靳容，劉明，趙鵬，張強(qiáng)強(qiáng)，張愛(ài)君，唐忠厚

甘薯絲裂原活化蛋白激酶對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)

靳容，劉明，趙鵬，張強(qiáng)強(qiáng)，張愛(ài)君，唐忠厚*

江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/江蘇徐州甘薯研究中心/農(nóng)業(yè)部甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221131

【目的】研究甘薯絲裂原活化蛋白激酶在抵御低溫脅迫過(guò)程中的功能，為解析甘薯耐低溫機(jī)制和遺傳改良提供參考?！痉椒ā坎捎棉r(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將35S::重組表達(dá)載體和對(duì)照載體質(zhì)粒pDMC83轉(zhuǎn)化甘薯愈傷組織，根據(jù)載體上特有的序列設(shè)計(jì)引物對(duì)甘薯擬轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行分子鑒定，并通過(guò)qRT-PCR篩選表達(dá)量高的轉(zhuǎn)基因株系。對(duì)非轉(zhuǎn)基因植株（WT）和轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行低溫脅迫和恢復(fù)處理，觀(guān)察處理后及恢復(fù)后的表型變化；檢測(cè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、丙二醛（MDA）含量和過(guò)氧化氫（H2O2）含量等生理指標(biāo)；利用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）和氮藍(lán)四唑（NBT）染色法觀(guān)察活性氧的積累情況；分析低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因和下游基因的表達(dá)水平?！窘Y(jié)果】共獲得12株過(guò)表達(dá)甘薯株系，篩選表達(dá)量最高的3個(gè)過(guò)表達(dá)株系（L3、L8和L11）用作低溫脅迫分析材料。低溫脅迫下WT的Fv/Fm為0.50，而轉(zhuǎn)基因株系L3、L8和L11的Fv/Fm分別為0.79、0.79和0.80，與WT呈現(xiàn)極顯著差異水平。溫度恢復(fù)后，轉(zhuǎn)基因植株中Fv/Fm恢復(fù)至低溫處理前水平，而WT中Fv/Fm僅為0.70，極顯著低于轉(zhuǎn)基因植株。低溫脅迫下，WT的丙二醛含量為0.05 μmol·g-1，而轉(zhuǎn)基因株系L3、L8和L11中的丙二醛含量分別為0.02、0.04和0.02 μmol·g-1，顯著低于WT。溫度恢復(fù)正常后，WT中的丙二醛含量為0.03 μmol·g-1，而轉(zhuǎn)基因株系L3、L8和L11中的丙二醛含量均為0.01 μmol·g-1。DAB和NBT染色結(jié)果顯示，低溫脅迫下，WT葉片與轉(zhuǎn)基因株系葉片相比，染色較深，說(shuō)明WT比轉(zhuǎn)基因植株積累了更多的過(guò)氧化氫和超氧陰離子。過(guò)氧化氫含量測(cè)定結(jié)果顯示，低溫脅迫下和溫度恢復(fù)后，轉(zhuǎn)基因植株中過(guò)氧化氫的含量均顯著低于WT。qRT-PCR結(jié)果表明和受低溫誘導(dǎo)表達(dá)，且在WT和轉(zhuǎn)基因株系之間差異顯著?！窘Y(jié)論】過(guò)表達(dá)甘薯植株通過(guò)緩解光合系統(tǒng)和膜系統(tǒng)的損傷、減少活性氧的積累，提高了對(duì)低溫脅迫的耐受性。通過(guò)調(diào)控低溫通路中相關(guān)基因和的表達(dá)，參與甘薯低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

