雒向寧，王文娟，李 凱，尤建軍，張會波，劉 凱，杜宏宏，王 冬

前列腺癌是最常見的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，多見于60歲以上的老年男性。近10年以來，我國的前列腺癌發(fā)病率也呈逐年上升趨勢，與發(fā)達國家比較，我國患者的初診晚期前列腺癌發(fā)病率更高[1]，無法進行根治性手術治療。絕大多數(shù)晚期前列腺癌患者起初對抑制雄激素的藥物治療敏感。然而，經抑制雄激素的內分泌治療平均2.5年后，上述患者均將轉化為激素抵抗性前列腺癌（hormone refractory prostatecancer，HRPC），即對抑制雄激素的內分泌治療無反應。HRPC病情進展迅速，生存期一般不超過18個月，但其發(fā)生機制至今仍未闡明，因此，探索HRPC的發(fā)生和進展機制并研發(fā)有效的治療藥物成為近年的研究熱點?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）現(xiàn)已被證實參與多種腫瘤的浸潤、侵襲和遠處轉移過程。目前已有26種不同的MMPs成員被發(fā)現(xiàn)，其中MMP-9能夠降解和破壞腫瘤細胞外基質，促進侵襲性偽足形成[2]。去甲斑蝥素（norcantharidin, NCTD）是從斑蝥蟲體內提取的斑蝥素的去甲基化類似物[3]。NCTD具有較強的抗癌活性，目前已應用于多種惡性腫瘤的臨床治療。本實驗重在研究NCTD能否下調前列腺癌PC-3細胞MMP-9蛋白表達，進而抑制PC-3細胞的侵襲力。

1 材料與方法

1.1 細胞株 前列腺癌PC-3細胞株購自上海細胞所國家細胞庫。

1.2 主要試劑 NCTD（美國Aladdin公司，批號D131603-1g），順鉑（美國MCE公司，批號HY-17394），胞漿胞核蛋白提取試劑盒（南京凱基生物公司，批號KGP150），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物科技公司，批號P0010），小鼠單抗β-actin（武漢博士德生物工程有限公司，批號BM0627），鼠單抗MMP-9(美國abcam公司，批號Ab58803)，transwell培養(yǎng)皿（美國Corning公司，批號 658042）。

1.3 主要儀器 實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司），CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司），3001酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.4 細胞培養(yǎng) PC-3細胞用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸，并置于37℃、 5% CO2細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的PC-3細胞，加入預先配制不同濃度的含NCTD培養(yǎng)液，使NCTD最終濃度分別為12.5 μg/mL、25 μg/mL 和50 μg/mL，同時設立空白對照組和陽性對照組（順鉑濃度2.5 μmol/L）。

1.5 實時熒光定量PCR實驗 Trizol試劑分別提取各組PC-3細胞的總RNA，然后按照Real-time PCR試劑盒的操作說明進行。PCR引物由西安科昊生物工程有限責任公司合成，MMP-9的上游引物序列為5’- GCTACCACCTCGAACTTTGAC-3’，下游引物序列為5’- TCAGTGAAGCGGTAC ATAGGG -3’，內參照β-actin的上游引物序列為5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’，下 游 引物序列為 5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’。PCR反應條件：50℃ 2 min、95℃ 10 min；95℃ 30 sec、60℃ 30 sec，40個循環(huán)。實驗中每個樣品重復檢測3次，繪制熔解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進行分析。

1.6 Western-blot實驗 取各組PC-3細胞，加入裂解液并在冰上放置30 min，4℃，12 000 r/min離心5 min，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定上清蛋白含量。 取40 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉膜，質量分數(shù)5%脫脂奶粉封閉，加入一抗鼠單抗MMP-9后4℃過夜，以β-actin小鼠單抗為參照，再加入二抗HRP-標記羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h。ECL曝光成像，化學發(fā)光系統(tǒng)分析結果。

