張丹丹，許騰騰，高迪，齊昕，寧偉，汝振遠，張翔棟，郭騰龍，申屠璐燕，于童，馬洋洋，李運生，張運海，曹祖兵

轉(zhuǎn)錄因子TEAD4對豬早期胚胎發(fā)育的調(diào)控

張丹丹，許騰騰，高迪，齊昕，寧偉，汝振遠，張翔棟，郭騰龍，申屠璐燕，于童，馬洋洋，李運生，張運海，曹祖兵*

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院/地方畜禽遺傳資源保護與生物育種安徽省重點實驗室，合肥 230036

【背景】眾所周知TEA結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子4（TEA domain transcription factor 4，TEAD4)是TEAD轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，在決定嚙齒類動物著床前胚胎的特性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在小鼠胚胎中發(fā)現(xiàn)，可以通過促進表達來參與調(diào)控著床前胚胎滋養(yǎng)層細胞的譜系分化。若當小鼠胚胎中缺乏時可導(dǎo)致小鼠囊胚形成失敗。然而，在豬早期胚胎發(fā)育中的作用尚不清楚。【目的】通過初步闡明對豬早期胚胎發(fā)育的影響，以期為進一步探索轉(zhuǎn)錄因子對豬早期胚胎發(fā)育的分子機制奠定理論基礎(chǔ)。【方法】利用網(wǎng)頁版工具對豬進行生物信息學(xué)分析，主要包括對豬序列的分析，豬與人、小鼠之間同源性的比較，以及在不同物種之間進化關(guān)系的比較。再通過試驗檢測在豬早期胚胎發(fā)育中的作用。首先采用熒光定量PCR技術(shù)檢測在豬卵母細胞和早期胚胎中mRNA表達水平，再通過設(shè)計靶向TEAD4的siRNA，采用顯微注射技術(shù)注入成熟卵母細胞中，降低卵胞質(zhì)內(nèi)源性的水平，并確定TEAD4 siRNA僅作用于，以期確定在豬早期胚胎發(fā)育中的作用?！窘Y(jié)果】 序列分析結(jié)果顯示：豬包含11個外顯子，定位于5號染色體上，跨越長度37.188 kb，mRNA全長1 473 bp，編碼區(qū)全長1 305 bp，編碼434個氨基酸；與人、小鼠的同源性分析揭示在不同物種中的保守性較高；且在豬和牛上的親緣關(guān)系最近。熒光定量PCR檢測基因表達水平結(jié)果顯示：mRNA在豬卵母細胞和早期胚胎中均有表達，且以GV期卵母細胞為參照時比較發(fā)現(xiàn)，MII期卵母細胞表達量最低，并保持較低水平直至4-細胞時期，但到8-細胞時期表達量達到最高，而到桑椹胚和囊胚時期又逐漸下降。通過顯微注射靶向TEAD4的siRNA發(fā)現(xiàn)：TEAD4 siRNA僅作用于卵母細胞中內(nèi)源性的，而對和不發(fā)揮作用；并與對照組和陰性對照siRNA組相比，注射TEAD4 siRNA顯著降低8-細胞和桑椹胚時期mRNA表達量，敲低效率達到80%。當敲低表達時觀察豬孤雌激活和體外受精胚胎的發(fā)育效率表明，與對照組和陰性對照siRNA組相比，顯著降低TEAD4 siRNA敲低組從8-細胞至囊胚階段的發(fā)育效率?！窘Y(jié)論】在各物種間保守性高，在豬和牛上的親緣性最近，可參與調(diào)控豬早期胚胎的發(fā)育。