甘薯；；轉(zhuǎn)基因株系；低溫脅迫

0 引言

【研究意義】溫度是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中最重要的環(huán)境因素之一，不僅影響農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量，也制約農(nóng)作物的耕作時(shí)間和地理分布[1]。甘薯（(L.) Lam.）是世界上第七大糧食作物，然而，不論苗期生長(zhǎng)還是收獲后儲(chǔ)藏都對(duì)低溫都非常敏感，甘薯的不耐低溫性嚴(yán)重制約了甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2-3]?？寺『偷蜏貞?yīng)答相關(guān)的基因并闡釋其功能，對(duì)開(kāi)展基因靶向育種和改良甘薯耐低溫脅迫的能力具有重要的理論意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有絲分裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是廣泛存在于真核生物中的信號(hào)分子，由MAPKKK、MAPKK和MAPK組成，通過(guò)級(jí)聯(lián)依次磷酸化反應(yīng)方式參與胞外信號(hào)的放大和胞內(nèi)信號(hào)的傳遞，參與生物或非生物的脅迫反應(yīng)、激素反應(yīng)、細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)發(fā)育與程序性凋亡等[4-6]。目前僅有少數(shù)的MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)被詳細(xì)報(bào)道，其中，擬南芥MEKKK1-MKK2-MPK4/MPK6級(jí)聯(lián)反應(yīng)和水稻OsMKK6-OsMPK3級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與植物低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[7-8]。異源或同源過(guò)表達(dá)MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)中的激酶可以提高植物耐低溫性。突變MKK2的磷酸化位點(diǎn)，在擬南芥中過(guò)表達(dá)該突變基因MKK2，抑制其蛋白磷酸化活性，提高了擬南芥的耐低溫性[9]；在煙草中分離到一個(gè)擬南芥的同源基因，分別在煙草和玉米中過(guò)表達(dá)該基因，可以提高煙草和玉米的耐低溫性[10-11]；在擬南芥中異源表達(dá)玉米，可以提高擬南芥耐低溫和耐鹽性[12]；在煙草中過(guò)表達(dá)馬鈴薯或玉米，可通過(guò)增加可溶性糖和脯氨酸含量，增加煙草耐低溫性[13-14]。擬南芥中共有20個(gè)MAPK，目前，研究較為詳盡的MAPK激酶有MPK3、MPK4和MPK6。根據(jù)序列磷酸化位點(diǎn)的保守性，MPK6和MPK3序列最為相近，功能也相似，同屬于A(yíng)類(lèi)MAPK，均參與植物生長(zhǎng)發(fā)育并響應(yīng)多種生物和非生物脅迫[4,15]。在擬南芥中，響應(yīng)茉莉酸和乙烯信號(hào)傳導(dǎo)、參與病原菌應(yīng)答、調(diào)控氣孔發(fā)育、參與植物抗毒素的合成等。低溫脅迫、滲透脅迫和鹽脅迫等非生物脅迫均能夠誘導(dǎo)擬南芥、水稻和玉米等多種植物中的表達(dá)[16-18]。在甘薯中，IbMPK6含有11個(gè)保守的亞結(jié)構(gòu)域和磷酸化基序TEY。IbMPK6激酶活性可以被早期的NaCl、SA、H2O2和ABA誘導(dǎo)。在煙草中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)，可以提高病原相關(guān)（protection related，PR）基因的表達(dá)水平，增強(qiáng)葉片對(duì)細(xì)菌病原菌的耐受性[19]。以上數(shù)據(jù)表明在調(diào)控甘薯逆境脅迫的反應(yīng)過(guò)程中可能起著重要的作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】低溫脅迫嚴(yán)重影響甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，但有關(guān)甘薯抵御低溫脅迫生理和分子機(jī)制方面的研究卻很少。前人研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下的表達(dá)隨著時(shí)間的變化先增后降，在處理30 min時(shí)，相對(duì)表達(dá)量達(dá)到頂峰，比處理前增加2.5倍，說(shuō)明可能參與調(diào)控低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[19]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)在甘薯中過(guò)表達(dá)獲得甘薯轉(zhuǎn)基因株系，開(kāi)展甘薯耐低溫性鑒定工作，明確響應(yīng)低溫脅迫的作用，為改良及培育甘薯耐低溫品種提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

35S::重組表達(dá)載體和對(duì)照載體質(zhì)粒pDMC83由韓國(guó)生命工學(xué)院郭尚姝院士惠贈(zèng)。大腸桿菌（感受態(tài)細(xì)胞DH5α、根癌農(nóng)桿菌（）感受態(tài)細(xì)胞EHA105由徐州甘薯研究中心保存。

1.2 IbMPK6過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

將重組質(zhì)粒pDMC83-轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，接種至含有50 μg·ml-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)1 d，挑取陽(yáng)性單克隆菌并提取質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至根瘤農(nóng)桿菌EHA105中，接種至YEP培養(yǎng)基（含有50μg·ml-1潮霉素和100 μg·ml-1）中，于28℃培養(yǎng)3 d，挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)，篩選陽(yáng)性克隆，并于-80℃保存?zhèn)溆?。PCR檢測(cè)引物根據(jù)全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)（表1）。

