韓柯穎，馮瀟，楊玉玲，李珊珊，魏蘇萌，陳玉敏

添加山茶油對(duì)肌原纖維蛋白凝膠特性的影響

韓柯穎，馮瀟，楊玉玲*，李珊珊，魏蘇萌，陳玉敏

南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023

【目的】研究山茶油添加對(duì)凝膠中肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）特性的影響以及結(jié)構(gòu)與凝膠特性間的關(guān)系，為其在雞肉糜類制品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)?！痉椒ā咳‰u胸肉于4℃下提取MP，在添加山茶油條件下測(cè)定其流變特性，水浴加熱制成凝膠后測(cè)定其硬度、保水性和水分布特性的變化；通過(guò)掃描電鏡、激光拉曼光譜、表面疏水性（S0-ANS）、總巰基含量、差示掃描量熱法（DSC）等分析，探討山茶油對(duì)MP凝膠微觀結(jié)構(gòu)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)以及熱變性的影響，并分析山茶油添加量、凝膠特性和MP結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性，揭示山茶油添加促使凝膠特性改變的原因?！窘Y(jié)果】MP凝膠的硬度、保水性和束縛水的百分比（PT21）隨著山茶油添加量的增加而顯著提高（＜0.05），在4%時(shí)分別達(dá)到最大值116.60 g、95.77%和80.05%，5%時(shí)有所下降。山茶油添加量為4%時(shí)，MP加熱過(guò)程中的儲(chǔ)能模量（G'）最高，凝膠彈性最大，此時(shí)掃描電鏡下的MP混合凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)均勻、致密，表面粗糙度最低。山茶油的添加（0－5%）影響MP的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其-螺旋含量從39.94%顯著降低至26.07%（＜0.05），折疊含量從22.04%顯著升高至27.40%（＜0.05），-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲含量呈上升趨勢(shì)。山茶油添加量增加到4%時(shí)，MP凝膠的表面疏水性達(dá)到最高水平，總巰基含量最低。結(jié)果表明山茶油的添加促進(jìn)MP分子內(nèi)部疏水性氨基酸殘基暴露和分子間二硫鍵的生成，三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，更高的-折疊含量和疏水相互作用增強(qiáng)MP分子間的聚集和交聯(lián)。相關(guān)性分析表明，山茶油添加量與MP凝膠特性及蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化顯著相關(guān)（＜0.05）。DSC結(jié)果表明添加的山茶油能與MP相互作用，降低MP的變性熱焓?！窘Y(jié)論】添加山茶油對(duì)MP凝膠特性和結(jié)構(gòu)有顯著影響。添加山茶油改變MP的微環(huán)境并與MP發(fā)生作用，使MP更容易變性并導(dǎo)致其二級(jí)結(jié)構(gòu)展開以及三級(jí)結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而改善MP凝膠特性。當(dāng)山茶油添加量為4%時(shí)，混合凝膠特性和三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)最佳。

山茶油；肌原纖維蛋白；凝膠特性；結(jié)構(gòu)

