萬(wàn)淑瓊 鮑群麗 黃耿 姜艷萍 張青冬 王楚平

1鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院婦科 435000；2鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 435000；3鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科 435000

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率近年來(lái)持續(xù)上升，威脅女性健康［1］。宮頸癌的發(fā)生是正常宮頸上皮細(xì)胞由增生到癌變的復(fù)雜過(guò)程，發(fā)病因素包括早婚、多產(chǎn)及病毒感染等［2］。深入探究宮頸癌發(fā)病相關(guān)分子機(jī)制對(duì)宮頸癌的防治具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）無(wú)蛋白編碼功能，是一類(lèi)長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的RNA［3-5］。lncRNA在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、端粒維護(hù)、DNA與蛋白結(jié)合等生物學(xué)過(guò)程中起到重要作用，影響細(xì)胞的行為和功能，與各種疾病的發(fā)生顯著相關(guān)［6-8］。既往大量研究表明，lncRNA在宮頸癌中表達(dá)上升或降低，參與調(diào)節(jié)宮頸上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化［9］。RAB30-AS1是一個(gè)尚未被報(bào)道的lncRNA，由607個(gè)核苷酸構(gòu)成。本研究探究RAB30-AS1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 宮頸癌細(xì)胞Hela購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒購(gòu)于大連寶生物公司；pcDNA-NC質(zhì)粒和pcDNA-RAB30-AS1質(zhì)粒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Edu試劑盒和膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程有限公司；Lipofectamine 3000購(gòu)于美國(guó)Life Technologies公司；一抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)于美國(guó)CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將Hela細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hela細(xì)胞，分別將pcDNA-NC質(zhì)粒和pcDNA-RAB30-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞，分別命名為NC組和RAB30-AS1組，轉(zhuǎn)染過(guò)程參照Lipofectamine 3000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)RAB30-AS1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5（GPC5）mRNA表達(dá) 收集各組Hela細(xì)胞，Trizol法提取RNA，應(yīng)用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qRT-PCR反應(yīng)體系為20μl，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算RAB30-AS1、GPC5 mRNA的表達(dá)。引物序列如下，GPC5引物正向序列：5’-TCTAATATCTCGAAATGCGGCTG-3’，反 向 序 列：5’-GGCCATGTTCCTGTAGGTACTG-3’；RAB30-AS1引物正向序列：5’-GAAGACAAGAGGGCCCTAG-3’，反向序列：5’-AAGCAATGGGCGACAGAC-3’；GAPDH引物正向序列：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反 向 序 列：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.4 Edu試驗(yàn)檢測(cè)Hela細(xì)胞增殖情況 調(diào)整兩組Hela細(xì)胞濃度并接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿，加入Edu染料A液孵育5 h；清洗細(xì)胞后，加入甲醛固定20 min；清洗細(xì)胞后，加入TritonX-100試劑孵育15 min；清洗細(xì)胞后，加入Click-iT雞尾酒反應(yīng)液避光孵育20 min；清洗細(xì)胞后，加入Hoechst 33342試劑避光孵育20 min；清洗細(xì)胞后，在激光共聚焦顯微鏡下計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)和增殖細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞增殖率＝增殖細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Hela細(xì)胞凋亡率 收集兩組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，采用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗3次，加入600μl結(jié)合緩沖液，加入10μl Annexin V-FITC，加入10μl PI，在暗室孵育20 min，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hela細(xì)胞凋亡率。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)靶基因蛋白的表達(dá) 收集兩組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度后，蛋白上樣在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）中反應(yīng)，電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶室溫下封閉，4℃條件下一抗中孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h。洗膜后，加入電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯影液曝光，通過(guò)Image J軟件分析條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組Hela細(xì)胞中RAB30-AS1的表達(dá) 如圖1，Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，NC組和RAB30-AS1組Hela細(xì)胞中RAB30-AS1的 表 達(dá) 分 別 為（1.34±0.27）和（8.90±1.60），RAB30-AS1組 相 比NC組 上 調(diào) 了6.64倍（t＝4.65，P＜0.01）。

