宋和勇 王紅練 王淼舟 王亞峰 楊卉 朱奎德

(1青海省第五人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，青海 西寧 810006；青海大學(xué)附屬醫(yī)院 2檢驗(yàn)科；3腫瘤內(nèi)科；4青海省人民醫(yī)院藥學(xué)部；5青海大學(xué)附屬醫(yī)院臨床藥學(xué)科)

糖尿病(DM)現(xiàn)已成為危害人類健康的重要疾病之一，中國(guó)DM患者發(fā)病率約9.5%〔1〕。DM腎病(DN)是一種發(fā)病隱匿的DM微血管并發(fā)癥，發(fā)病早期患者常無(wú)自覺(jué)癥狀，一旦出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室檢查異常及臨床癥狀，已進(jìn)入DN晚期或終末期腎衰竭。而目前晚期DN的治療手段有限，以透析為主，透析后治療效果不佳，且患者生存期較短〔2〕。DN發(fā)病機(jī)制對(duì)于疾病的預(yù)測(cè)及預(yù)后及開(kāi)發(fā)有效的治療方式相當(dāng)重要。然而DN的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前主要認(rèn)為在高血糖狀態(tài)下，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生紊亂導(dǎo)致胰島素抵抗、炎性介質(zhì)的釋放現(xiàn)象發(fā)生及腎臟血流的改變。DN病理改變包括：腎小球基底膜逐漸增厚、系膜基質(zhì)逐漸增生、K-W結(jié)節(jié)逐漸形成、血管玻璃樣變從而導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維。研究顯示DM狀態(tài)下，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1和重組結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)等腎組織纖維化相關(guān)因子參與纖維化的病理過(guò)程〔3,4〕。TGF-β1有多種生理功能，在腎臟纖維化中起重要角色〔5〕。在TGF-β1發(fā)揮促進(jìn)腎臟纖維化的下游因子中，由半胱氨酸構(gòu)成的CTGF也參與調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的過(guò)程〔6〕。研究表明TGF-β1和CTGF二者均參與心肌纖維化過(guò)程，且協(xié)同促進(jìn)心肌細(xì)胞纖維化作用〔7〕。二甲雙胍可通過(guò)減輕體內(nèi)的氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬等降低血糖，并有一定抑制組織纖維化的作用，從而發(fā)揮對(duì)腎臟保護(hù)作用〔8,9〕。本研究旨在探究二甲雙胍對(duì)DM大鼠血糖的控制作用及對(duì)腎組織中TGF-β1和CTGF表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 34只健康雄性(SD)大鼠，8周齡，體重：180～220 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供〔合格證號(hào)碼：SCXK(滬)2008-0016〕。所有SD大鼠在室溫22～24℃，相對(duì)濕度45%～55%，12 h晝夜循環(huán)的動(dòng)物房中進(jìn)行飼養(yǎng)。鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。二甲雙胍(國(guó)藥準(zhǔn)字H20023370，規(guī)格0.5 g/片)購(gòu)自中美上海施貴寶制藥有限公司、格列本脲(國(guó)藥準(zhǔn)字H44021808，規(guī)格2.5 mg/片)購(gòu)自廣東三才石歧制藥有限公司。尿肌酐(Ucr)檢測(cè)試劑盒(尿酶法)、尿素氮(BUN)試劑盒(苦味酸比色法)購(gòu)自南京建成科技公司。尿微量白蛋白(UAlb)放射免疫試劑盒(RIA法)購(gòu)自天津市協(xié)和公司。CTGF及TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。ABI7500型擴(kuò)增儀，DS-5型糖化血紅蛋白(HbA1c)檢測(cè)儀。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.12型DM(T2DM)大鼠模型的建立及分組 34只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，將大鼠隨機(jī)分為正常(Con)組(n=8)和DM組、二甲雙胍組、格列本脲組共26只。正常組給予正常飼料喂養(yǎng)，其余26只大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)(高脂飼料：15%豬油、5%芝麻油、20%蔗糖、2.5%膽固醇和57.5%正常飼料混合而成)。飼養(yǎng)6 w，喂養(yǎng)高脂飼料大鼠體重達(dá)到300 g左右時(shí)，禁食不禁水12 h后腹腔注射35 mg/kg STZ檸檬酸鈉緩沖溶液(0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH4.5)進(jìn)行DM造模。Con組腹腔注射等劑量的檸檬酸鈉緩沖溶液。7 d后，各組大鼠在乙醚麻醉狀態(tài)下從眼底靜脈取血測(cè)定空腹血糖(FPG)，取FPG>11.1 mmol/L的大鼠作為T(mén)2DM造模成功大鼠，共計(jì)24只。造模成功大鼠隨機(jī)分為3組：DM組、二甲雙胍組、格列本脲組，各8只。DM組每天灌胃生理鹽水，二甲雙胍組每天灌胃300 mg/(kg·d)的二甲雙胍，格列本脲組每天灌胃5 mg/(kg·d)格列本脲，繼續(xù)給予高脂飼養(yǎng)。