1.3 轉(zhuǎn)基因甘薯的分子檢測(cè)

采用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法浸染徐薯29胚性愈傷組織。將浸染過(guò)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有20 mg·L-1乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3 d。用清水去除愈傷組織上殘留的根瘤農(nóng)桿菌，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基（含有500 mg·L?1頭孢羥氨芐和15 mg·L-1潮霉素）中，光下誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生，其間每2周繼代1次，直至生成完整的甘薯幼苗植株。提取擬轉(zhuǎn)基因甘薯幼苗葉片的DNA和RNA，用于轉(zhuǎn)基因甘薯植株的分子檢測(cè)。篩選mRNA表達(dá)量最高的3個(gè)株系移栽營(yíng)養(yǎng)土中，并置于人工氣候室（28℃、相對(duì)濕度75%、光照16 h/黑暗8 h的光照周期）中培養(yǎng)，30 d后選取長(zhǎng)勢(shì)一致的轉(zhuǎn)基因甘薯植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辏╓T）進(jìn)行低溫脅迫（4℃）處理。低溫處理2 d后，把植株再次移入人工氣候室中恢復(fù)2 d，并進(jìn)行Fv/Fm、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和過(guò)氧化氫（H2O2）含量等生理指標(biāo)測(cè)定。

1.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm的測(cè)定

分別于低溫處理前、低溫處理2 d和恢復(fù)2 d后，取暗適應(yīng)30 min后的甘薯植株頂2至頂3完全展開(kāi)葉，采用LI-6400XT便攜式光合測(cè)定儀測(cè)定PSⅡ最大光化學(xué)效率，即暗適應(yīng)下可變熒光和最大熒光比值（Fv/Fm）。

1.5 丙二醛含量測(cè)定

低溫處理2 d后取甘薯植株頂3完全展開(kāi)葉于磷酸緩沖液中研磨成勻漿，離心后取2 ml上清液，加入含有0.5%硫代巴比妥酸的三氯乙酸溶液，水浴加熱10 min后迅速冷卻，4 000 r/min離心15 min，取上清液于532和600 nm測(cè)定吸光值。MDA含量用μmol·g-1表示，計(jì)算公式為V×（OD532-OD600）/（V1/V2×155×FW），式中，V為上清液，V1反應(yīng)液中的提取液數(shù)量，V2為提取液，F(xiàn)W為樣品鮮重，155為MDA的毫摩爾吸光系數(shù)[20]。

1.6 過(guò)氧化氫染色分析

采用二甲基聯(lián)苯胺（dimethylbenzidine，DAB）染色葉片中過(guò)氧化氫。將葉片浸泡在0.1% DAB溶液中，并于光下照射6 h。之后將葉片置于95%乙醇中，水浴煮沸，待葉綠素完全脫去，進(jìn)行拍照觀(guān)察。

1.7 超氧陰離子染色分析

采用氮藍(lán)四唑（nitro blue tetrazolium，NBT）染色葉片中超陰離子。將葉片浸泡在0.5 mg·mL-1NBT溶液中，抽真空滲透5 min，并放置1 h。之后將葉片置于95%乙醇中，水浴煮沸，待葉綠素完全脫去，進(jìn)行拍照觀(guān)察。

1.8 過(guò)氧化氫含量測(cè)定

低溫處理2 d后，取甘薯植株頂3完全展開(kāi)葉，切碎混勻，稱(chēng)取0.5 g樣品，加入1 ml 0.1%（w/v）三氯乙酸研磨，采用碘化鉀法測(cè)定過(guò)氧化氫含量[21]。勻漿低溫離心15 min，取上清液0.5 ml，與0.5 ml磷酸緩沖液（0.1 mol·L-1，pH=7.0）和1 ml碘化鉀溶液（1 mol·L-1）混合，避光靜置1 h后，于390 nm處測(cè)定吸光值。過(guò)氧化氫含量通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算，用μmol·g-1表示。

