示RGS19在膀胱癌、乳腺癌和腎癌組織中的表達(dá)均高于正常組織[3]。同樣在其他臨床研究中發(fā)現(xiàn)卵巢癌[2]、胃癌[3]、胰腺癌[13]、肺癌[14]中均有RGS19蛋白表達(dá)增加。然而，另外一些研究報(bào)道RGS19在白血病、肺癌和淋巴瘤中的表達(dá)低于正常組織[3]。在本研究中，RGS19在結(jié)腸癌組織中的高表達(dá)率(61.0%)明顯高于癌旁組織(33.3%)，這與肺癌[13]、卵巢癌[15]中的研究結(jié)論一致。研究發(fā)現(xiàn)在小鼠F9畸胎瘤細(xì)胞中，低表達(dá)的RGS19會(huì)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)[16]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活與結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞的過度增殖和惡變有關(guān),參與結(jié)/直腸癌的發(fā)生；而阻斷Wnt/β-catenin通路可抑制腫瘤的生長[17]。另外，JI等[18]研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)RGS19可增加畸胎瘤細(xì)胞Akt的磷酸化水平，上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1/3，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。這些研究提示，RGS19能通過多重機(jī)制調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[2]。

在本研究中，RGS19高表達(dá)的結(jié)腸癌患者與RGS19低表達(dá)的患者相比，總生存時(shí)間明顯縮短，總生存率降低。RGS19表達(dá)是結(jié)腸癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。SAKAGUCHI等[12]在關(guān)于舒尼替尼耐藥的腎透明細(xì)胞癌的研究中也有相似的發(fā)現(xiàn)，即RGS19高表達(dá)患者的總生存時(shí)間及無復(fù)發(fā)生存時(shí)間均低于低表達(dá)患者，并通過Cox分析發(fā)現(xiàn)RGS19是腎透明細(xì)胞癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。眾所周知，影響結(jié)腸癌預(yù)后的因素包括腫瘤的快速增殖和腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示結(jié)腸癌中高表達(dá)RGS19與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，RGS19高表達(dá)者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移早，生存時(shí)間短，預(yù)后差。因此，檢測(cè)RGS19的表達(dá)水平對(duì)判定結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移與預(yù)后有一定臨床價(jià)值。RGS19促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未明確。WANG等[19]研究發(fā)現(xiàn)，RGS19能結(jié)合GIPC蛋白，激活PI3K/Akt通路。該通路是介導(dǎo)細(xì)胞增殖、存活和遷移的常見信號(hào)通路；同時(shí)Akt磷酸化使MDM2從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，可使p53核失活，可進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[20]。本研究推測(cè)在結(jié)腸癌中RGS19可能有相似的作用機(jī)制。以上研究提示，RGS19在結(jié)腸癌中上調(diào)可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，可成為結(jié)腸癌預(yù)后判定的潛在指標(biāo)，有必要就其具體機(jī)制，從分子水平、細(xì)胞水平和臨床水平進(jìn)行多層面的研究。

綜上所述，RGS19在結(jié)腸癌患者中呈高表達(dá)，是影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素，可作為結(jié)腸癌診斷、預(yù)后判斷的標(biāo)志物以及治療的新靶點(diǎn)[20]。