圖1 NC組和RAB30-AS1組宮頸癌Hela細(xì)胞中RAB30-AS1的表達(dá)

2.2 RAB30-AS1對(duì)Hela細(xì)胞增殖活性的影響 NC組和RAB30-AS1組Hela細(xì)胞增殖率分別為（41.82±2.86）%和（20.85±3.82）%，RAB30-AS1組細(xì)胞增殖率明顯低于NC組（t＝4.39，P＜0.01）；表明RAB30-AS1過(guò)表達(dá)抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖活性（圖2）。

圖2 高表達(dá)RAB30-AS1對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 RAB30-AS1對(duì)Hela細(xì)胞凋亡率的影響 NC組和RAB30-AS1組Hela細(xì)胞凋亡率分別為（12.61±1.96）%和（32.19±4.29）%，RAB30-AS1組細(xì)胞凋亡率明顯高于NC組（t＝4.16，P＜0.01）；提示RAB30-AS1過(guò)表達(dá)可促進(jìn)宮頸癌Hela細(xì)胞的凋亡（圖3）。

圖3 RAB30-AS1對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡率的影響

2.4 RAB30-AS1對(duì)GPC5 mRNA表達(dá)的影響 如圖4，NC組和RAB30-AS1組Hela細(xì)胞中GPC5 mRNA的表達(dá)分別為（1.17±0.11）和（5.72±0.90）；表明RAB30-AS1可促進(jìn)GPC5 mRNA的表達(dá)（t＝5.01，P＜0.01）。

圖4 RAB30-AS1對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞GPC5 mRNA表達(dá)的影響

2.5 RAB30-AS1對(duì)GPC5蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果（圖5）表明，與NC組相比，RAB30-AS1組Hela細(xì)胞GPC5蛋白增加，細(xì)胞周期Cyclin H表達(dá)降低，促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加。

圖5 高表達(dá)RAB30-AS1對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞GPC5蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

lncRNA與前列腺癌、腎癌、宮頸癌等腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為顯著相關(guān)［10-11］。Zhang等［12］報(bào)道，lncRNA MIAT在宮頸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，其能夠促進(jìn)宮頸癌中的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，敲低lncRNA MIAT會(huì)導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲被抑制。Zhou等［13］報(bào)道，在宮頸癌中l(wèi)ncRNA EWSAT1的表達(dá)增強(qiáng)，并可導(dǎo)致患者的不良預(yù)后，下調(diào)EWSAT1通過(guò)靶向miR-330-5p抑制了宮頸癌Hela細(xì)胞的遷移、增殖和侵襲。RAB30-AS1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，RAB30-AS1過(guò)表達(dá)后，宮頸癌Hela細(xì)胞增殖率顯著降低，細(xì)胞凋亡率明顯增加，提示RAB30-AS1在宮頸癌細(xì)胞中表現(xiàn)為抑癌作用。

GPC5蛋白屬于Glypican蛋白家族，負(fù)責(zé)編碼細(xì)胞表面蛋白聚糖［14］。GPC5蛋白在胰腺癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等腫瘤表達(dá)顯著降低，在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用［15-16］。上調(diào)GPC5蛋白能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、化療抵抗等惡性生物學(xué)行為，GPC5表現(xiàn)為抑癌作用［17］。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)RAB30-AS1后Hela細(xì)胞中GPC5基因的表達(dá)顯著升高，提示RAB30-AS1可促進(jìn)GPC5基因的表達(dá)，GPC5可能是RAB30-AS1的靶基因。RAB30-AS1促進(jìn)GPC5基因表達(dá)后，Hela細(xì)胞周期Cyclin H表達(dá)降低，促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加，間接提示Hela細(xì)胞增殖活性降低，細(xì)胞凋亡增加。

綜上所述，RAB30-AS1可能通過(guò)上調(diào)GPC5基因表達(dá)，抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，RAB30-AS1可能成為宮頸癌靶向治療的新靶點(diǎn)。

利益沖突：作者已申明文章無(wú)相關(guān)利益沖突。