0 引言

【研究意義】以雞肉為原料的糜類肉制品品質(zhì)主要由肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）的凝膠特性決定[1]。脂肪作為肉制品的重要原料之一，直接影響肉制品的彈性、嫩度和風(fēng)味。用植物油代替動(dòng)物脂肪生產(chǎn)肉制品，有效降低飽和脂肪酸和膽固醇含量的同時(shí)，還能夠較好地保持肉制品的風(fēng)味和整體可接受性[2]。山茶油是富含茶多酚、山茶甙等多種生理活性物質(zhì)的功能性植物油，能有效改善心腦血管疾病，降低癌癥的發(fā)病率[3]。研究山茶油添加對(duì)MP熱誘導(dǎo)凝膠特性的影響，并探討其特性變化的調(diào)控機(jī)制，為利用山茶油制備功能性肉制品提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有研究者探討了在肉制品中添加植物油替代動(dòng)物油脂的可行性，證實(shí)了適當(dāng)添加植物油對(duì)肉類凝膠的性質(zhì)有改善作用。不同的油脂對(duì)凝膠結(jié)構(gòu)和持水性的影響不同[4]。添加橄欖油的豬肉MP復(fù)合凝膠強(qiáng)度顯著高于添加花生油的處理[5]，用棕櫚油替代豬背膘可顯著增強(qiáng)豬肉糜凝膠的硬度和保水性[6]，菜籽油與魔芋膠復(fù)合后應(yīng)用于低脂肉制品中能提高產(chǎn)品的硬度[7]。豬油和花生油通過(guò)物理包覆能促進(jìn)豬肉MP復(fù)合凝膠的保水性和脂質(zhì)穩(wěn)定性[8]。大豆油添加后的雞肉MP復(fù)合凝膠硬度、彈性和咀嚼度得到顯著增強(qiáng)[9]。ZHOU等[10]研究發(fā)現(xiàn)脂肪的加入不僅顯著提高了MP凝膠的質(zhì)構(gòu)特性，還能誘導(dǎo)MP分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化。SHAO等[11]采用拉曼光譜法研究添加不同脂質(zhì)的肉糜制品中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，觀察到-螺旋結(jié)構(gòu)的減少和-折疊結(jié)構(gòu)含量的增加，這一轉(zhuǎn)變涉及蛋白質(zhì)中氫鍵重排和疏水基團(tuán)的暴露，證實(shí)了脂質(zhì)能夠改變蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)。作為我國(guó)特有的一種食用植物油，山茶油中不皂化物含量少，富含的單不飽和脂肪酸是脂質(zhì)過(guò)氧化物的抑制劑，因此具有強(qiáng)抗氧化作用和良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性[12]。同時(shí)，山茶油中富含多種維生素、微量元素以及特定的生理活性物質(zhì)等，能有效預(yù)防心腦血管疾病和腫瘤、降低膽固醇和血脂[13]。因此，山茶油具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能，可作為替代動(dòng)物脂肪的良好油脂應(yīng)用于肉制品生產(chǎn)和加工?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前已經(jīng)確證添加適量的花生油等幾種植物油能改善MP的凝膠特性，而山茶油是具有保健功能的食用油，但國(guó)內(nèi)外尚未見添加山茶油條件下雞肉MP凝膠特性和結(jié)構(gòu)變化規(guī)律的相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】MP中加入不同濃度預(yù)乳化的山茶油乳液后經(jīng)熱誘導(dǎo)形成混合凝膠，研究山茶油添加對(duì)MP凝膠特性（硬度、保水性、水分布特性和流變特性）的影響并獲得最佳的山茶油添加濃度；研究山茶油添加對(duì)MP的凝膠微觀結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，并通過(guò)研究茶樹油添加量、凝膠特性和MP結(jié)構(gòu)的關(guān)系，揭示山茶油改變凝膠特性的內(nèi)在原因。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2020年5—10月在南京財(cái)經(jīng)大學(xué)糧油質(zhì)量檢測(cè)工程技術(shù)研究中心進(jìn)行。

1.1 材料與試劑

重2 kg左右的60日齡AA（Arbor Acres）型商業(yè)肉雞，購(gòu)于南京本地養(yǎng)雞場(chǎng)?，F(xiàn)場(chǎng)屠宰后取雞胸肉，加液氮冷凍密封運(yùn)輸至南京財(cái)經(jīng)大學(xué)，儲(chǔ)存于-18℃以下，1個(gè)月內(nèi)使用。山茶油購(gòu)于杭州久晟生物科技有限公司。牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T10 Basic高速剪切均質(zhì)器，德國(guó)IKA公司；Avanti J-26XP高效冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter公司；TA.XT.Plus.質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)Stable Micro System公司；Anton Paar MCR302流變儀，奧地利安東帕有限公司；NM120-Analyst低場(chǎng)核磁共振儀，上海紐邁電子科技有限公司；DSC 8000型差示掃描熱量?jī)x，美國(guó)Perkin-Elmer公司；TM 3000掃描電子顯微鏡，日本日立公司；LABRAM 800型激光拉曼光譜儀，法國(guó)Jobin Yvon公司；U-3900紫外分光光度儀，日本日立公司；F-7000熒光光譜儀，日本日立公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 MP的提取 取冷凍雞胸肉在4℃下解凍20 min，剔除表面結(jié)締組織和脂肪，切碎后參考楊玉玲等[14]的方法在低溫下提取MP，4℃下保存并于3 d內(nèi)用完。蛋白質(zhì)濃度采用雙縮脲法進(jìn)行測(cè)定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白[15]。

1.3.2 山茶油-MP混合樣品溶液和凝膠的制備 取適量的山茶油加入MP中，用磷酸鹽緩沖液（10 mmol·L-1KH2PO4、0.6 mol·L-1KCI，pH 6.0）溶解為1 mg·mL-1的MP溶液，以14 500 r/min轉(zhuǎn)速下高速剪切均質(zhì)60 s后制得新鮮的乳化液。取適量乳化液加入MP溶液體系中，充分混合均勻后，得到溶膠體系，其中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為50 mg·mL-1，山茶油質(zhì)量濃度分別達(dá)到1%、2%、3%、4%、5%，同時(shí)做不加山茶油乳化液的空白對(duì)照組，此系列溶液用于流變特性的測(cè)定和DSC熱變性分析。取混合溶液樣品置于水浴鍋中，從20℃以1℃·min-1的速率加熱至65℃，65℃下保溫20 min后冷卻至室溫，隨后在4℃下保存8—10 h制備成凝膠，用于凝膠特性、微觀結(jié)構(gòu)和拉曼光譜的測(cè)定。將MP濃度為50 mg·mL-1的混合溶液樣品用磷酸鹽溶液稀釋至1 mg·mL-1，用于表面疏水性和總巰基含量的測(cè)定。

