鮑群麗 萬(wàn)淑瓊 黃耿 汪宏良 柯俊 尚小玲

1鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 435000；2鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院婦科 435000；3鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科 435000

卵巢癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，70%的卵巢癌患者確認(rèn)時(shí)已處于晚期，5年生存率較低［1-2］。卵巢癌的高復(fù)發(fā)率和增殖是導(dǎo)致卵巢癌預(yù)后差的主要原因［3］。微小RNA（miRNA，miR）在卵巢癌細(xì)胞增殖中的作用及相關(guān)研究引起學(xué)者廣泛的重視［4］。miRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為存在顯著相關(guān)性［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-1277-5p是一種由24個(gè)核苷酸組成的miRNA，其在胃癌中發(fā)揮抑癌基因作用［7］。miR-1277-5p對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用并不清楚。本研究通過(guò)構(gòu)建miR-1277-5p過(guò)表達(dá)細(xì)胞系，觀察miR-1277-5p表達(dá)變化對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 卵巢癌細(xì)胞SKOV-3購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；McCoy's 5A培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒購(gòu)于大連寶生物公司；結(jié)晶紫購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；對(duì)照模擬物、miR-1277-5p模擬物購(gòu)于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Lipofectamine 3000購(gòu)于美國(guó)Life Technologies公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；一抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的免疫球蛋白G（IgG）二抗購(gòu)于美國(guó)CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 選擇含10%胎牛血清的McCoy's 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)SKOV-3細(xì)胞，培養(yǎng)條件選擇37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。按比例將稀釋的對(duì)照模擬物、miR-1277-5p模擬物與Lipofectamine 3000混合，室溫孵育15 min形成復(fù)合物，NC組為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)照模擬物，miR-1277-5p組為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-1277-5p模擬物。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)miR-1277-5p、PHD鋅指蛋白8（PHF8）mRNA表達(dá) TRIzol試劑盒提取NC組和miR-1277-5p組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)擴(kuò)增，引物序列如下，PHF8引物正向序列：5’-GTGCCGGTGTATTGCCTCT-3’，反 向 序 列：5’-CAACACAACTGCCATGAAACC-3’；甘油醛-3-磷酸脫氫 酶（GAPDH）引 物 正 向 序 列 ：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反 向 序 列：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；miR-1277-5p引物正向序列：5’-TACGTAGATATATATGTATTTT-3’，反向序列：5’-GGTGCCAAGGCTTGCATTCA-3’；RNU6引物正向序列：5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’，反向序列：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。以GAPDH和RNU6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析所得qRT-PCR結(jié)果。

1.4 平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV-3細(xì)胞增殖 使用胰酶消化各組SKOV-3細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，每孔1×103個(gè)接種至6孔板，培養(yǎng)10 d至肉眼可見(jiàn)集落，使用甲醇溶液固定20 min、0.1%結(jié)晶紫染色20 min，拍照并計(jì)數(shù)集落數(shù)量。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SKOV-3細(xì)胞凋亡 使用胰酶消化各組SKOV-3細(xì)胞，使用1×Binding Buffer緩沖液洗滌1次，加入100μl異硫氰酸熒光素（FITC）試劑到細(xì)胞管，加入5μl PI試劑，培養(yǎng)箱內(nèi)15 min。加入400μl 1×Binding Buffer緩沖液到細(xì)胞管，1 h內(nèi)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)每組細(xì)胞凋亡率。

1.6 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測(cè)PHF8蛋白的表達(dá) 使用細(xì)胞裂解液提取各組SKOV-3細(xì)胞總蛋白，電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，使用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉，加入稀釋的一抗4℃孵育過(guò)夜，加入IgG二抗室溫孵育2 h，使用電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯影液進(jìn)行顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組SKOV-3細(xì)胞中miR-1277-5p的表達(dá) NC組和miR-1277-5p組SKOV-3細(xì)胞中miR-1277-5p的表達(dá)分別為（1.22±0.42）和（13.22±1.42），miR-1277-5p組相比NC組上調(diào)了10.84倍（t=8.12，P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 NC組和miR-1277-5p組SKOV-3細(xì)胞中miR-1277-5p的表達(dá)