1.7 細胞劃痕實驗 分別取空白對照組、12.5 μg/mL NCTD組、25 μg/mL NCTD組、50 μg/mL NCTD組、順鉑 2.5 μmol/L組PC-3細胞，用1640培養(yǎng)基調整細胞密度到2.5×105個/mL，置入6孔板，每孔2 mL細胞懸液，37 ℃培養(yǎng)過夜；6孔板中每孔預先在背后，用200 μL的槍頭垂直于背后的橫線劃痕，過夜培養(yǎng)后，用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基，處理24 h后，取樣拍照。

1.8 Transwell實驗 分別取空白對照組、12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL NCTD 組、順鉑2.5 μmol/L陽性對照組中2.5×105個PC-3細胞，Transwell小室的上室底部中央垂直加入100 μL終濃度為1 mg/mL的Matrigel，37℃溫育4～5 h使其干成膠狀，待Matrigel干成膠狀后，在Transwell上室分別接入200 μL上述各組細胞懸液，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，70%冰乙醇溶液固定細胞1 h，0.5%結晶紫染液染色，用PBS清洗1次，用干凈的棉球將上室一側的未遷移的細胞擦干凈，顯微鏡下觀察拍照。

1.9 透射電鏡觀察 取空白對照組、12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL NCTD 組、順鉑 2.5 μmol/L陽性對照組的PC-3細胞懸液10 μL，使用1×PBS 50倍稀釋后，10 μL滴加至銅網，25℃干燥12 h，Uranyl acetate復染，透射電鏡下觀察偽足形態(tài)并拍照保存。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以表示，兩組獨立樣本間差異比較采用t檢驗，多因素比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 實時熒光定量PCR檢測各組PC-3細胞MMP-9 mRNA含量 結果顯示，濃度為12.5 μg/mL、25 μg/mL和50 μg/mL NCTD作用各組PC-3細胞48 h后，MMP-9 mRNA含量分別比空白對照組下降了 13%、39%和58%（P<0.05），且 50 μg/mL NCTD濃度組較順鉑陽性對照組的MMP-9 mRNA含量下降45%（P<0.05）。見圖1。

圖1 NCTD作用PC-3細胞后MMP-9 mRNA的含量

2.2 Western-blot檢測各組PC-3細胞MMP-9含量 結果顯示，NCTD 濃度 12.5 μg/mL、25 μg/mL和50 μg/mL組的MMP-9表達水平均低于空白對照組，且隨著NCTD濃度增大、MMP-9蛋白表達水平均依次降低，其中50 μg/mL NCTD組MMP-9蛋白表達水平較空白對照組顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖2。

圖2 NCTD作用PC-3 細胞MMP-9蛋白表達電泳圖

2.3 NCTD對前列腺癌PC-3細胞的遷移和侵襲力的影響 細胞劃痕實驗結果顯示，NCTD各濃度組劃痕愈合面積與空白對照組相比減少，見圖3。同時 Transwel小室法檢測結果也發(fā)現(xiàn)，12.5 μg/mL、25 μg/mL和50 μg/mL NCTD組的侵襲細胞數(shù)分別為 (66.4±12.4)個、（53.4±8.1）個、（31.6±4.6）個，均較空白對照組侵襲細胞數(shù)（84.2±7.3）個明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖4。

圖3 NCTD對PC-3細胞遷移能力的影響(倒置顯微鏡，×100)

圖4 NCTD對PC-3細胞侵襲能力的影響( 結晶紫，×200)

2.4 透射電鏡觀察結果 正常培養(yǎng)的PC-3細胞直徑4 μm左右，細胞核大，核仁明顯，細胞表面可見較多偽足樣突起。與12.5μg/mL、25μg/mL、50 μg/mL NCTD共培養(yǎng)24 h后，PC-3細胞表面?zhèn)巫銟油黄鸾Y構數(shù)量減少，隨著NCTD濃度增加，偽足數(shù)呈明顯遞減趨勢。見圖5。