1.3.3 硬度的測(cè)定 MP凝膠樣品的硬度采用配置P/6探頭的質(zhì)構(gòu)儀在室溫下穿刺5 mm測(cè)定。測(cè)試條件為：測(cè)試速率：1 mm·s-1；感應(yīng)模式：自動(dòng)；感應(yīng)力：5 g。所有測(cè)試重復(fù)5次。

1.3.4 保水性的測(cè)定 凝膠樣品稱重后采用離心法測(cè)定其保水性（water holding capacity，WHC），在4℃、10 000×條件下離心10 min，除去離出液體。記錄離心后凝膠的重量占離心前凝膠重量的百分比，為其保水性。所有測(cè)試重復(fù)5次。

1.3.5 水分布特性的測(cè)定 取1 g MP樣品，采用核磁共振分析儀的CPMG序列進(jìn)行水分布特性的測(cè)定。測(cè)試參數(shù)設(shè)置如下：測(cè)試溫度，32℃；質(zhì)子共振頻率，19 MHz；采樣頻率，100 kHz；模擬增益，20.0 db；累加次數(shù)，4；90°脈寬，14 μs；180°脈寬，26 μs；回波次數(shù)，15 000；等待時(shí)間，3 000 ms；重復(fù)掃描次數(shù)，8；譜寬：200 kHz。每組樣品重復(fù)6次，取平均值。記錄束縛水弛豫時(shí)間相應(yīng)的峰面積比，以PT21表示。

1.3.6 流變特性的測(cè)定 取2 mL MP溶液樣品置于流變儀平板上，設(shè)定動(dòng)態(tài)流變條件[14]：直徑50 mm平行板，狹縫0.5 mm，應(yīng)變2%，頻率0.1 Hz。升溫速率1℃?min-1，升溫范圍20—80℃。儀器自動(dòng)記錄儲(chǔ)能模量（G'）隨溫度變化曲線。

1.3.7 微觀結(jié)構(gòu)的觀察 將凝膠樣品用2.5%的戊二醛固定后用磷酸鹽緩沖液清洗（0.1 mol·L-1KH2PO4，pH 7.0），不同梯度乙醇進(jìn)行脫水處理后冷凍干燥。對(duì)凍干樣品進(jìn)行噴金鍍膜處理后，使用掃描電鏡在1 500放大倍數(shù)下進(jìn)行觀察[16]。

1.3.8 拉曼光譜分析 凝膠樣品中MP的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量通過(guò)拉曼光譜儀測(cè)定，參考ZHANG等[17]的方法進(jìn)行參數(shù)設(shè)置，獲取的拉曼光譜范圍在400—2 000 cm-1。測(cè)試結(jié)果用各二級(jí)結(jié)構(gòu)占總二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的百分比表示。

1.3.9 表面疏水性測(cè)定 將MP凝膠樣品（1 mg·mL-1）分別稀釋至0.5、0.25和0.125 mg·mL-1，采用ANS熒光探針法[16]進(jìn)行測(cè)定。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白濃度作直線，其初始斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性指標(biāo)（S0-ANS）。

1.3.10 巰基含量測(cè)定 MP凝膠樣品總巰基含量的測(cè)定參考LIU等[18]的方法并稍作修改。MP樣品與總巰基試劑充分混勻后在40℃下靜置25 min。使用磷酸鹽緩沖液作為參考，于412 nm下測(cè)定樣品吸光值，摩爾消光系數(shù)為13 600 M-1·cm-1。

1.3.11 熱穩(wěn)定性的測(cè)定 利用差示掃描量熱法（DSC）測(cè)定MP樣品的變性情況。稱取20 mg MP樣品，準(zhǔn)確記錄每組樣品重量，置于不銹鋼鋁坩堝內(nèi)密封，用于DSC測(cè)試。以空坩堝作為空白對(duì)照，樣品以10℃?min-1的速率從20℃升溫至80℃。用Pyris-11軟件計(jì)算各變性峰的變性溫度（Td）和焓變（ΔH）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析，若方差分析效應(yīng)顯著則用鄧肯多范圍試驗(yàn)（Duncan multiple range test）進(jìn)行多重比較（＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 山茶油添加量對(duì)MP凝膠硬度、保水性、水分布特性和MP流變特性的影響