豬；早期胚胎；；孤雌激活；體外受精

0 引言

【研究意義】豬作為重要的家畜和典型的疾病模型，其正常生長發(fā)育可促進畜牧業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展和推動生物醫(yī)學(xué)進步[1-3]。以豬胚胎為基礎(chǔ)延伸出的體外受精、體細胞核移植等輔助生殖技術(shù)在優(yōu)良種豬選育、擴繁、種質(zhì)資源保存、基因編輯豬創(chuàng)制、人類疾病模型制備及發(fā)育生物學(xué)基礎(chǔ)研究等方面具有十分重要的應(yīng)用價值[4-5]。然而，豬與其他動物（小鼠、牛及人）相比，體外生產(chǎn)的胚胎發(fā)育效率依然很低[6-7]，究其原因主要是對豬著床前胚胎發(fā)育機制缺乏足夠的了解?！厩叭搜芯窟M展】早期胚胎作為哺乳動物生長發(fā)育的起點，將經(jīng)歷精卵結(jié)合形成單細胞受精卵、胚胎細胞分裂增殖、胚胎基因組激活、桑椹胚致密化和囊胚形成。囊胚是哺乳動物胚胎中最為獨特的結(jié)構(gòu)[7]，主要包括早期囊胚、擴張囊胚和孵化囊胚3個階段。隨著囊胚的發(fā)育，外周細胞分化形成滋養(yǎng)外胚層（trophectoderm, TE），內(nèi)部細胞集群形成內(nèi)細胞團（inner cell mass, ICM）[8]，即完成第一次譜系分化。第一次譜系分化在哺乳動物早期胚胎的發(fā)育中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[9]。已有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子在滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細胞團分化即第一次譜系分化中起主導(dǎo)作用[10]。在小鼠胚胎干細胞研究中發(fā)現(xiàn)，Oct4和Cdx2間的相互拮抗作用參與調(diào)控內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)外胚層的分化[11]。在小鼠著床前胚胎發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)，HIPPO信號通路的激活誘導(dǎo)下游效應(yīng)蛋白YAP轉(zhuǎn)移至細胞核，促使卵裂球向內(nèi)細胞團發(fā)育，而當HIPPO信號失活時可以誘導(dǎo)YAP激活，并與轉(zhuǎn)錄因子TEAD4結(jié)合，從而介導(dǎo)滋養(yǎng)外胚層分化[12]。在豬著床前胚胎發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)，CDX2在囊胚后期滋養(yǎng)層中特異性表達，OCT4在內(nèi)細胞團中特異性表達[13]。最新研究發(fā)現(xiàn)，OCT4和YAP均參與調(diào)控豬囊胚的形成[13-14]。TEAD（transcriptional enhanced associated domain）蛋白是HIPPO信號通路下游效應(yīng)因子YAP結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子[15]，可以調(diào)控細胞增殖、干細胞命運等生物學(xué)過程[16-17]。TEAD蛋白家族包括4個成員，即：TEAD1、TEAD2、TEAD3和TEAD4。研究發(fā)現(xiàn)，TEAD1可促進心臟特定基因的表達，對心肌分化十分重要[18]；TEAD2可能參與調(diào)控神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的基因；YAP/TEAD3可以共同調(diào)控由人多能干細胞誘導(dǎo)而成的心肌細胞分化[19]；TEAD4與胚胎植入密切相關(guān)[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，TEAD4可以參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[21]，介導(dǎo)哺乳動物早期胚胎中第一次譜系分化的發(fā)生[22]。同時，TEAD4對小鼠早期胚胎發(fā)育中滋養(yǎng)層細胞的形成和發(fā)育也至關(guān)重要[23-24]。但隨著進一步研究發(fā)現(xiàn)，TEAD4在小鼠囊胚形成和發(fā)育中的作用仍存在一定的爭議。如：早期研究發(fā)現(xiàn)常規(guī)氧分壓條件下TEAD4敲除并沒有影響囊胚形成，而最新研究發(fā)現(xiàn)低氧條件下，TEAD4敲除導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯未能形成囊胚[25]。此外，TEAD4還對早期胚胎發(fā)育中能量平衡維持發(fā)揮關(guān)鍵作用[26]。另外，發(fā)現(xiàn)TEAD4和CCN2相互作用是牛囊胚滋養(yǎng)層細胞發(fā)育中相關(guān)基因表達所必需的[27]?！颈狙芯壳腥朦c】綜合以上研究表明，TEAD4在哺乳動物早期胚胎發(fā)育中具有極其重要的作用，但TEAD4在豬早期胚胎發(fā)育中的作用和功能仍需進一步研究和發(fā)現(xiàn)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗以豬胚胎為研究對象，旨在揭示TEAD4在豬早期胚胎發(fā)育中的作用，為深入研究TEAD4調(diào)控豬早期胚胎發(fā)育機制奠定基礎(chǔ)，以及為提高胚胎正常生長發(fā)育，最終推動畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的快速穩(wěn)定發(fā)展提供可能。