1.9 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

低溫處理3 h后收集轉(zhuǎn)基因甘薯幼苗第三片完全展開(kāi)葉，液氮速凍后使用RNA快速提取試劑盒（捷瑞，中國(guó)）提取RNA，按照TIANSCript Ⅱ RT kit試劑盒（天根，中國(guó)）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一條鏈用于qRT-PCR檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR總反應(yīng)體系為模板cDNA 2 μL、上下游引物（表1）各0.4 μL、SYBR PCR Master Mix（TOYOBO, Japan）5 μL和ddH2O 2.2 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3 min；95℃ 3 min 15 s，58℃ 15 s，72℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 所用引物序列

2 結(jié)果

2.1 過(guò)表達(dá)IbMPK6甘薯株系的建成與篩選

將35S::過(guò)表達(dá)載體（圖1-A）轉(zhuǎn)入

根瘤農(nóng)桿菌EHA105中浸染甘薯徐薯29的愈傷組織。將浸染后的愈傷在含有潮霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，最終共獲得含有潮霉素抗性的甘薯幼苗株系12株。以pDMC83空載體為陽(yáng)性對(duì)照、非轉(zhuǎn)基因植株（WT）為陰性對(duì)照，根據(jù)載體上特有的設(shè)計(jì)引物對(duì)這些候選轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果顯示，12株甘薯株系均能夠擴(kuò)增出與質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致的條帶，而WT則不能擴(kuò)增出條帶，說(shuō)明過(guò)表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)入甘薯植株（圖1-B）。對(duì)過(guò)表達(dá)株系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定，根據(jù)相對(duì)表達(dá)量，篩選出相對(duì)表達(dá)量最高的株系L3、L8和L11用于下一步試驗(yàn)（圖1-C）。

A：IbMPK6過(guò)表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖。B：IbMPK6過(guò)表達(dá)株系PCR鑒定。M：marker；P：質(zhì)粒；WT：非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?，L1—L12：轉(zhuǎn)基因株系。C：qRT-PCR檢測(cè)篩選IbMPK6過(guò)表達(dá)株系。不同小寫(xiě)字母表示在P＜0.01水平差異顯著。紅色邊框內(nèi)表示IbMPK6過(guò)表達(dá)最高的3個(gè)株系L3、L8和L11

2.2 過(guò)表達(dá)IbMPK6甘薯株系對(duì)低溫脅迫的耐受性

為確定過(guò)表達(dá)是否能夠提高甘薯耐低溫脅迫性，選取生長(zhǎng)1個(gè)月且長(zhǎng)勢(shì)一致的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辏╓T）和轉(zhuǎn)基因株系（L3、L8和L11）進(jìn)行低溫脅迫處理。結(jié)果顯示，低溫脅迫處理2 d后，WT和轉(zhuǎn)基因株系均發(fā)生了不同程度的萎蔫，但WT較轉(zhuǎn)基因株系萎蔫程度更加嚴(yán)重。隨后移至人工氣候室恢復(fù)2 d后，轉(zhuǎn)基因株系幾乎完全恢復(fù)到脅迫處理前的狀態(tài)，而WT仍然呈現(xiàn)萎蔫狀態(tài)（圖2-A）。

Fv/Fm反應(yīng)光系統(tǒng)PSⅡ中心最大光能轉(zhuǎn)換效率。低溫脅迫后，轉(zhuǎn)基因株系中的Fv/Fm比值下降幅度很小，L3、L8和L11的Fv/Fm分別為0.79、0.79和0.80，而WT的Fv/Fm為0.50，與轉(zhuǎn)基因株系呈現(xiàn)極顯著差異水平。溫度恢復(fù)后，轉(zhuǎn)基因植株中Fv/Fm恢復(fù)至低溫處理前水平，而WT中Fv/Fm僅為0.70，極顯著低于轉(zhuǎn)基因植株。丙二醛是膜脂過(guò)氧化的重要產(chǎn)物之一，反映膜系統(tǒng)受損程度。低溫脅迫下，WT的丙二醛含量為0.05 μmol·g-1，比低溫脅迫處理前上升79.5%。而轉(zhuǎn)基因株系L3、L8和L11中的丙二醛含量分別為0.02、0.04和0.02 μmol·g-1，比低溫脅迫處理前分別上升59.2%、74.3%和46.1%，顯著低于WT。溫度恢復(fù)正常后，WT的丙二醛含量為0.03 μmol·g-1，比低溫處理前上升57.2%，而轉(zhuǎn)基因株系L3、L8和L11中的丙二醛含量均為0.01 μmol·g-1，比低溫脅迫處理前分別上升4.3%、16.6%和3.1%。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)甘薯植株通過(guò)減輕光合系統(tǒng)和膜系統(tǒng)的損傷，提高了甘薯對(duì)低溫脅迫的耐受性。