不同山茶油添加條件下的MP凝膠硬度、保水性、PT21和MP的儲(chǔ)能模量（G'）變化如圖1所示。隨著山茶油含量從1%增加到4%，MP凝膠的硬度逐漸增加，在4%時(shí)到最大值（116.60 g），隨后在5%時(shí)下降至114.33 g。凝膠保水性從92.92%（0）顯著上升至95.77%（4%）（＜0.05），隨后稍有降低至94.63%（5%）。凝膠體系中有不同種類的水分子，包括結(jié)合水、束縛水和自由水。束縛水反映位于凝膠結(jié)構(gòu)內(nèi)部的水，占水分分布比例最大且最為重要，因此本試驗(yàn)測(cè)定了束縛水在凝膠中的含量。T21代表束縛水的弛豫時(shí)間，PT21代表其峰面積比[19]。PT21隨著山茶油含量增加至4%時(shí)呈顯著性增加的趨勢(shì)（＜0.05），在4%時(shí)達(dá)到最大值（80.05%）。表明添加4%山茶油時(shí)凝膠的硬度和保水性最佳，束縛水占總水分比例最大，濃度過(guò)高反而會(huì)導(dǎo)致三者降低。

MP溶液加熱形成凝膠的過(guò)程中，山茶油含量對(duì)MP的G'影響顯著，在50—55℃范圍內(nèi)呈現(xiàn)第一個(gè)峰值，表明肌球蛋白重鏈逐漸發(fā)生變性[8]。當(dāng)繼續(xù)升高溫度至80℃，MP的G'值迅速增加，4%山茶油處理組的G'呈現(xiàn)最大值，這反映了凝膠彈性的增加。

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同

2.2 山茶油添加量對(duì)MP凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

如圖2所示，未添加山茶油的凝膠結(jié)構(gòu)疏松、無(wú)序、多孔且孔隙較大。與對(duì)照組相比，添加山茶油的MP混合凝膠呈現(xiàn)出更加均勻且致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。隨著山茶油濃度的增加（1%—4%），MP凝膠結(jié)構(gòu)中蜂窩狀網(wǎng)孔的孔徑逐漸降低，凝膠的絲狀物表面出現(xiàn)球形顆粒并逐漸增多，不規(guī)則的球狀或棒狀聚集塊充分展開，粗糙度逐漸降低，凝膠結(jié)構(gòu)變得平整且致密。添加4%山茶油的混合凝膠呈現(xiàn)均勻、細(xì)致的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。5%的山茶油濃度導(dǎo)致MP凝膠結(jié)構(gòu)遭到破壞，不夠均勻且有較多的脂肪顆粒附著在絲狀物表面，導(dǎo)致混合凝膠的保水性和硬度有所下降。

A—F分別表示山茶油含量為0、1%、2%、3%、4%、5%

2.3 山茶油添加量對(duì)MP二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

隨著山茶油濃度的增加（0—5%），其混合凝膠MP分子中的-螺旋含量由39.94%顯著降低至26.07%（＜0.05）。而-折疊結(jié)構(gòu)含量由22.04%顯著上升至27.40%（＜0.05）；-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量顯著增加（＜0.05），在5%山茶油含量時(shí)達(dá)最大值；而無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量從18.25%（0）逐漸上升至最大值21.39%（3%）后無(wú)顯著性變化（＞0.05）（表1）。-螺旋和-折疊結(jié)構(gòu)含量分別呈現(xiàn)增加和降低的趨勢(shì)，表明山茶油添加改變了MP分子結(jié)構(gòu)，由于蛋白-油脂和蛋白-蛋白側(cè)鏈之間的相互作用增強(qiáng)，導(dǎo)致-螺旋結(jié)構(gòu)逐漸展開，形成了更多的-折疊、-轉(zhuǎn)角或無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。

表1 山茶油添加對(duì)MP凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）。下同

Different letters (a-f) indicate significant difference (＜0.05).The same as below

2.4 山茶油添加量對(duì)MP三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成是在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，分子進(jìn)一步折疊成緊密的三維空間結(jié)構(gòu)[20]。MP分子的表面疏水性（S0-ANS）和二硫鍵（S-S）與巰基（SH）

之間的轉(zhuǎn)換可以表征蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[20-21]。

2.4.1 表面疏水性 如圖3所示，與未添加山茶油的MP凝膠相比，混合凝膠中MP的S0-ANS隨著山茶油的添加而呈顯著升高的趨勢(shì)（＜0.05），在4%時(shí)達(dá)到最大值771.71，隨后在5%時(shí)顯著降低至718.64（＜0.05）。這一變化趨勢(shì)與凝膠硬度和保水性（圖1）一致，表明蛋白-蛋白或蛋白-油脂的作用增強(qiáng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的疏水性微環(huán)境發(fā)生變化。而當(dāng)山茶油添加量達(dá)5%時(shí)，油脂顆粒的疏水性脂肪酸長(zhǎng)鏈雖然增多，但并未增強(qiáng)蛋白質(zhì)的表面疏水性，這可能是由于過(guò)量的油脂使蛋白質(zhì)中的疏水性基團(tuán)被覆蓋或包埋，并沒有導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步展開。