1 材料與方法

所有試驗均于2018年12月至2019年6月在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)地方畜禽遺傳資源保護與生物育種安徽省重點實驗室完成。Control組為未注射任何siRNA，未經(jīng)任何處理的組別，negative control注射陰性對照siRNA組。

1.1 材料

獲取合肥雨潤屠宰場杜洛克×長白×大白三元雜交母豬卵巢和合肥安泰種豬育種公司成年公豬精液。

1.2 試劑

除特殊標注和說明外，本試驗中所有化學(xué)試劑和用品均從美國Sigma公司購買。

1.3 試驗方法

1.3.1 豬生物信息學(xué)分析 首先，利用NCBI和UCSC官網(wǎng)查找豬TEAD4基因生物學(xué)信息，包含外顯子個數(shù)、染色體定位、跨越長度、mRNA 長度、CDS 長度、編碼氨基酸個數(shù)、以及CDS和AA序列等。根據(jù)不同物種CDS和AA序列，利用DNAMAN和MEGA軟件分別比較在不同物種間的同源性，以及分析在不同物種間的進化關(guān)系。

1.3.2 豬卵母細胞體外成熟 用含雙抗的生理鹽水將卵巢清洗干凈后置于38.5 ℃水浴鍋中，一次性注射器抽取直徑3—6 mm卵泡中的卵泡液。將卵泡液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中靜置沉淀。用巴斯德吸管棄去上清，加入15 mL洗卵液吹打混勻，平均分至四個直徑為60 mm培養(yǎng)皿中，挑選出胞質(zhì)致密均勻且包裹2層及以上的卵丘卵母細胞復(fù)合物（cumulus-oocyte complexs, COCs）。用體外成熟液清洗COCs后轉(zhuǎn)移至已加入豬體外成熟液（TCM199基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入P.G-600、胎牛血清、豬卵泡液、青霉素和鏈霉素、L-半胱氨酸、表皮生長因子）的四孔板中（100枚/孔），38.5 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40—44 h。將成熟后COCs移入透明質(zhì)酸酶液滴中，用移液器反復(fù)吹打去除周圍包裹的卵丘細胞，再用T2（TCM199基礎(chǔ)培養(yǎng)基 + 2 % 胎牛血清）液滴將卵母細胞清洗干凈并移至T2液滴的培養(yǎng)皿，挑選排出第一極體的MII期卵母細胞備用。

1.3.3 顯微注射 提前做好操作帶并放入培養(yǎng)箱中預(yù)熱平衡，將挑選出的MII期卵母細胞移入操作帶下方，在顯微操作儀上開始注射。先用固定針固定一枚MII期卵母細胞，用注射針撥動卵母細胞找到第一極體，將極體調(diào)至6點或12點鐘方向。注射針吸取10 pL siRNA（表1）后從3點鐘方向進針，破膜完成后勻速注入siRNA。結(jié)束后將MII期卵母細胞移入PZM-3培養(yǎng)皿中恢復(fù)15 min。

1.3.4 孤雌激活及胚胎培養(yǎng) 38.5℃提前預(yù)熱f 2（向胚胎培養(yǎng)水中分別加入PVA、CaCl2·2H2O、甘露醇、MgCl2·6H2O、和HEPES）、PZM-3液體（向胚胎培養(yǎng)水中分別加入MgSO4、KH2PO4、NaCl、KCl、NaHCO3、青霉素和鏈霉素、丙酮酸鈉、L-谷氨酰胺、亞?；撬?、肌醇、乳酸鈣、胎牛血清以及必需氨基酸和非必需氨基酸），先用f 2液體將排除第一極體的MII期卵母細胞清洗2遍。放入1枚MII期卵母細胞于融合槽中試電，通電后將余下MII期卵母細胞移入融合槽并一字排開，進行一次電激活（直流電 156 V、80 μs）。結(jié)束后將MII期卵母細胞移出并用PZM-3液體清洗2遍，移入PCC（向配制好的PZM-3培養(yǎng)液中加入細胞松弛素和放線菌酮）培養(yǎng)皿中，38.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中化學(xué)激活4 h。4 h后將胚胎移入PZM-3培養(yǎng)皿中，38.5 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。