1.2.2生化指標(biāo)測(cè)定及尿TGF-β1和CTGF含量的測(cè)定 DM組灌胃給藥8 w后，各組禁食24 h，將各組放置于代謝籠中，收集大鼠12 h隨機(jī)尿液，混勻后取5 ml在3 000 r/min條件下離心10 min，取上清，利用試劑盒檢測(cè)尿TGF-β1和CTGF含量；各組在10%水合氯醛麻醉下抽取腹主動(dòng)脈血，利用試劑盒檢測(cè)HbA1c、Ucr、BUN、UAlb；計(jì)算尿TGF-β1與Ucr比值UTCR，CTGF與Ucr比值UCTR，UAlb與Ucr比值UACR用于表示尿液中TGF-β1、CTGF和UAlb的含量；取出腎組織，用生理鹽水反復(fù)沖洗去除腎包膜后，將左腎部分組織置于液氮罐里用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)，余腎標(biāo)本用于蘇木素-伊紅(HE)染色及Western印跡檢測(cè)。

1.2.3RT-PCR檢測(cè)腎組織中TGF-β1和CTGF mRNA表達(dá)水平 剪取各組一定量腎組織，于Trizol下研磨提取腎組織中RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中反轉(zhuǎn)錄酶來(lái)進(jìn)行體外互補(bǔ)DNA(cDNA)合成過(guò)程。以合成的cDNA為模板，按如下反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸1 min熱循環(huán)40次；95℃ 15 s、60℃ 1 min 及95℃ 15 s，循環(huán)1次。采用△△Ct法分析Ct值，以2-△△Ct來(lái)計(jì)算目的基因與參比基因(β-actin)。目的基因及參比基因的引物如下：CTGF引物：上游：5′-TCAACCTCAGACACTGGTTTCG-3′，下游：5′-TAG-AGCAGGTCTGTCTGCAAGC-3′;TGF-β1引物：上游：5′-GTCTCCCAAGGAAAGGTAGG-3′，下游：5′-CTCTTGAGTCCCTCGCATCC-3′;β-actin引物：上游：5′-TGAGAAACGGCTACCACATCC-3′，下游：5′-GCACCAGACTTGCCCTCCA-3′。

1.2.4Western印跡檢測(cè) 各組取約200 mg腎組織，4℃下剪碎，加入1 ml 含PMSF的RIPA 裂解液進(jìn)行勻漿，裂解30 min后，4℃下12 000 r/min離心30 min后取上清進(jìn)行蛋白定量并根據(jù)蛋白量統(tǒng)一每個(gè)樣本濃度為4 μg/ml。選擇10%分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離樣品。電泳完畢后濕法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入兔抗鼠TGF-β1一抗(1∶1 000)、CTGF一抗(1∶1 000)、β-actin一抗(1∶2 500)，4℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜3次后放入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的抗兔二抗(1∶5 000)中，室孵育2 h，TBST洗膜3次后上機(jī)顯影，由Image J 軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.5HE染色 將大鼠腎組織石蠟包埋后。將切片依次放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中浸泡20 min，隨后放入無(wú)水乙醇Ⅰ中5 min、無(wú)水乙醇Ⅱ中5 min；于75%乙醇中浸泡5 min，最后用超純水清洗；蘇木素染色5 min后超純水洗、返藍(lán)分色后梯度乙醇浸泡，伊紅染色5 s；脫水封片后利用顯微鏡觀察大鼠腎組織病理結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組生化指標(biāo)水平比較 與Con組比較，其余3組FPG、HbA1c、BUN、UTCR、UCTR、UCTR、UACR水平均顯著升高(均P<0.05)；與DM組比較，二甲雙胍組和格列本脲組FPG、HbA1c、BUN、UTCR、UCTR、UACR水平均顯著降低(均P<0.05)；與格列本脲組比較，二甲雙胍組BUN水平顯著增加(P<0.05)，但UTCR、UCTR、UACR水平顯著減少(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組生化指標(biāo)水平比較

2.2各組腎組織中TGF-β1和CTGF mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 與Con組相比，其余3組TGF-β1和CTGF mRNA、蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；與DM組相比，二甲雙胍組和格列本脲組TGF-β1和CTGF mRNA、蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；與格列本脲組相比，二甲雙胍組TGF-β1和CTGF mRNA、蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1,表2。