2.4.2 總巰基含量與二硫鍵 總巰基含量包括暴露在蛋白質(zhì)表面和包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的巰基，總巰基的減少通常反映了MP中二硫鍵的生成。山茶油的添加使凝膠中MP的總巰基含量明顯下降（＜0.05），4%時(shí)達(dá)最小值（圖3）。這反映在油脂的誘導(dǎo)下，MP的三級(jí)結(jié)構(gòu)不斷展開，內(nèi)部巰基暴露并生成了大量二硫鍵，從而穩(wěn)定了蛋白質(zhì)的三級(jí)空間結(jié)構(gòu)。當(dāng)山茶油濃度升高至5%時(shí)，總巰基含量有所增加，說(shuō)明加入過(guò)多的油脂對(duì)MP新結(jié)構(gòu)具有去穩(wěn)作用。

2.5 相關(guān)性分析

表2顯示了山茶油添加量、MP凝膠特性和結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性。山茶油添加量與硬度、保水性以及-折疊結(jié)構(gòu)含量呈顯著的正相關(guān)（＜0.05），與-螺旋結(jié)構(gòu)和總巰基含量呈極顯著的負(fù)相關(guān)（＜0.01），表明山茶油添加量顯著影響凝膠特性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與MP凝膠特性之間存在關(guān)聯(lián)，MP凝膠的硬度與-螺旋呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05），與-折疊呈顯著正相關(guān)（＜0.05）。MP在65℃下的

網(wǎng)絡(luò)課堂的教學(xué)模式可以使用家長(zhǎng)管理系統(tǒng)，即學(xué)生在觀看網(wǎng)絡(luò)視頻中不能操作其他界面，或是長(zhǎng)時(shí)間沒有對(duì)電腦進(jìn)行操作時(shí)，實(shí)施相應(yīng)的鎖屏辦法。要求學(xué)生必須通過(guò)完整的網(wǎng)絡(luò)課堂學(xué)習(xí)而取得相應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)教學(xué)學(xué)分。

圖3 山茶油添加對(duì)MP凝膠的表面疏水性和總巰基含量的影響

G'值與-螺旋呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）。表面疏水性與保水性、PT21呈極顯著正相關(guān)（＜0.01）?？値€基含量與凝膠硬度、保水性和65℃下的G'值呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01）。這一結(jié)果表明山茶油主要通過(guò)調(diào)控MP凝膠中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致凝膠特性發(fā)生顯著變化。

2.6 山茶油添加對(duì)MP變性溫度和變性熱焓的影響

如表3所示，MP樣品在不同山茶油添加量的處理下都顯示出兩個(gè)吸熱變性峰，即肌球蛋白（Td1）和肌動(dòng)蛋白（Td2）。山茶油的添加對(duì)MP樣品的肌球蛋白吸熱變性峰的起始溫度（TOnset）無(wú)顯著性的影響（＞0.05），而終止溫度（TEnd）略有下降。與未添加山茶油的對(duì)照組相比，添加山茶油后MP中肌球蛋白吸熱變性峰的TEnd值逐漸下降，但在2%—5%范圍內(nèi)無(wú)顯著性變化（＞0.05）。對(duì)照組中MP樣品肌球蛋白的變性峰熱焓值（△H）為0.183 J?g-1；添加山茶油后，MP樣品中肌球蛋白的△H顯著下降至0.143 J?g-1（5%）（＜0.05）。山茶油的添加對(duì)肌動(dòng)蛋白吸熱變性峰的TOnset有顯著性影響（＜0.05），從70.97℃（1%）逐漸降低至68.41℃（5%），而對(duì)TEnd和△H無(wú)顯著性影響（＞0.05）。

表2 山茶油添加量、MP凝膠特性和結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性

*表示顯著性相關(guān)（＜0.05），**表示極顯著性相關(guān)（＜0.01）

* indicate significant correlation (<0.05), ** indicate extremely significant correlation (<0.01)

表3 不同山茶油添加處理下MP樣品DSC特性的變化

Td1：肌球蛋白；Td2：肌動(dòng)蛋白；TOnset：起始溫度；TEnd：終止溫度；△H：熱焓值

Td1: Myosin; Td2: Actin;TOnset: The onset temperature; TEnd: The end temperature; △H: Enthalpy