2.3 低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因植株活性氧積累的分析

低溫通常會(huì)引起植物體內(nèi)活性氧（active oxygen，ROS）的積累，從而引起氧化脅迫[22]。DAB和NBT染色結(jié)果顯示，低溫脅迫下，WT葉片與轉(zhuǎn)基因株系葉片相比，染色較深，說(shuō)明非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辏╓T）比轉(zhuǎn)基因植株積累了更多的過(guò)氧化氫和超氧陰離子。對(duì)過(guò)氧化氫含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因植株中過(guò)

氧化氫的含量顯著低于WT。溫度恢復(fù)后，轉(zhuǎn)基因植株和WT的過(guò)氧化氫均有所下降，但WT中過(guò)氧化氫含量仍高于轉(zhuǎn)基因植株（圖3）。結(jié)果表明，低溫脅迫下過(guò)表達(dá)能夠提高甘薯的抗氧化能力。

2.4 IbMPK6和低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因表達(dá)分析

為了研究在低溫信號(hào)通路中的功能，通過(guò)qRT-PCR鑒定了轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辏╓T）在低溫（4℃）處理3 h前后、甘薯低溫信號(hào)通路重要轉(zhuǎn)錄因子和其下游低溫調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平（圖4）。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照植株，表達(dá)量分別比WT上調(diào)了7.14、11.15和7.71倍，但在低溫脅迫前后表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，低溫脅迫后，轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于對(duì)照植株，在L3、L8和L11中的表達(dá)量比對(duì)照植株分別提高了5.61、7.90和6.87倍。也受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，低溫脅迫后，在L8和L11中的表達(dá)量較WT極顯著提高，分別比WT上調(diào)了2.34和1.96倍。綜上所述，低溫脅迫下過(guò)量表達(dá)可以促進(jìn)低溫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，提高甘薯植株的耐低溫性。

圖4 低溫脅迫相關(guān)基因表達(dá)模式分析

Fig.4 Expression pattern of low temperature related genes

3 討論

甘薯具有良好的適應(yīng)性，能夠充分利用不同地區(qū)的光照、溫度、水分和土壤條件，可種植在干旱、貧瘠的大量次級(jí)耕地和邊緣土地上，在促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及推動(dòng)區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展中極具潛力[3]。但甘薯不耐低溫，當(dāng)氣溫降到15℃，甘薯就停止生長(zhǎng)，低于9℃，薯塊將逐漸受冷害而腐爛；地上部莖葉經(jīng)霜凍后很快喪失活力而死亡，低溫脅迫對(duì)甘薯的產(chǎn)量和品質(zhì)會(huì)造成嚴(yán)重?fù)p失[23]。選育甘薯耐低溫的優(yōu)良品種，研究甘薯抵御低溫脅迫的機(jī)制，提高甘薯耐低溫性是目前甘薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展過(guò)程中亟需解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。但由于甘薯復(fù)雜的遺傳背景，甘薯分子生物學(xué)和遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù)起步晚，目前，關(guān)于甘薯抵御低溫脅迫的機(jī)制研究較少。研究者通常采用在甘薯中異源表達(dá)與低溫脅迫相關(guān)基因的方法，提高甘薯的耐低溫性。在甘薯中異源表達(dá)大豆鋅脂蛋白，可以通過(guò)提高光合速率和增強(qiáng)氧化還原酶的活性，緩解低溫脅迫對(duì)甘薯幼苗的傷害[24]。擬南芥酸性核糖體P3B，具有RNA伴侶活性，通過(guò)磷酸化和轉(zhuǎn)錄后修飾發(fā)揮功能，使植株抵御多種非生物脅迫。之前的研究發(fā)現(xiàn)甘薯中異源表達(dá)該基因，也可提高植株的耐低溫性[25]。