1.3.5 體外受精及胚胎培養(yǎng) 第一，處理精液：取兩頭不同品種的豬（如：大白和杜洛克）精液各3 mL于15 mL離心管并吹打混勻。取1 mL混合均勻后的精液于1.5 mL離心管中，共2管，1 200 r/min離心3 min。棄上清加入1 mL 精子洗滌液（向杜氏磷酸鹽緩沖液中加入他牛血清以及青霉素和鏈霉素），吹打混勻后1 200 r/min離心3 min；棄上清加入1 mL 豬體外受精液（向胚胎培養(yǎng)水中分別加入NaCl、KCl、Tris、D-葡萄糖、CaCl2·2H2O、丙酮酸鈉、咖啡因和胎牛血清），吹打混勻后1 200 r/min離心3 min；棄上清加入1 mL 豬體外受精液，吹打混勻后轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管，38.5 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中上浮1 h。第二，精子上浮30 min后用豬體外受精液將MII期卵母細胞清洗干凈，每50 μL豬體外受精液滴中放入15枚MII期卵母細胞。精子上浮1 h后，檢測精子密度和精子活力并將精液濃度調(diào)為2× 105個/mL。接著向豬體外受精液滴中依次加入50 μL稀釋好的精液，38.5℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中孵育5 h。5 h后，將卵母細胞移入PZM-3液體中，用移液器反復(fù)吹打直至卵母細胞透明帶上無精子附著，接著分別對negative control和siRNA組卵母細胞顯微注射negative control siRNA和siRNA。最后轉(zhuǎn)移至PZM-3四孔板中，38.5 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。

1.3.6 熒光定量PCR 定量試劑盒（AceQ qPCR SYBR Green Master Mix, Vazyme, 中國南京），按下述配制反應(yīng)體系：2×SYBR Green 7.5 μL，50×Dye 1 0.3 μL，cDNA 1.5 μL，F(xiàn)orward Primer 0.5 μL，Reverse primer 0.5 μL，RNase-free water 4.7 μL（引物詳細信息見表2）。混勻后加入八連管，蓋好管蓋，并置于PCR儀器中。反應(yīng)條件如下：95 ℃、10 min，95 ℃、10 s，60 ℃、1 min，最后兩步循環(huán)數(shù)為40。注意：試驗中每3個復(fù)孔作為技術(shù)重復(fù)，同時要根據(jù)試驗需要適當調(diào)整反應(yīng)體系。

表1 TEAD4 siRNA序列

表2 試驗所用引物

2 結(jié)果

2.1 豬TEAD4生物信息學(xué)分析

2.1.1 豬序列分析 通過對豬結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示，包含11個外顯子，定位于5號染色體上，跨越長度37.188 kb，mRNA全長1 473 bp，CDS全長1 305 bp，編碼434個氨基酸（圖1）。

2.1.2 豬、人和小鼠 TEAD4 基因同源性比較 通過比對豬、人和小鼠同源性，結(jié)果顯示，在核苷酸水平上，豬與人、小鼠同源性分別為90.96 %、77.93 %；在氨基酸水平上，豬與人、小鼠同源性分別為95.85 %、82.95 %（表2），表明在不同物種上都具有較高的保守性。

2.1.3在不同物種間的分子進化關(guān)系 通過比較在不同物種之間的進化關(guān)系，結(jié)果表明，在豬和牛上的親緣關(guān)系最近（圖2）。

2.2 豬早期胚胎發(fā)育中TEAD4 mRNA表達

利用熒光定量PCR技術(shù)檢測豬早期胚胎發(fā)育中mRNA表達，結(jié)果顯示，mRNA在豬卵母細胞和早期胚胎中均有表達，其中8-細胞時期表達量最高，其次是桑葚胚和囊胚時期，MII期卵母細胞表達量最低（圖3）。

數(shù)字1-11代表TEAD4基因所包含外顯子的位置 The numbers 1-11 represent the exon position of inTEAD4

表2 豬、人和小鼠TEAD4基因同源性比較

AA代表氨基酸水平 AA represents amino acid sequence

a,b,c,d字母表示存在顯著性差異，P<0.05

2.3 TEAD4 siRNA特異性靶向TEAD4并有效降低豬早期胚胎TEDA4 mRNA表達

利用熒光定量PCR技術(shù)檢測8-細胞和桑葚胚時期TEAD4 mRNA表達量，結(jié)果顯示，與Control組和陰性對照 siRNA組相比，TEAD4 siRNA組中TEAD4 mRNA表達量均顯著降低（圖4-A、B），敲低效率達到80 % 。