3 討論

3.1 山茶油影響MP凝膠特性和微觀結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)凝膠的品質(zhì)可以通過(guò)硬度、保水性、水分布和流變特性等特性反映。本試驗(yàn)結(jié)果表明適量濃度山茶油（0—4%）的加入能夠顯著改善MP凝膠硬度（＜0.05），過(guò)量的山茶油導(dǎo)致凝膠硬度下降。WU等[8]研究發(fā)現(xiàn)加入預(yù)乳化的花生油（15%）顯著增強(qiáng)MP（2%）的凝膠硬度。適量添加亞麻籽油、菜籽油能夠增強(qiáng)肉類蛋白凝膠的硬度[22-23]。ZHOU等[24]研究發(fā)現(xiàn)添加雞脂顯著提高M(jìn)P在加熱過(guò)程中的G'值，在0.20%添加條件下蛋白質(zhì)膠凝過(guò)程中的粘彈性最佳。ZHOU等研究[10]發(fā)現(xiàn)添加一定量的豬油或山茶油均能使蛋白獲得更高的G'值，增強(qiáng)了凝膠性質(zhì)。

MP凝膠的保水性和PT21隨著山茶油濃度的增加逐漸升高，在4%時(shí)達(dá)到最大值后呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明MP中加入山茶油顯著影響其凝膠保水性和水分布特性。王莉莎等研究[25]表明添加一定量的玉米油、橄欖油、米糠油均能增加MP乳化復(fù)合凝膠的持水力。邵俊花[26]研究發(fā)現(xiàn)脂肪的添加增大了弛豫時(shí)間T21的峰面積比。這些變化趨勢(shì)與本試驗(yàn)結(jié)果相似，而含量差異可能是脂肪中的不飽和脂肪酸成分不同所致。

觀察MP凝膠的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)主要通過(guò)纖維網(wǎng)狀交聯(lián)，山茶油在預(yù)乳化階段經(jīng)高速剪切后形成小的油脂顆粒，并由鹽溶性的MP膜層包覆，作為填充物占據(jù)在蛋白質(zhì)空間網(wǎng)絡(luò)的空隙處，在熱誘導(dǎo)之后均勻地分散在凝膠基質(zhì)中[27]。山茶油-MP復(fù)合凝膠的結(jié)構(gòu)更加有序、細(xì)膩。添加4%山茶油的MP凝膠網(wǎng)絡(luò)中孔徑最小，粗糙度最低，呈現(xiàn)均勻、緊湊且致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。此時(shí)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)展開程度最大，分子的表面疏水性和二硫鍵交聯(lián)增強(qiáng)，分子有序結(jié)構(gòu)的適度展開使凝膠具有良好的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。因此，山茶油添加對(duì)MP凝膠的微觀結(jié)構(gòu)有顯著的調(diào)節(jié)作用，且與硬度和保水性的變化趨勢(shì)一致，這表明凝膠微觀結(jié)構(gòu)影響凝膠特性。當(dāng)山茶油含量進(jìn)一步增加至5%，凝膠結(jié)構(gòu)中網(wǎng)孔稍有增大且分布不均勻，多余的油脂無(wú)法被蛋白基質(zhì)穩(wěn)定地包埋在凝膠基質(zhì)中，以球狀顆粒附著在絲狀物表面。這是由于MP凝膠的表面疏水性和二硫鍵含量降低，蛋白質(zhì)分子間參與凝膠形成作用力的減弱對(duì)微觀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響。莊濤[5]報(bào)道在豬肉MP體系中加入橄欖油和花生油乳化液后，顆粒填充分布均勻，結(jié)構(gòu)變得致密且緊實(shí)。而由于油脂的黏稠度不同，橄欖油乳液的填充效果更好。ZHOU等[24]研究發(fā)現(xiàn)脂肪含量的增加（0.05%—0.20%）使凝膠的粗糙度下降并形成良好的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；而過(guò)多的脂肪添加則會(huì)增加凝膠的粗糙度，同時(shí)導(dǎo)致其質(zhì)構(gòu)特性下降。不同種類的油脂對(duì)凝膠結(jié)構(gòu)和特性的改善程度不同，XIONG等[28]將此現(xiàn)象歸結(jié)為油脂的理化性質(zhì)差異。

3.2 山茶油影響MP二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)分子的表面疏水性反映其三級(jí)結(jié)構(gòu)的展開程度和分子間的聚集能力。本研究中MP-山茶油混合凝膠的表面疏水性指標(biāo)S0-ANS隨著山茶油含量增加而逐漸上升，在4%時(shí)達(dá)到最大值后又降低。這表明隨著山茶油的添加，MP在溶液中形成疏水性的微環(huán)境逐漸增多，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子三級(jí)結(jié)構(gòu)充分展開和更多的內(nèi)部疏水性氨基酸殘基暴露。這些展開的疏水基團(tuán)有利于凝膠致密網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。當(dāng)山茶油添加到5%時(shí)，多余的油脂吸附在暴露的疏水性基團(tuán)表面，部分暴露的疏水基團(tuán)被油脂包埋，同時(shí)油脂和蛋白質(zhì)之間的疏水相互作用產(chǎn)生一定的空間位阻，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子三級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)法再深度展開，進(jìn)而影響凝膠的質(zhì)構(gòu)特性。MENG等[29]也發(fā)現(xiàn)添加礦物油或玉米油可以誘導(dǎo)MP內(nèi)部疏水基團(tuán)的暴露，增強(qiáng)其表面疏水性。HOWELL等[30]報(bào)道了玉米油的存在可以誘導(dǎo)溶菌酶的疏水基團(tuán)暴露。