植物通過(guò)細(xì)胞膜對(duì)低溫信號(hào)感知識(shí)別，引起質(zhì)膜流動(dòng)和鈣離子濃度變化，從而激活鈣離子通道，或由ROS和ABA等信號(hào)途徑，經(jīng)組氨酸激酶、受體激酶、磷酸酯酶和MAPK激酶等信號(hào)識(shí)別轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控應(yīng)答低溫脅迫[26]。MAPK蛋白激酶作為上游信號(hào)，通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)將低溫信號(hào)放大、并傳遞到下游基因，誘導(dǎo)低溫相關(guān)基因的表達(dá)，提高植物的耐低溫性[4]。前人研究中受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，本研究以過(guò)表達(dá)甘薯株系響應(yīng)低溫脅迫的研究結(jié)果為基礎(chǔ)，從生理和分子機(jī)制方面解析調(diào)控甘薯抵御低溫能力。光合作用是低溫脅迫時(shí)第一個(gè)被抑制的代謝過(guò)程[27]。低溫影響光合器官的結(jié)構(gòu)和活性、葉綠體氣孔導(dǎo)度、參與光合作用的酶活性和光合電子傳遞以及碳同化過(guò)程等方面[28]。本研究中，低溫脅迫下，過(guò)表達(dá)植株中Fv/Fm顯著高非轉(zhuǎn)基因照植株（WT），說(shuō)明過(guò)表達(dá)有效減輕了轉(zhuǎn)基因植株中光合系統(tǒng)受到的損傷。此外，低溫脅迫可改變植物的膜相和膜透性，本研究中，低溫脅迫和恢復(fù)處理下，相比對(duì)照植株，過(guò)表達(dá)植株中丙二醛含量維持在較低的水平，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因甘薯植株能減輕低溫脅迫下細(xì)胞膜的損傷程度，增強(qiáng)植株的抗氧化能力。過(guò)氧化氫和超氧陰離子是活性氧中最重要的成分，植物體內(nèi)活性氧的過(guò)量產(chǎn)生，會(huì)破壞離子平衡，損害植物酶系統(tǒng)，引發(fā)代謝紊亂，促使有毒物質(zhì)的積累，破壞植株正常代謝，導(dǎo)致細(xì)胞和組織的損傷和死亡[29-30]。本研究中，DAB和NBT染色分析說(shuō)明過(guò)表達(dá)提高了低溫脅迫下甘薯的抗氧化能力，減輕了活性氧對(duì)植株的傷害。

CBF（C-repeat binding factor）是目前低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中研究最為深入的轉(zhuǎn)錄因子。CBF蛋白可以通過(guò)結(jié)合低溫調(diào)節(jié)基因（）的啟動(dòng)子核心區(qū)域CRT/DRE，誘導(dǎo)和低溫相關(guān)基因的表達(dá)，提高植株的耐低溫性[31]。低溫能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈表達(dá)，很多轉(zhuǎn)錄激活因子能夠正向調(diào)控表達(dá)。如ICE1能夠結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)MYC元件，調(diào)控表達(dá)[32]。此外，晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)蛋白CCA1[33]、光敏色素作用因子PIF[34]、晝夜節(jié)律光受體蛋白ZTL[35]和熱激蛋白HSP90[36]也正向調(diào)控的表達(dá)。JIN等[37]在甘薯中發(fā)現(xiàn)并克隆了的同源基因，在擬南芥和甘薯中過(guò)表達(dá)該基因，會(huì)引起表達(dá)水平的提高，從而提高植株的耐低溫性。本研究中，低溫脅迫下，與WT相比，轉(zhuǎn)基因甘薯植株中和的表達(dá)量呈顯著上升，說(shuō)明可以介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CBF的調(diào)控途徑，提高甘薯的耐低溫性。