圖5 NCTD對PC-3細胞偽足形態(tài)的影響（透射電鏡，加速電壓200kV,×5000）

3 討論

侵襲和轉移是惡性腫瘤的主要生物學特征，惡性腫瘤細胞浸潤外周細胞內皮和基底膜，產生轉移擴散[4]。細胞外基質包括基底膜和細胞間基質，分布在細胞表面或細胞間隙，是惡性腫瘤細胞局部浸潤擴散的重要屏障。惡性腫瘤細胞局部浸潤和侵襲的首要條件是降解細胞外基質，膠原蛋白是細胞外基質的基本骨架成分。MMP-9是降解細胞外基質重要的明膠酶[5]，主要參與侵襲性偽足形成并促進體內細胞外基質的降解。近年研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9 mRNA在前列腺癌組織中的表達顯著高于良性前列腺組織，侵襲轉移的前列腺癌組織MM-9 mRNA表達量顯著高于非侵襲轉移者，MMP-9過表達的前列腺癌患者預后差[6-7]。另有研究顯示，下調MMP-9基因表達，能夠抑制人前列腺癌PC-3細胞的侵襲及增殖，提示MMP-9可能在前列腺癌的侵襲轉移中發(fā)揮重要作用[8]。

NCTD是由我國最先合成的唯一具有升高白細胞作用的新型抗腫瘤藥物。NCTD作用細胞后可能導致線粒體膜電位改變和線粒體功能障礙，細胞內活性氧積累過多，最終導致DNA損傷并消耗 ATP，從而激活凋亡通路[9]。NCTD可能通過下調 ERK1 /2 信號途徑來抑制腫瘤細胞增殖[10]。NCTD可抑制人黑素瘤M14細胞的遷移，其機制可能與下調MMP-9有關[11]。NCTD可能通過抑制miR-182-5p阻滯LKB1/AMPK信號通路和EMT發(fā)生抑制卵巢癌細胞增殖和侵襲[12]。NCTD可能通過提高TET1的表達量激活細胞內主動去甲基化，抑制腫瘤細胞的增殖和遷移[13]。有實驗證實，NCTD能夠顯著抑制體外培養(yǎng)的皮膚鱗狀細胞癌A431細胞的體外黏附、侵襲和遷移能力，其機制可能與其能下調內皮血管生長因子和基質金屬蛋白酶-2蛋白表達水平相關[14]。NCTD用于治療前列腺癌的研究較少，國內學者近期臨床研究發(fā)現(xiàn)[15]，NCTD聯(lián)合紫杉醇治療HRPC患者，效果明顯優(yōu)于單用紫杉醇，并可能會減少紫杉醇造成的不良反應。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[16]，NCTD能夠誘導前列腺癌PC-3細胞的凋亡并干擾PC-3細胞的有絲分裂，進而對PC-3細胞增殖產生抑制作用。

本實驗用不同濃度的NCTD作用PC-3細胞后，采用實時熒光定量PCR檢測MMP-9 mRNA含量、Western-blot檢測MMP-9蛋白表達量，結果發(fā)現(xiàn)NCTD各濃度組的PC-3細胞MMP-9 mRNA含量和蛋白表達量均較空白對照組減少。同時，PC-3細胞MMP-9 mRNA含量和MMP-9蛋白表達量隨NCTD濃度增加呈逐漸減少趨勢，存在劑量-效應關系。本次劃痕實驗和Transwell實驗結果均提示NCTD能夠降低PC-3細胞的外周遷移和侵襲力，并且NCTD濃度與PC-3細胞的侵襲力強弱之間存在劑量-效應關系。最后，本實驗采用透射電鏡觀察的方法，對不同濃度NCTD作用后的PC-3細胞進行超微形態(tài)觀察，與空白對照組相比，NCTD組PC-3細胞表面?zhèn)巫銛?shù)量減少，隨著NCTD濃度增加，偽足數(shù)量程明顯遞減趨勢。提示NCTD可減少PC-3細胞表面?zhèn)巫愕男纬伞?/p>

NCTD能夠降低PC-3細胞的外周遷移和侵襲力，其機制可能與NCTD下調PC-3細胞MMP-9 mRNA含量和蛋白表達，減少PC-3細胞表面?zhèn)巫阌嘘P。