通過(guò)測(cè)定總巰基含量能反映二硫鍵的變化。二硫鍵的形成對(duì)MP展開后形成新的三級(jí)結(jié)構(gòu)和其在加熱過(guò)程中的凝膠結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用。添加5%的山茶油導(dǎo)致總巰基含量增加，意味著二硫鍵的減少。這可能是山茶油和蛋白質(zhì)的聚集覆蓋了部分巰基，無(wú)法形成更多的二硫鍵。同時(shí)，過(guò)量的山茶油導(dǎo)致二硫鍵發(fā)生破裂，對(duì)蛋白質(zhì)展開重排后形成的新結(jié)構(gòu)具有去穩(wěn)作用。ZHOU等[24]發(fā)現(xiàn)MP溶液和凝膠中的總巰基含量隨雞脂肪含量的增加而顯著降低，促進(jìn)了蛋白質(zhì)凝膠形成牢固的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。二硫鍵參與了熱誘導(dǎo)乳化凝膠的形成，能夠維持脂肪顆粒的穩(wěn)定和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的交聯(lián)，防止凝膠形成過(guò)程中油脂的游離滲漏[31]，對(duì)維持良好的凝膠特性做出貢獻(xiàn)[25]。

3.3 山茶油添加引起MP凝膠特性變化的原因

一般認(rèn)為，MP熱誘導(dǎo)凝膠形成的過(guò)程是其在加熱的條件下發(fā)生變性，蛋白質(zhì)分子展開與重排的結(jié)果。因此，蛋白質(zhì)分子高級(jí)結(jié)構(gòu)變化是形成熱誘導(dǎo)凝膠的關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)，山茶油添加量與凝膠的硬度、保水性以及-折疊結(jié)構(gòu)含量呈顯著的正相關(guān)；蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)變化與凝膠特性也顯著相關(guān)。用DSC測(cè)定MP樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)，其肌球蛋白的熱變性峰分布在54—63℃，肌動(dòng)蛋白的熱變性峰集中在68—73℃。山茶油添加量在1%—5%的范圍內(nèi)對(duì)肌球蛋白變性峰的起始溫度沒有影響，但導(dǎo)致終止溫度和熱焓值（△H）顯著下降。這表明山茶油的添加與MP的主要成分肌球蛋白發(fā)生相互作用，引起MP分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，通過(guò)降低肌球蛋白的變性熱焓而使MP更容易變性。HE等[32]利用DSC法研究了高壓處理對(duì)花生分離蛋白熱變性溫度的影響。蔡路昀等[33]研究了不同提取方法對(duì)鰈魚骨膠原蛋白熱變性溫度的影響，而未涉及對(duì)△H的影響研究。

在熱誘導(dǎo)過(guò)程中，山茶油的添加使MP周圍的疏水性微環(huán)境發(fā)生變化，誘導(dǎo)分子三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步展開，內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基等基團(tuán)逐漸暴露，疏水殘基定向移動(dòng)到油滴表面會(huì)發(fā)生構(gòu)象重排；同時(shí)，蛋白質(zhì)分子間的二硫鍵發(fā)生聚集，相鄰的蛋白質(zhì)分子間的相互作用增強(qiáng)以及蛋白-油脂間緊密結(jié)合[34]，使山茶油能更穩(wěn)定地存在于凝膠基質(zhì)中，進(jìn)而改善MP凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。而良好致密的凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能更好地保留水分，并具有更強(qiáng)的抗壓能力。

綜上所述，添加山茶油改變MP的微環(huán)境，并與MP發(fā)生作用，使MP更易變性并導(dǎo)致其二級(jí)結(jié)構(gòu)展開以及三級(jí)結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而影響MP凝膠特性。不少學(xué)者的研究都發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)凝膠特性與其結(jié)構(gòu)有關(guān)。KANG等[35]發(fā)現(xiàn)-折疊的增加和-螺旋的降低是法蘭克福香腸的硬度和保水性增強(qiáng)的原因。BEATTIE[36]和LIU[37]等的研究結(jié)果表明蛋白質(zhì)在熱處理過(guò)程中，-螺旋結(jié)構(gòu)阻礙蛋白質(zhì)的凝膠化，而-折疊或無(wú)規(guī)卷曲則促進(jìn)了蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，增強(qiáng)了凝膠的質(zhì)構(gòu)特性和保水性。