1～4：Con組，DM組，二甲雙胍組，格列本脲組圖1 Western印跡檢測(cè)各組CTGF和TGF-β1表達(dá)

表2 各組TGF-β1和CTGF mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

2.3各組腎臟病理變化 與Con組相比，其余3組腎小球體積增大、基底膜增厚、系膜基質(zhì)增多，腎小球致密斑出現(xiàn)。見(jiàn)圖2。對(duì)比DM組，二甲雙胍組及格列本脲組腎小球基底膜變薄、系膜基質(zhì)減少、腎小球致密斑減少，呈明顯改善，二甲雙胍組改善最為明顯。

圖2 各組腎臟組織形態(tài)(HE，×200)

3 討 論

二甲雙胍是T2DM的一線治療藥物，可通過(guò)對(duì)AMP激活蛋白酶(AMPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，抑制肝臟糖異生、脂質(zhì)合成，從而促進(jìn)肌肉對(duì)葡萄糖的利用，另一方面通過(guò)增加胰高糖素樣多肽-1的分泌，達(dá)到降低血糖、促進(jìn)胰島素分泌的作用。二甲雙胍還有改善胰島素抵抗，降低血漿胰島素水平從而達(dá)到治療DM的作用〔8,9〕。格列本脲是磺酰脲類降糖藥，抑制肝糖原分解、糖異生作用，導(dǎo)致葡萄糖輸出減少。總的作用為降低FPG和餐后血糖。對(duì)比格列本脲，二甲雙胍不會(huì)改變DM患者的胰島功能，對(duì)正常人幾乎無(wú)作用，對(duì)DM降血糖作用明顯〔10〕。CTGF和TGF-β1是各種腎臟病變纖維化發(fā)展過(guò)程中的重要標(biāo)志物，對(duì)腎臟纖維化起到調(diào)節(jié)作用，逐漸成為新治療靶點(diǎn)〔11〕。

本研究結(jié)果說(shuō)明DM大鼠的腎臟功能有所損傷，二甲雙胍和格列本脲處理后大鼠腎功能損傷程度有所緩解，二甲雙胍大鼠緩解的程度更高。這其中的原因可能為：一方面二甲雙胍可使AMP聚集，通過(guò)激活LKB1/AMPK信號(hào)通路，進(jìn)而抑制DM大鼠肝細(xì)胞中腺苷酸環(huán)化酶的合成，機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，進(jìn)一步抑制腸道對(duì)葡萄糖的二次吸收，另一方面抑制糖原異生作用，從而DM大鼠血糖降低、HbA1c水平下降〔12,13〕。本研究結(jié)果說(shuō)明DM大鼠腎功能發(fā)生明顯損傷，腎組織的損傷機(jī)制較高，而在二甲雙胍和格列本脲的作用下，腎組織損傷進(jìn)一步得到改善，二甲雙胍的作用尤為顯著。這其中可能的原因?yàn)椋篋M狀態(tài)下，CTGF表達(dá)增高，細(xì)胞有絲分裂和增殖功能增強(qiáng)，進(jìn)一步刺激成纖維細(xì)胞的活化和增殖，推動(dòng)成纖維細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化〔14〕，進(jìn)而使得腎組織纖維化。表達(dá)增加的TGF-β1和CTGF通過(guò)刺激成纖維細(xì)胞增加使基質(zhì)膜增厚導(dǎo)致腎實(shí)質(zhì)功能障礙；另一方面TGF-β1通過(guò)抑制多種基質(zhì)膜降解酶，纖連蛋白、層黏蛋白降解減少，導(dǎo)致基質(zhì)膜增厚。同時(shí)誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，導(dǎo)致基質(zhì)膜變厚，使得腎功能逐步損傷〔15，16〕。而給予二甲雙胍后，二甲雙胍通過(guò)激活A(yù)MPK通路，激活下游P-乙酰輔酶A和mTORC1來(lái)發(fā)揮抗纖維化的作用。再者，二甲雙胍激活A(yù)MPK后，降低活性氧簇的表達(dá)，進(jìn)而氧化應(yīng)激作用減少并進(jìn)一步阻斷TGF-β1的表達(dá)，從而阻斷下游因子CTGF的表達(dá)，減弱成纖維細(xì)胞的生成作用，減少膠原Ⅰ等成分的生成，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)膜的增厚，保護(hù)腎臟功能，抑制DN的發(fā)展〔17,18〕。

綜上，二甲雙胍可有效控制DM大鼠血糖升高，同時(shí)降低DM大鼠腎組織中TGF-β1和CTGF的表達(dá)水平，延緩基底膜的增厚、抑制系膜基質(zhì)的擴(kuò)張、減少腎小球致密斑的形成，改善腎組織纖維化程度，保護(hù)腎臟。