2.2 miR-1277-5p對(duì)SKOV-3細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞平板集落形成試驗(yàn)顯示（圖2），NC組和miR-1277-5p組集落形成數(shù)分別為（150.70±18.69）個(gè)和（67.97±14.82）個(gè)，NC組集落的數(shù)量高于miR-1277-5p組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.93，P＜0.01），表明miR-1277-5p過(guò)表達(dá)抑制SKOV-3細(xì)胞增殖。

圖2 miR-1277-5p對(duì)SKOV-3細(xì)胞增殖的影響

2.3 miR-1277-5p對(duì)SKOV-3細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)顯示（圖3），NC組和miR-1277-5p組細(xì)胞凋亡率分別為（6.17±1.63）%和（26.12±2.99）%，NC組凋亡率少于miR-1277-5p組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.86，P＜0.01），表明miR-1277-5p過(guò)表達(dá)促進(jìn)SKOV-3細(xì)胞凋亡。

圖3 miR-1277-5p對(duì)SKOV-3細(xì)胞凋亡的影響

2.4 miR-1277-5p對(duì)PHF8 mRNA表達(dá)的影響 如圖4，本研究通過(guò)RNAhybrid預(yù)測(cè)miR-1277-5p的靶基因可能是PHF8。NC組和miR-1277-5p組SKOV-3細(xì)胞中PHF8mRNA的表 達(dá) 分 別為（2.01±0.41）和（0.20±0.06），表明miR-1277-5p可 抑 制PHF8 mRNA的 表 達(dá)（t=4.32，P＜0.01）。

圖4 miR-1277-5p與PHF8 mRNA的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)

2.5 miR-1277-5p對(duì)PHF8蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果表明（圖5），與NC組相比，miR-1277-5p組SKOV-3細(xì)胞PHF8蛋白減少，周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）表達(dá)降低，抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)降低。

圖5 高表達(dá)miR-1277-5p對(duì)SKOV-3細(xì)胞PHF8蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

研究顯示，卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展受miRNA的調(diào)控［3，8］。miRNA如miR-485-5p［9］、miR-665［10］在卵巢癌中高表達(dá)，可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。miRNA如miR-584［11］、miR-199b-3p［12］在卵巢癌中低表達(dá)，抑制卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。通過(guò)研究miRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響來(lái)尋找腫瘤治療靶點(diǎn)，已成為當(dāng)前卵巢癌治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。Wei等［7］研究顯示，miR-1277-5p在胃癌組織中低表達(dá)，上調(diào)miR-1277-5p可抑制胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，miR-1277-5p在胃癌中發(fā)揮腫瘤抑制作用。miR-1277-5p在卵巢癌細(xì)胞中的作用并不清楚。本研究表明，過(guò)表達(dá)miR-1277-5p后，卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖降低，細(xì)胞凋亡增多，可見(jiàn)miR-1277-5p在卵巢癌細(xì)胞中表現(xiàn)為抑癌基因的作用。

miRNA主要通過(guò)結(jié)合靶基因mRNA的非翻譯區(qū)，抑制mRNA的翻譯或者直接誘導(dǎo)其降解，從而干擾靶基因蛋白的表達(dá)［13-14］。本研究通過(guò)RNAhybrid預(yù)測(cè)miR-1277-5p的靶基因可能是PHF8。PHF8蛋白是一種組蛋白去甲基化酶，通過(guò)去甲基化修飾組蛋白的賴氨酸殘基，調(diào)控基因的表達(dá)［15］。PHF8在前列腺癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤中高表達(dá)，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等生物學(xué)行為，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［16］。本研究顯示，增強(qiáng)miR-1277-5p表達(dá)后SKOV-3細(xì)胞中PHF8基因表達(dá)明顯降低，提示miR-1277-5p可靶向抑制PHF8的表達(dá)。miR-1277-5p抑制PHF8表達(dá)后，SKOV-3細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白CDK2表達(dá)降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，表明SKOV-3細(xì)胞的增殖降低、凋亡增加。

綜上所述，增加miR-1277-5p表達(dá)可降低卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其可能是通過(guò)抑制PHF8基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)，miR-1277-5p在卵巢癌的靶向治療中可能具有一定的應(yīng)用前景。

利益沖突：作者已申明文章無(wú)相關(guān)利益沖突。