4 結(jié)論

山茶油含量顯著影響MP凝膠特性和微觀結(jié)構(gòu)，凝膠硬度、保水性和PT21隨著山茶油添加而顯著增強(qiáng)，MP溶液加熱形成凝膠過(guò)程中的G'值逐漸升高。添加4%山茶油的MP具有最佳的凝膠特性和均勻細(xì)密的微觀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，此時(shí)MP和山茶油的比例為1﹕0.8。山茶油添加（0—4%）使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)?折疊、-轉(zhuǎn)角和無(wú)序卷曲，促進(jìn)MP分子三級(jí)結(jié)構(gòu)逐漸展開，分子內(nèi)疏水性基團(tuán)暴露，表面疏水性和二硫鍵交聯(lián)增加，使蛋白-蛋白與蛋白-油脂間相互作用增強(qiáng)，形成更加均勻穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，最大限度地保留凝膠空間中的水分。而當(dāng)過(guò)多的山茶油參與MP凝膠形成時(shí)，蛋白質(zhì)中的疏水性基團(tuán)被覆蓋或包埋，二硫鍵含量降低。凝膠基質(zhì)中多余油脂形成的空間阻礙作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子展開度降低，參與凝膠形成的作用力減弱而降低硬度、保水性和微觀結(jié)構(gòu)的均勻性。

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Effects of Camellia Oil on the Properties of Myofibrillar Protein Gel

HAN KeYing, FENG Xiao, YANG YuLing*, LI ShanShan, WEI SuMeng, CHEN YuMin

College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety/Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing, Nanjing 210023

【Objective】The effects of camellia oil addition on the properties and the relationship between the properties and structure of myofibrillar protein (MP) gel were studied.The purpose of the research was to provide a theoretical basis for the application of camellia oil in chicken products.【Method】The MP was extracted from chicken breast at 4℃.The MP heat-induced gels in different camellia oil addition were prepared.The changes of hardness, water holding capacity (WHC), moisture distribution of MP gel and rheological properties of MP were measured.Furthermore, the effects of camellia oil on the microstructure, secondary structure were determined by scanning electron microscopy (SEM) and Raman spectroscopy, respectively.Surface hydrophobicity and total sulfhydryl content were used to study the tertiary structure of MP in gels.Meanwhile, the differential scanning calorimetry (DSC) was applied to characterize the thermal properties of MP.Finally, the correlation between camellia oil addition, gel properties and MP structures were analyzed.【Result】After 4% camellia oil addition, the hardness, WHC and the area fraction of bound water (PT21) of MP gel increased and reached to maximum values of 116.60 g, 95.77% and 80.05%, respectively.However, those values decreased as camellia oil addition increased to 5%.For camellia oil content of 4%, the storage modulus (G') and elasticity of MP were the highest, while the surface roughness was the lowest.Meanwhile, MP gels showed more uniform, and compact network structure compared with other groups.It was also found that secondary structure of MP was significantly affected by camellia oil addition (0-5%).The-helix content decreased from 39.94% to 26.07%, and the-sheet content increased from 22.04% to 27.40% with increased camellia oil addition (<0.05).The content of-turn and random coil showed increasing trends.The S0-ANS of MP reached the highest value, and the total sulfhydryl content was the lowest after 4% camellia oil addition.The results showed that the addition of camellia oil promoted the exposure of hydrophobic amino acid residues in protein molecules and the formation of disulfide bond, and changed the tertiary structure of MP in gels.The enhanced aggregation and cross-linking between MP molecules were due to the higher-sheet content and hydrophobic interaction.The correlation analysis indicated that camellia oil addition was significantly correlated with the changes in the gel properties and protein structure (<0.05).The results of DSC showed that camellia oil could interact with MP and reduce the denaturation enthalpy of MP.【Conclusion】The camellia oil addition had a significant effect on the gel properties and structures of MP.The addition of camellia oil changed the microenvironment of MP and interacted with MP, which made the degeneration of MP easier.The secondary structure of MP was unfolded and the tertiary structure was affected after camellia oil addition, which improved the properties of MP gel.When camellia oil concentration was 4%, the properties and three-dimensional network structure of MP composite gel were the best.

camellia oil; myofibrillar protein; gel properties; structure

2021-02-22；

2021-04-13

國(guó)家自然科學(xué)基金（32001643，31371798）、江蘇省自然科學(xué)基金（SBK2020040148）

韓柯穎，E-mail：hankeying97@163.com。馮瀟，E-mail：fengxiao@nufe.edu.cn。韓柯穎和馮瀟為同等貢獻(xiàn)作者。通信000作者楊玉玲，E-mail：yulingy@sina.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）