另外，在注射TEAD4 siRNA后同樣采用熒光定量PCR技術(shù)檢測TEAD1、TEAD2和TEAD3 mRNA表達量，結(jié)果顯示，相比較于對照組和陰性對照 siRNA組，TEAD4 siRNA組中TEAD1 mRNA和TEAD3 mRNA表達均無差異（圖4-C、D），TEAD2 mRNA在對照組、陰性對照 siRNA組和TEAD4 siRNA組中均未檢測到。表明TEAD4 siRNA對TEAD蛋白家族中除TEAD4外其他成員均無任何影響，TEAD4 siRNA特異性好，可用于后續(xù)研究。

2.4 TEAD4敲低對豬孤雌激活胚胎早期發(fā)育的影響

通過顯微注射siRNA觀察對豬孤雌激活胚胎早期發(fā)育的影響，結(jié)果顯示，與對照組和陰性對照 siRNA組相比，siRNA組中8-細胞胚胎、桑葚胚和囊胚發(fā)育效率均顯著降低（圖5）。

2.5 TEAD4敲低對豬體外受精胚胎早期發(fā)育的影響

通過顯微注射siRNA觀察對豬體外受精胚胎早期發(fā)育的影響，結(jié)果顯示，相比較對照組和陰性對照 siRNA組，siRNA組中8-細胞胚胎、桑葚胚和囊胚發(fā)育效率均顯著降低（圖6）。

圖A和B: TEAD4 siRNA對8-細胞和桑葚胚中TEAD4 mRNA表達的影響; 圖C和D:TEAD4 siRNA對TEAD1和TEAD3 mRNA表達的影響。a和b表示存在顯著性差異，P<0.05。下同

3 討論

本試驗結(jié)果表明，TEAD4基因包含11個外顯子，定位于5號染色體上，跨越長度37.188 kb，mRNA全長1 473 bp，CDS全長1 305 bp，編碼434個氨基酸。并且通過比對不同物種中的CDS和AA序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同物種上具有較高的保守性，據(jù)此推測在動物生長發(fā)育中具有重要作用，這為我們深入研究豬的生長發(fā)育機制提供理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)mRNA在豬早期胚胎發(fā)育中均有表達，其中MII期卵母細胞表達量最低，8-細胞時期表達量最高。與本研究結(jié)果不同的是，在牛上發(fā)現(xiàn)，mRNA和蛋白在8-細胞期、桑葚胚和囊胚期均有表達，但mRNA在8-細胞時期表達量較低，桑葚胚和囊胚時期表達量較高[28]；在小鼠上發(fā)現(xiàn)，在早期胚胎發(fā)育過程中mRNA表達量逐漸增加[29]。以上研究表明mRNA在不同物種中的表達模式存在差異，具有物種多樣性特征。與TEAD4轉(zhuǎn)錄本表達模式類似，TEAD4在動物早期胚胎發(fā)育中的作用也具有物種多樣性，比如，敲低沒有降低牛早期胚胎發(fā)育效率[28]，但豬敲低顯著降低早期胚胎發(fā)育效率。在小鼠囊胚時期，滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細胞團中均有的表達，但因功能不同而發(fā)揮著不同的作用。值得注意的是，在囊胚細胞核和細胞質(zhì)中的亞細胞定位是決定哺乳動物胚胎卵裂球發(fā)育命運的關(guān)鍵因素[22]。不僅是滋養(yǎng)外胚層特異性基因表達所必需的[23]，也是小鼠早期胚胎發(fā)育中滋養(yǎng)層細胞發(fā)育所必需的特定轉(zhuǎn)錄因子[24]。在人胚胎干細胞中，缺失導(dǎo)致滋養(yǎng)細胞分化失敗，但當對進行誘導(dǎo)表達時又可挽救滋養(yǎng)層細胞分化[30]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)線粒體DNA轉(zhuǎn)錄是哺乳動物早期發(fā)育過程中調(diào)控能量代謝的方式之一，特別是可以通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細胞中能量代謝，從而保證哺乳動物囊胚形成和個體正常發(fā)育[25-26]。這一發(fā)現(xiàn)可以為今后深入研究豬早期胚胎發(fā)育過程中能量代謝機制提供重要的參考價值。