多數(shù)植株中的受低溫早期誘導(dǎo)表達(dá)，活性氧作為信號(hào)調(diào)控各種生物學(xué)反應(yīng)，曾被認(rèn)為是MAPK激酶被環(huán)境因素激活的內(nèi)在原因[38]。過(guò)氧化氫可誘導(dǎo)表達(dá)，從而活化下游基因，調(diào)控植物抵御低溫等非生物脅迫[39]。本研究中，隨著低溫脅迫時(shí)間的加長(zhǎng)，無(wú)論轉(zhuǎn)基因株系還是WT，在低溫脅迫3 h后的表達(dá)量和脅迫處理前的表達(dá)量保持一致，推測(cè)可能在蛋白水平上參與調(diào)控IbCBF3轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控途徑。由于MAPK激酶底物的多樣性，目前，有關(guān)植物參與調(diào)控抵御低溫脅迫的機(jī)制尚不明確，且在不同作物中低溫脅迫下生物學(xué)功能也存在差異。在擬南芥中MPK3/MPK6能夠抑制ICE1的穩(wěn)定性，從而降低擬南芥的耐低溫性[40]；而在水稻中，OsMPK3/OsMPK6通過(guò)磷酸化OsICE1抑制OsICE1的降解，并激活OsICE1下游海藻糖-6-磷酸磷酸酶OsTPP1，參與海藻糖的代謝途徑，提高水稻的耐低溫性[41]。本研究表明參與調(diào)控依賴(lài)型信號(hào)通路，提高甘薯對(duì)低溫脅迫的抵御能力，但通過(guò)激活哪些底物，并如何激活，是否能夠調(diào)控非依賴(lài)型信號(hào)通路等生物學(xué)問(wèn)題還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

甘薯參與調(diào)控低溫響應(yīng)過(guò)程。過(guò)表達(dá)甘薯植株通過(guò)減少低溫對(duì)光合系統(tǒng)和膜系統(tǒng)的損傷，減少活性氧積累，并調(diào)控低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和下游基因的表達(dá)量，提高植株的耐低溫性。

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, amitogen-activated protein kinase, confers low temperature tolerance in sweetpotato

JIN Rong, LIU Ming, ZHAO Peng, ZHANG QiangQiang, ZHANG AiJun, TANG ZhongHou*

Xuzhou Institute of Agricultural Sciences of Xuhuai District of Jiangsu Province/Xuzhou Sweetpotato Research Center of Jiangsu Province/Key Laboratory of Sweetpotato Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture, Xuzhou 221131, Jiangsu

【Objective】Studying the function of mitogen activated protein kinase (MAPK)【Method】strain EHA105 harbored the plasmid 35S::were transformed intosweetpotato cv.Xushu29 embryogenic callus.Molecular examination and qRT-PCR were used to screen and select transgenic lines.For low temperature stress assay, selected transgenic lines were performed to observe the phenotype and determine the physiological indexes such as Fv/Fm, the content of malondialdehyde (MDA) and hydrogen peroxide (H2O2) after low temperature treatment and recovery treatment.Diaminobenzidine (DAB) staining and nitro blue tetrazolium (NBT) staining analysis were performed to observe reactive oxygen species (ROS) accumulation.The expression level of the key transcription factorand downstream geneinvolved in low temperature signal transduction pathway were identified before and after low temperature treatment.【Result】Twelve transgenic lines were generated and three transgenic lines (L3, L8 and L11) with a high expression level ofwere selected for low temperature tolerance assay.Under low temperature stress, the level of Fv/Fm in transgenic lines L3, L8 and L11 was 0.79, 0.79 and 0.80, while that in WT was 0.05.After temperature recovery treatment, Fv/Fm in transgenic lines has recovered to former levels, whereas the level of Fv/Fm in WT was only 0.70, which was significantly lower than that in transgenic lines.MDA content of three transgenic (lines L3, L8 and L11) increased by 0.02, 0.04 and 0.02 μmol·g-1, and it of WT increased by 0.05 μmol·g-1after low temperature stress treatment, respectively.After recovery treatment, MDA content in transgenic lines was 0.01 μmol·g-1on average, whereas it of WT was 0.03 μmol·g-1.The results of DAB and NBT staining showed that the leaves of WT were stained deeper than those of transgenic lines, indicated that hydrogen peroxide and superoxide anion were accumulation less in transgenic lines than in WT.Furthermore, H2O2level in WT was significantly higher than that in transgenic lines under low temperature stress condition and after recovery treatment.Low temperature regulated the expression level ofandgenes, but the expression level in transgenic lines was higher than that in WT.【Conclusion】Overexpression ofinvolved in low temperature signaling transduction pathway by up-regulating the expression level of cold related genesand.

sweetpotato;; transgenic lines; low temperature stress

2021-04-06；

2021-06-21

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（31801447）、上海市資源植物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（PFGR201905）、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部薯類(lèi)作物生物學(xué)與遺傳育種綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（NYBSL201802）

靳容，E-mail：jinrong_2012@126.com。通信作者唐忠厚，E-mail：zhonghoutang@sina.com

（責(zé)任編輯 李莉）