圖5 TEAD4敲低對豬孤雌激活胚胎早期發(fā)育的影響（標尺= 50 μm）

綜上所述，本研究結(jié)果加深了對豬早期胚胎發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄因子TEAD4功能的理解，為后續(xù)深入研究調(diào)控豬早期胚胎發(fā)育的分子機制奠定基礎(chǔ)。

圖6 TEAD4敲低對豬體外受精胚胎早期發(fā)育的影響（標尺= 50 μm）

4 結(jié)論

TEAD4基因在物種進化中具有較高的保守性；且在豬早期胚胎發(fā)育期間均有表達；參與調(diào)控豬早期胚胎發(fā)育。

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Transcription Factor TEAD4 Regulates Early Embryonic Development in Pigs

ZHANG DanDan, XU TengTeng, GAO Di, QI Xin, NING Wei, RU ZhenYuan, ZHANG XiangDong, GUO TengLong, SHENTU LuYan, YU Tong, MA YangYang, LI YunSheng, ZHANG YunHai, CAO ZuBing*

Key Laboratory of Conservation and Biological Breeding of Local Livestock and Poultry Genetic Resources/College of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036

【Background】 TEA domain transcription factor 4 (TEAD4) is known to be a member of the TEAD family of transcription factors and plays a key role in determining the characteristics of the preimplantation embryo in rodents.In mouse embryos, it was found to be involved in regulating the genealogical differentiation of trophectoderm cells in preimplantation embryos by promoting Cdx2 expression.The absence of the TEAD4 gene in mouse embryos can lead to failure of mouse blastocyst formation.However, the role of TEAD4 in early porcine embryonic development is still unclear.【Objective】This study aimed to preliminarily elucidate the effect of TEAD4 on early porcine embryonic development, in order to lay the theoretical foundation for further exploring the molecular mechanisms of transcription factors on early porcine embryonic development【Method】In this study, the bioinformatics analysis of the porcinegene was performed by using web-based tools, including analysis of the porcinegene sequence, comparison of homology between pigs, human and mice, and comparison of the evolutionary relationship ofbetween different species.The role ofgene in porcine oocytes and the early embryos was firstly detected by fluorescence quantitative PCR.and then, siRNA targetingwas designed and injected into mature oocytes by microinjection technique to reduce the level of endogenousgene in the oocyte cytoplasm, and to determine thatsiRNA acts only ongene, with a view to determining the role ofgene in early porcine embryonic development.【Result】Sequence analysis showed that the porcinegene contained 11 exons and localized on chromosome 5, with spanning 37.188 kb, 1 473 bp in full mRNA length, and 1305 bp in full coding region, which encoded 434 amino acids.Homology analysis with human and mouse revealed that TEAD4 was highly conserved in different species and had the closest affinity on pig and cow.The results of fluorescence quantitative PCR showed thatmRNA was expressed in both porcine oocytes and early embryos; compared with GV-stage oocytes, the expression ofmRNA was lowest in MII-stage oocytes and remained low until the 4-cell stage, but reached the highest expression in the 8-cell stage, and then gradually decreased in the morula and blastocyst stages.Microinjection of siRNA targeting TEAD4 revealed thatsiRNA only acted on the endogenousgene in oocytes, but not onand,and compared with the control and negative control siRNA groups, the injection ofsiRNA significantly reducedmRNA expression at the 8-cell and morula embryo periods.Whengene expression was knocked down, observation of the developmental efficiency of porcine orphan activation and in vitro fertilization embryos showed that the developmental efficiency of TEAD4 siRNA knockdown group from 8-cell to blastocyst stage was significantly reduced compared to the control and negative control siRNA groups.【Conclusion】 The results of this study indicated that thegene was highly conserved across species, with the closest affinity on pigs and bovine, and that TEDA4 might be involved in regulating the development of early porcine embryos..

pig; early embryos;;parthenogenetic activation; in vitro fertilization

2020-09-09；

2021-07-08

安徽省科技重大專項（18030701185）、安徽省留學(xué)回國人員創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)扶持計劃項目（2020LCX015）、合肥市留學(xué)回國人員創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)扶持計劃項目（03082009）、國家自然科學(xué)基金青年基金（3180130169和31902226）

張丹丹，E-mail：1730504758@qq.com。通信作者曹祖兵，E-mail：zubingcao@ahau.edu.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）